分枝桿菌分離培養(yǎng)和藥敏試驗

分枝桿菌分離培養(yǎng)、藥敏試驗及菌種鑒定方法標(biāo)準化河南CDC結(jié)核病預(yù)防控制所趙玉玲2006年4月耐藥菌株尤其是耐多藥菌株的不斷擴散，正日益成為我國結(jié)核病控制的一大難題，若耐藥結(jié)核菌的播散和流行得不到有效遏止，將會出現(xiàn)較多慢性傳染源，從而導(dǎo)致結(jié)核病治療、管理的難度進一步加大，對國家結(jié)核病防治規(guī)劃的有效實施將構(gòu)成威脅。因此，監(jiān)測結(jié)核病耐藥性情況可以為制定、評價和完善國家結(jié)核病防治規(guī)劃（NTP）提供參考依據(jù)。我國2000年全國流調(diào)結(jié)核菌耐藥狀況

初始耐藥：18.6%獲得性耐藥：46.5%總耐藥：27.8%我國2000年全國流調(diào)結(jié)核菌耐藥狀況初始耐多藥率：7.6%獲得性耐多藥率：17.1%總耐多藥率：10.7%6種抗結(jié)核藥物的耐藥率順序異煙肼（17.6%）鏈霉素（17.3%）利福平（16.6%）對氨基水楊酸（2.8%）乙胺丁醇（1.5%）氨硫尿（1.3%)8?。ù危┠退幈O(jiān)測耐藥狀況

省份耐藥率（%）新病人復(fù)治病人總河南（1996）35.066.040.5河南（2001）29.860.835.5內(nèi)蒙35.765.344.8遼寧42.155.843.3山東17.650.024.5湖北17.544.523.3浙江14.859.321.9廣東13.038.115.58?。ù危┠退幈O(jiān)測耐藥狀況省份耐多藥率（%）新病人復(fù)治病人總河南（1996）10.834.415.1河南（2001）7.836.612.9內(nèi)蒙7.036.816.1遼寧10.424.211.7山東2.919.56.4湖北2.121.86.4浙江4.535.09.4廣東2.817.54.38?。ù危┠退幈O(jiān)測耐藥狀況省份利福平耐藥率（%）新病人復(fù)治病人總河南（1996）14.643.519.7河南（2001）9.642.615.3內(nèi)蒙9.851.021.2遼寧11.429.113.1山東3.823.27.9湖北3.826.98.8浙江6.545.012.6廣東3.522.25.3分枝桿菌種類分枝桿菌(Mycobaterium)迄今報道有100多個種?！恫芟到y(tǒng)細菌學(xué)手冊》將分枝桿菌軍菌種劃分為兩大類：緩慢生長分枝桿菌與快速生長分枝桿菌。在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，接種很稀的新鮮培養(yǎng)物，在適宜的培養(yǎng)溫度下，7天以上肉眼可見單個菌落，稱為緩慢生長分枝桿菌，其代表菌種是結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis).在上述條件下，7天以內(nèi)肉眼可見單個菌落，成為快速生長分枝桿菌。分枝桿菌種類分枝桿菌屬，除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌）及麻風(fēng)分枝桿菌外，余者統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌（NontuberculosisMycobacteria,NTM）結(jié)核分枝桿菌是引起人類結(jié)核病的主要病原菌，此外，牛分枝桿菌除引起牛結(jié)核病外，少數(shù)人類結(jié)核病也由其引起。非洲分枝桿菌致病力較弱，是熱帶非洲人結(jié)核病病原體。田鼠分枝桿菌對人類無致病性。分枝桿菌種種類類別Rubyun分群對人致病的的分枝桿菌菌緩結(jié)核分枝桿桿菌復(fù)合群群人型、牛型型、非洲型型慢非結(jié)核分枝枝桿菌Ⅰ群堪堪薩薩斯、海、、猿生非結(jié)核分枝枝桿菌Ⅱ群瘰瘰癘癘長非結(jié)核分枝枝桿菌Ⅲ群鳥鳥-胞內(nèi)、蟾蟾快速生長非結(jié)核分枝枝桿菌Ⅳ群偶偶發(fā)發(fā)、龜營養(yǎng)與發(fā)育育結(jié)核菌是兼兼性需氧菌菌，在有氧氧和含有比比較低氧的的環(huán)境下均均能生存，，比如骨結(jié)結(jié)核，淋巴巴結(jié)核。在少量二氧氧化碳的環(huán)環(huán)境中生長長的也很好好。結(jié)核菌生長長的適宜溫溫度和人體體相近為37℃。結(jié)核菌生長長所必須的的元素有氧氧、碳、氮氮、氫、磷磷、鉀、鎂鎂等。結(jié)核分枝桿桿菌的生長長特性生長適宜溫溫度37℃℃，PH6.8~7.2，對營養(yǎng)要求求較高專嗜嗜甘油作為為碳源，天天門冬酰胺胺是最好氮氮源。在常常用的羅氏氏培養(yǎng)基上上生長的菌菌落粗糙、、凸起、致致密，有表表面皺折，，呈顆粒、、結(jié)節(jié)或菜菜花樣，乳乳白色或米米色，不透透明。結(jié)核菌生長長緩慢，在在一般培養(yǎng)養(yǎng)基上分裂裂一代需要要10~18小時，，根據(jù)接種種量的多少少，一般10~30天肉眼可可見菌落生生長。耐藥性是結(jié)結(jié)核桿菌的的重要生物物學(xué)特性耐藥菌不斷斷生長繁殖殖，終致菌菌群中以耐耐藥菌為主主（敏感菌菌被藥物淘淘汰），抗抗結(jié)核藥物物即失效。。由基因突變變而出現(xiàn)的的極少量天天然耐藥菌菌（自然變變異），通通常不致引引起嚴重后后果。藥物與結(jié)核核桿菌接觸觸后，有的的細菌發(fā)生生誘導(dǎo)變異異，逐漸能能適應(yīng)在含含藥環(huán)境中中繼續(xù)生存存（繼發(fā)耐耐藥）。耐異煙肼菌菌株的致病病力顯著減減弱，耐鏈鏈霉素菌株株的致病力力一般不降降低，耐利利福平菌株株有不同程程度降低，，對利福平平及異煙肼肼同時耐藥藥，其致病病力降低較較單一耐異異煙肼者更更顯著。實驗室檢驗驗技術(shù)涂片染色鏡鏡檢分枝桿菌分分離培養(yǎng)分枝桿菌藥藥物敏感試試驗分枝桿菌菌菌種鑒定血清學(xué)檢測測分子生物學(xué)學(xué)結(jié)核病細菌菌學(xué)實驗室室布局原則則結(jié)核病細菌菌學(xué)檢查要要有獨立的的實驗室，，不得與其其他實驗室室混用。培養(yǎng)基制備備、洗刷等等相對潔凈凈的操作與與涂片鏡檢檢、培養(yǎng)前前處理、藥藥敏試驗等等污染操作作要有獨立立分開的場場所，最好好分別在專專用的房間間進行。分枝桿菌分分離培養(yǎng)檢檢查法的重重要意義(1)不論從結(jié)核核病控制、、流行病學(xué)學(xué)檢查或臨臨床診斷的的角度看，，分枝桿菌菌的分離培培養(yǎng)檢查法法都是結(jié)核核病確診最最可靠的方方法，是結(jié)結(jié)核病病原原學(xué)診斷的的“金標(biāo)準準”。分枝桿菌分分離培養(yǎng)檢檢查法的重重要意義(2)開展進一步步檢測的基基礎(chǔ)，是是獲得純培培養(yǎng)物進行行菌種鑒定定、藥物敏敏感性試驗驗以及其他他生物學(xué)研研究的基礎(chǔ)礎(chǔ)。(3)隨著結(jié)核病病控制工作作水平的提提高，一些些具備條件件的基層結(jié)結(jié)核病細菌菌學(xué)實驗室室也應(yīng)逐步步開展分枝枝桿菌的分分離培養(yǎng).酸性改良羅羅氏培養(yǎng)基基成分和制備備方法略。。去污染處理理(痰標(biāo)本本)視標(biāo)本性狀狀，加1~2倍體積積4%氫氧氧化鈉（NaOH)消化液于于痰瓶中，，擰緊螺旋旋蓋，渦旋旋震蕩器上上震蕩1min，使使痰液充分分勻化，室室溫放置。。自加入氫氫氧化鈉消消化液起，，整個處理理時間應(yīng)在在15~20min。標(biāo)本較較多時，應(yīng)應(yīng)分批處理理病理理組組織織或或干干酪酪塊塊標(biāo)本本切切碎碎后后置置于于無無菌菌組組織織研研磨磨器器，，加加入入適適量量（（0.5~1ml））生理理鹽鹽水水后后充充分分研研磨磨成成混混懸懸液液；；混混懸懸液液經(jīng)經(jīng)3000r/min離心心30min后，，沉沉淀淀物物進進行行堿堿處處理理[與與2~4倍倍量量2%氫氫氧氧化化鈉鈉（（NaOH)混合合，，處處理理15min]后接接種種。。尿液液留全全量量夜夜尿尿，，靜靜置置4~5h,取沉沉淀淀部部分分約約10ml,3000r/min離心心30min,取沉沉淀淀進進行行堿堿處處理理[與與等等倍倍量量4%硫硫酸酸（（H2SO4）混合合,處處理理15min]后接接種種.去污污染染處處理理(其其他他標(biāo)標(biāo)本本)去污污染染處處理理(其其他他標(biāo)標(biāo)本本)膿液液采用用4%硫硫酸酸（（H2SO4）以1︰︰3混混勻勻后后，，靜靜置置25min（（期間間震震蕩蕩數(shù)數(shù)次次)，，按按無無菌菌手手續(xù)續(xù)接接種種0.1ml經(jīng)處處理理的的標(biāo)標(biāo)本本至至L-J培養(yǎng)養(yǎng)基基，，每每份份標(biāo)標(biāo)本本接接種種2支支培培養(yǎng)養(yǎng)基基。。酸酸處處理理去去污污染染時時間間不不超超過過25min。。胸腹腹水水,支支氣氣管管灌灌洗洗液液標(biāo)標(biāo)本本參照照痰痰標(biāo)標(biāo)本本處處理理辦辦法法.去污污染染處處理理(其其他他標(biāo)標(biāo)本本)腦脊脊液液無菌菌操操作作收收集集的的腦腦脊脊液液,置置冰冰箱箱或或室室溫溫24h,待薄薄膜膜形形成成后后將將薄薄膜膜接接種種到到L-J培養(yǎng)養(yǎng)基基;或或?qū)⒛X腦脊脊液液在在無無菌菌操操作作環(huán)環(huán)境境中中3000r/min離心心30min,取沉沉淀淀直直接接接接種種到到L-J培養(yǎng)養(yǎng)基基.非非無無菌菌操操作作采采集集的的腦腦脊脊液液標(biāo)標(biāo)本本,離離心心后后的的沉沉淀淀進進行行堿堿處處理理[與與等等倍倍量量4%氫氫氧氧化化鈉鈉（（NaOH)混合合,處處理理10~15min]后接接種種于于酸酸性性L-J培養(yǎng)養(yǎng)基基去污污染染處處理理（（其其他他標(biāo)標(biāo)本本））糞便便標(biāo)本本與與生生理理鹽鹽水水混混合合后后,充充分分振振蕩蕩使使之之成成為為混混懸懸液液;定定性性濾濾紙紙過過濾濾后后,濾濾液液經(jīng)經(jīng)3000r/min離心10min;沉淀進行行酸處理理[與2~4倍倍量的4%硫酸酸（H2SO4）]混合,處處理15~20min)后接種L-J培養(yǎng)基.咽喉棉拭拭子將棉拭子子放入一一無菌試試管,加加入適量量生理鹽鹽水浸泡泡,加入入等體積積4%氫氧化化鈉（NaOH)后強烈振振蕩,靜靜置15min后接種.分離培養(yǎng)養(yǎng)的操作作流程痰標(biāo)本中中、加1~2倍倍體積4%NaOH渦旋振蕩蕩1~2min室溫靜置置15min分別接種種0.1ml前處理液液至2支支培養(yǎng)基斜斜面置37℃℃溫箱箱培養(yǎng)接種后3天,7天觀察,此此后每周周觀察一次次有菌落生生長需經(jīng)經(jīng)抗酸染色色確認,至第8周周無菌落落生長報告告陰性簡易培養(yǎng)養(yǎng)程序簡易培養(yǎng)養(yǎng)程序離心培養(yǎng)養(yǎng)程序離心培養(yǎng)養(yǎng)程序離心力對對痰涂片片和培養(yǎng)養(yǎng)結(jié)果的的影響離心力（xg）涂片陽性（+）培養(yǎng)陽性（+）涂片陽性/培養(yǎng)陽性比率12601.87.10.2530004.511.20.4038009.611.60.83結(jié)果報告告1.接種種后第3、7天天各觀察察1次菌菌落生長長情況。。發(fā)現(xiàn)菌菌落生長長者，經(jīng)經(jīng)抗酸染染色證實實后，可可報告快快速生長長分枝桿桿菌陽性性。此后后每周觀觀察1次次，記錄錄菌落生生長及污污染情況況。陽性性生長物物經(jīng)抗酸酸染色證證實后，，可報告告分枝桿桿菌生長長。滿8周后未未見菌落落生長者者方可報報告培養(yǎng)養(yǎng)陰性結(jié)結(jié)果。結(jié)果報告告2.觀察察時發(fā)現(xiàn)現(xiàn)非結(jié)核核分枝桿桿菌生長長時，應(yīng)應(yīng)報告污污染。培培養(yǎng)污染染率應(yīng)控控制在2%~5%范圍圍。污染染率過高高，提示示培養(yǎng)基基滅菌不不佳，標(biāo)標(biāo)本前處處理、接接種等環(huán)環(huán)節(jié)有誤誤，應(yīng)當(dāng)當(dāng)分析原原因，采采取相應(yīng)應(yīng)措施。。結(jié)果報告告培養(yǎng)結(jié)果果報告方方式(1)分分枝桿菌菌培養(yǎng)陰陰性:斜斜面無菌菌落生長長,以““培養(yǎng)陰陰性”報報告,不不可以““–”表示.(2)分分枝桿菌菌培養(yǎng)陽陽性（１１＋）：：菌落生生長占斜斜面面積積的1/4．(3)分分枝桿菌菌培養(yǎng)陽陽性（2＋）：：菌落生生長占斜斜面面積積的1/2．(4)分分枝桿菌菌培養(yǎng)陽陽性（3＋）：：菌落生生長占斜斜面面積積的3/4．(5)分分枝桿菌菌培養(yǎng)陽陽性（4＋）：：菌落生生長布滿滿整個斜斜面(6)報報實際菌菌落數(shù):菌落生生長不足足斜面面面積1/4．分離培養(yǎng)養(yǎng)的注意意事項選擇痰標(biāo)標(biāo)本中膿膿性、血血樣、干干酪樣的的部分進進行培養(yǎng)養(yǎng)陽性率率較高。。從加入前前處理液液到接種種的時間間不得多多于20分鐘.渦旋振蕩蕩、離心心、傾倒倒上清液液、接種種時容易易產(chǎn)生氣氣溶膠，，應(yīng)注意意使用安安全儀器器，正確確操作。。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)養(yǎng)基上菌菌落生長長需經(jīng)抗抗酸染色色確認后后方可報報告陽性性。分離培養(yǎng)養(yǎng)的優(yōu)點點敏感性較較直接涂涂片法高高，理論論上10~100條菌菌/毫升升可檢出出陽性；；特異性較較直接涂涂片法高高，可以以從菌落落生長速速度，色色素產(chǎn)生生初步判判斷非結(jié)結(jié)核分枝枝桿菌；；分離出具具有活力力的純培培養(yǎng)物，，為進一一步試驗驗提供基基礎(chǔ)。分離培養(yǎng)養(yǎng)的缺點點需時長，，根據(jù)接接種量的的大小，，一般2~8周周才能得得到肉眼眼可見菌菌落。結(jié)果受標(biāo)標(biāo)本保存存運送時時間，培培養(yǎng)基成成分和質(zhì)質(zhì)量，前前處理方方法等影影響，操操作較直直接涂片片法復(fù)雜雜，需經(jīng)經(jīng)嚴格培培訓(xùn)。需培養(yǎng)基基凝固滅滅菌器，，離心機機，渦旋旋振蕩器器，恒溫溫培養(yǎng)箱箱等設(shè)備備。成本是直直接涂片片法的7~8倍倍。分枝桿菌菌快速培培養(yǎng)檢查查分枝桿菌菌快速培培養(yǎng)檢查查是使用用分枝桿桿菌快速速培養(yǎng)分分枝桿菌菌儀，通通過測定定細菌生生長代謝謝而間接接檢測分分枝桿菌菌生長情情況的方方法。由由于應(yīng)用用營養(yǎng)豐豐富的液液體培養(yǎng)養(yǎng)基，并并且檢測測儀能連連續(xù)檢測測，故提提高了從從標(biāo)本中中分離分分枝桿菌菌的敏感感性進而而縮短報報告結(jié)果果的時間間。為保保證檢查查方法的的可靠性性，目前前快速培培養(yǎng)檢查查系統(tǒng)除除提供相相應(yīng)儀器器，試劑劑以外，，均根據(jù)據(jù)不同系系統(tǒng)制定定了相應(yīng)應(yīng)的臨床床標(biāo)本前前處理、、接種、、檢測和和報告結(jié)結(jié)果的規(guī)規(guī)程,故故在進行行相應(yīng)的的檢查時時，結(jié)果果的可重重復(fù)性和和可比性性均能得得到認可可。分枝桿菌菌快速培培養(yǎng)檢查查在進行分分枝桿菌菌快速培培養(yǎng)檢查查時，標(biāo)標(biāo)本接種種前的去去污染處處理，必必須嚴格格按照系系統(tǒng)說明明書中規(guī)規(guī)定的方方法進行行。孵育育檢測過過程中系系統(tǒng)報告告陽性時時，相應(yīng)應(yīng)標(biāo)本的的培養(yǎng)液液必須首首先進行行抗酸染染色鏡檢檢，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)抗酸桿桿菌后方方可發(fā)出出陽性報報告。幾種常見見分枝桿桿菌快速速培養(yǎng)儀儀Bectec-TB640全自動分分枝桿菌菌培養(yǎng)儀儀在營養(yǎng)養(yǎng)豐富的的培養(yǎng)液液中加入入放射性性14C標(biāo)記的棕棕閭酸作作為底物物，分枝枝桿菌生生長過程程中分解解14C棕閭酸，，產(chǎn)生CO2，儀器通過過檢測CO2含量換算算成生長長指數(shù)。。培養(yǎng)時時間通常常需要4~25天。優(yōu)點：簡簡便、快快速，可可進行藥藥敏試驗驗及初步步菌種鑒鑒定。缺點：價價格昂貴貴，需進進口專利利液體培培養(yǎng)基，，且有放放射性污污染，正正逐漸被被非放射射性的培培養(yǎng)方法法所替代代。幾種常常見分分枝桿桿菌快快速培培養(yǎng)儀儀Bectec-tb960全自動動快速速細菌菌培養(yǎng)養(yǎng)系統(tǒng)統(tǒng)是將將熒光光物質(zhì)質(zhì)包埋埋在7H9液體培培養(yǎng)管管的底底部，，分枝枝桿菌菌生長長過程程中，，O被消耗耗，底底物產(chǎn)產(chǎn)生熒熒光，，儀器器通過過測定定熒光光強度度，用用生長長指數(shù)數(shù)來表表示測測定結(jié)結(jié)果，，培養(yǎng)養(yǎng)時間間通常常需要要7~42天。。特點：：簡便便、快快速，，可進進行藥藥敏試試驗及及初步步菌種種鑒定定。連連續(xù)測測定熒熒光強強度，，每60分分鐘自自動測測一次次，無無放射射性污污染。。幾種常常見分分枝桿桿菌快快速培培養(yǎng)儀儀Bect/alert3D全自動動快速速細菌菌培養(yǎng)養(yǎng)儀，，分枝枝桿菌菌生長長過程程中代代謝產(chǎn)產(chǎn)生CO2，CO2的產(chǎn)生生使瓶瓶底顏顏色感感受器器產(chǎn)生生不同同的顏顏色變變化。。通過過比色色傳感感器來來測定定，CO2產(chǎn)生的的速率率和總總量與與細菌菌生長長的速速率和和總量量一致致。簡便、、快速速，可可進行行藥敏敏試驗驗及初初步菌菌種鑒鑒定。。既能能進行行分枝枝桿菌菌培養(yǎng)養(yǎng)，又又能進進行普普通菌菌培養(yǎng)養(yǎng)，每每10分鐘鐘自動動測一一次，，無放放射性性污染染。藥物敏敏感性性測定定的重重要意意義臨床治治療的的重要要參考考流行病病學(xué)的的重要要指標(biāo)標(biāo)分枝桿桿菌藥藥敏試試驗在條件件具備備和有有一定定經(jīng)驗驗的實實驗室室方可可進行行此項項試驗驗。下列情情況可可進行行分枝枝桿菌菌藥物物敏感感性試試驗：：初始結(jié)結(jié)核病病人觀觀察起起始耐耐藥菌菌感染染復(fù)發(fā)結(jié)結(jié)核病病人痰菌陰陰轉(zhuǎn)后后復(fù)陽陽者化療3~6個月月痰菌菌持續(xù)續(xù)陽性性者痰菌減減少后后又持持續(xù)增增加者者細菌流流行病病學(xué)檢檢查非結(jié)核核分枝枝桿菌菌病等等藥物敏敏感性性試驗驗常用用標(biāo)準準方法法絕對濃濃度法法是由G.Meissner(德國)于1964年首先先提出出的,是我國國30多年來來一直直沿用用的藥藥敏試試驗方方法。。比例法法是由法法國的的G.Canetti和J.Grossete于1963年首先先提出出,是WHO全球耐耐藥監(jiān)監(jiān)測項項目中中推薦薦的標(biāo)標(biāo)準藥藥敏試試驗方方法。。二者者在臨臨界藥藥物濃濃度接接種菌菌量、、結(jié)果果判讀讀方法法等方方面都都有一一定差差別.抗性比比濁法法是英國國科學(xué)學(xué)家D.A.Mitchison首先提提出,由于于方法法比較較煩瑣瑣,現(xiàn)現(xiàn)已不不多用用.比例法法和絕絕對濃濃度法法的一一致性性比例法法和絕絕對濃濃度法法是測測定分分支桿桿菌藥藥物敏敏感性性的二二種常常規(guī)方方法,前者是是世界界衛(wèi)生生組織織(WHO)在“全全球結(jié)結(jié)核病病耐藥藥監(jiān)測測項目目”中中推薦薦的統(tǒng)統(tǒng)一方方法,后者是是我國國各級級實驗驗室30多年來來普遍遍沿用用的方方法。。近年年來,隨著我我國部部分省省陸續(xù)續(xù)加入入WHO耐藥監(jiān)監(jiān)測項項目,二種方方法的的一致致性問問題以以及藥藥敏試試驗是是否向向比例例法轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)軌已已成為為國內(nèi)內(nèi)爭議議的熱熱點。。比例法法和絕絕對濃濃度法法的一一致性性綜合以以往國國內(nèi)有有關(guān)比比例法法和絕絕對濃濃度法法的試試驗報報道，，對2種方方法研研究結(jié)結(jié)果顯顯示,比例法法和絕絕對濃濃度法法檢測測結(jié)果果的一一致率率4藥均高高達96%以上,對于結(jié)結(jié)核分分支桿桿菌,二種方方法測測試H、S、R和E的耐藥藥率均均無顯顯著性性差異異。絕絕對濃濃度法法向比比例法法轉(zhuǎn)軌軌，將將會使使我們們的藥藥敏試試驗結(jié)結(jié)果與與國際際接軌軌，，與國國際具具有可可比性性，而而不會會影響響到與與我國國既往往資料料的連連續(xù)性性和可可比性性。比例法法和絕絕對濃濃度法法的區(qū)區(qū)別從試驗驗技術(shù)術(shù)角度度講,比例法法與絕絕對濃濃度法法的主主要區(qū)區(qū)別是是:(1)絕對濃濃度法法對接接種量量（10-3mg））要求十十分嚴嚴格,既要避避免由由于過過量接接種產(chǎn)產(chǎn)生自自然突突變的的可能能,又要保證證對照培培養(yǎng)基上上菌落生生長旺盛盛,相比之下下,比例法由由于設(shè)定定了高、、低2個（10-4mg和10-6mg）接種量的的參考系系統(tǒng),且試驗結(jié)結(jié)果的判判定是通通過計算算活性單單位的比比值獲得得,因此對接接種量這這一藥敏敏試驗的的重要變變異因素素進行了了一定程程度的校校正．比例法和和絕對濃濃度法的的區(qū)別(2)比例法定定義1%為“敏感感”和““耐藥””的臨界界點,而絕對濃濃度法規(guī)規(guī)定低濃濃度含藥藥培養(yǎng)基基上生長長的菌落落數(shù)多于于20個判斷為為耐藥,按接種菌菌量的活活菌單位位計算與與比例法法的1%耐藥有相相同的理理論基礎(chǔ)。在在此基礎(chǔ)礎(chǔ)上,由于絕對對濃度法法每種藥藥物設(shè)定定高、低低2個藥物濃濃度,所以絕對對濃度法法在一定定程度上上反映了了耐藥的的程度和和水平。。如果說說比例法法是定性性的藥敏敏試驗,絕對濃度度法則包包含有““半定量量試驗””之意。。（3）比比例法操操作較為為繁瑣，，且需定定量技術(shù)術(shù)。藥敏試驗驗基礎(chǔ)培培養(yǎng)基為無淀粉粉改良羅羅氏培養(yǎng)養(yǎng)基，配配方與酸酸性羅氏氏培養(yǎng)基基相比，，只有磷磷酸二氫氫鉀(KH2PO4)的量不同同，其他他成分完完全相同同?？菇Y(jié)核藥藥物溶液液的配制制和稀釋釋1.藥敏敏試驗用用抗結(jié)核核藥物應(yīng)應(yīng)從廠家家取得純純品，并并確認純純度和效效價，在在有效期期內(nèi)使用用。2.異煙煙肼(INH)、利福平(RFP)、氨硫脲(TB1)、乙硫異煙煙胺(TH1321)、環(huán)絲氨酸酸(SC)的生物效效價按其其重量單單位計算算，計算算用藥量量時只需需考慮其其純度.鏈霉素素硫酸鹽鹽（SM-SO4)、乙胺丁醇醇鹽酸鹽鹽（EMB-Cl)、卡那霉素素硫酸鹽鹽(KM-SO4)、卷曲霉素素硫酸鹽鹽(CPM-SO4)、紫霉素硫硫酸鹽(VM-SO4)、對氨基水水楊酸鈉鈉鹽(PAS-Na)等在考慮慮其純度度的同時時，應(yīng)按按廠家標(biāo)標(biāo)定的毫毫克效價價計算其其鹽型藥藥用量。?？菇Y(jié)核藥藥物溶液液的配制制和稀釋釋3.加入入培養(yǎng)基基中實際際藥量的的計算可可參考下下列公式式：實際藥量量=（培培養(yǎng)基內(nèi)內(nèi)藥物終終濃度×需制備培培養(yǎng)基體體積）/（該藥藥物純度度×該藥物物校價××1000）各變量單單位：實實際藥量量：mg效價：%培養(yǎng)基內(nèi)內(nèi)藥物終終濃度：：μg/ml純度：%需制備培培養(yǎng)基體體積：ml抗結(jié)核藥藥物溶液液的配制制和稀釋釋4絕對對濃度法法按所需需濃度制制成高濃濃度藥液液，再按按相應(yīng)比比例稀釋釋成低濃濃度藥液液。5.比例例法按藥藥物儲存存液，分分裝至無無菌試管管，每管管5~10ml,封口，-20℃保存，，3個月月內(nèi)使用用。注意事項項：除RFP、、TB1、TH1321用二甲基基甲酰胺胺溶解，，再用滅滅菌生理理鹽水稀稀釋外，，其他藥藥物可用用滅菌蒸蒸餾水溶溶解、稀稀釋。含藥培養(yǎng)養(yǎng)基制備備每100ml基礎(chǔ)培養(yǎng)養(yǎng)基加入入1ml配制、稀稀釋好的的抗結(jié)核核藥液，，混勻，，無菌分分裝每管管7ml，85℃凝固50min.制成的培培養(yǎng)基37℃無菌試試驗24h，檢查培養(yǎng)養(yǎng)基污染染情況后后置4℃℃避光光保存，，1個月月內(nèi)使用用。藥敏試驗驗方法絕對濃度度法和比比例法藥藥敏試驗驗均包括括菌懸液液制備、、稀釋、、接種、、培養(yǎng)和和結(jié)果報報告、質(zhì)質(zhì)量控制制等。絕對濃度度法具體體操作步步驟略。。比例法藥藥敏試驗驗1．菌懸液制制備（1）臨臨床分離離分枝桿桿菌的新新鮮培養(yǎng)養(yǎng)物（初初生長2周）無無須二次次傳代即即可做藥藥敏試驗驗，初生生長２周周以后和和貯存培培養(yǎng)物須須在改良良羅氏培培養(yǎng)基上上二次傳傳代，取?。病常持艿膩唩喤囵B(yǎng)物物進行試試驗。（2）取取上述培培養(yǎng)物（（須刮取取斜面各各個部分分的培養(yǎng)養(yǎng)物）置置于玻璃璃磨菌器器底部，，插入磨磨菌棒捻捻動使成成乳酪狀狀，以0.５％％Tween-80生理鹽水水磨菌稀稀釋，與與標(biāo)準麥麥氏比濁濁管（MacFaarlandNo.1）比濁，即即配成１１mg/ml的菌懸液液。比例法藥藥敏試驗驗2.稀釋釋（1）菌菌液稀釋釋：靜置置片刻，，使菌液液中的顆顆粒或菌菌塊沉淀淀后，用用刻度吸吸管或22號標(biāo)標(biāo)準接種種環(huán)將１１mg/ml的菌液上上清逐步步稀釋至至0.01mg/ml和0.1mg/ml。(a):22號接種環(huán)環(huán)100倍稀釋釋法：用22號標(biāo)準準接種環(huán)環(huán)沾取2滿環(huán)１１mg/ml的菌液，，移至2ml滅菌生理理鹽水中中，即稀稀釋成0.01mg/ml菌液；用用同樣方方法再進進行100倍稀稀釋，即即成10-4mg/ml菌液（注注：22號標(biāo)準準接種環(huán)環(huán)：金屬屬絲直徑徑0.7mm,接種環(huán)內(nèi)內(nèi)徑3mm，滿環(huán)移液液0.01ml）。。比例法藥藥敏試驗驗2.稀釋釋(b)微量吸管管10倍倍稀釋法法：用無菌菌微量刻刻度吸管管吸取0.5ml上述1mg/ml菌懸液至至4.5滅菌生生理鹽水水中，即即可得到到0.1mg/ml菌液.按按上述方方法連續(xù)續(xù)進行10倍稀稀釋，可可得到10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液。。比例法藥藥敏試驗驗3.接種種:用22號標(biāo)標(biāo)準接種種環(huán)分別別沾取1環(huán)(即即0.01ml)10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，，用劃線線法均勻勻接種至至對照及及含藥培培養(yǎng)基表表面，應(yīng)應(yīng)注意使使菌液盡盡可能均均勻分散散于培養(yǎng)養(yǎng)基斜面面。最終終接種量量為10-4mg和10-6mg。4.培養(yǎng):接接種后的培養(yǎng)養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)，，4周后報告告結(jié)果。比例法藥敏試試驗結(jié)果報告及解解釋1.按以下方方式記錄菌落落生長情況.(1)少于50個菌落:報報實際菌菌落數(shù)(2)50~100個菌菌落:1+(3)100~200個個菌落:2+(4)大部分分融合(200~500個菌落):3+(5)融合(大于500個菌落):4+比例法藥敏試試驗結(jié)果報告及解解釋2.計算耐藥藥百分比:耐藥百分比=含藥培養(yǎng)基基上生長的菌菌落數(shù)/對照照培養(yǎng)基上菌菌落數(shù)*100%若耐藥百分比比大于1%，，則認為受試試菌對該抗結(jié)結(jié)核藥耐藥。。比例法藥敏試試驗質(zhì)量控制1.若高稀釋釋度菌液(10-4mg/ml)在對照培養(yǎng)養(yǎng)基上生長的的菌落數(shù)少于于20個菌落落，則應(yīng)從對對照管傳代培培養(yǎng)，重復(fù)試試驗。2.每批試驗驗以結(jié)核分枝枝桿菌參考菌菌株(H37RV)10-3mg檢測含藥培養(yǎng)養(yǎng)基的質(zhì)量。。附：麥氏1號號比濁管的制制備：0.1ml1%氯化鋇(BaCl2)加入9.9ml1%硫酸(H2SO4)，封口，比濁前前搖勻。藥敏試驗流程程2~3周新鮮鮮純培養(yǎng)物磨菌，制備１mg/ml的菌液稀釋至適當(dāng)濃濃度接種適當(dāng)菌量量至含藥培養(yǎng)基基和對照斜面37℃培養(yǎng)4周報告結(jié)果藥敏試驗準備備比例法結(jié)果判判讀舉例接種量對照INHEMB10-4+++++310-62690耐藥百分數(shù)（%）34.60.1判度結(jié)果耐藥（R）敏感（s）藥敏試驗注意意事項培養(yǎng)基制備：：（1）藥物稱稱量、效價計計算、溶解、、稀釋要準確確；（2）用標(biāo)準準化的儀器和和材料：培養(yǎng)養(yǎng)基蒸汽凝固固滅菌器，螺螺旋蓋培養(yǎng)管管；（3）凝固滅滅菌時間、溫溫度嚴格掌握握；（4）每次制制作培養(yǎng)基應(yīng)應(yīng)表明批次，，使用時用H37RV敏感株作為敏敏感對照考核核含藥培養(yǎng)基基的質(zhì)量。藥敏試驗注意意事項試驗操作：（1）應(yīng)在生生物安全操作作臺內(nèi)進行操操作；（2）要使用用標(biāo)準化的磨磨菌管、吸管管、接種環(huán)進進行稀釋和接接種；（3）要使用用新鮮菌落，，取菌落時要要刮取整個斜斜面，不要只只取單個菌落落；（4）菌液制制備、稀釋、、接種要力求求準確，以保保證接種量在在要求范圍內(nèi)內(nèi)；（5）注意觀觀察溫箱溫度度。藥敏試驗方法法局限性在得到純細菌菌的培養(yǎng)物后后仍需4周可可報告結(jié)果，，遠遠滯后于于臨床診治的的需要；試驗比較煩瑣瑣，結(jié)果受多多種因素影響響，可重復(fù)性性較差；實驗室耐藥與與臨床耐藥之之間有一定的的差距。噬菌體法將分枝桿菌噬噬菌體感染結(jié)結(jié)核分枝桿菌菌，未進入菌菌體內(nèi)的噬菌菌體用特異的的抗噬菌體物物質(zhì)滅活，進進入菌體內(nèi)的的噬菌體得到到保護而復(fù)制制增殖，溶菌菌后釋放子代代噬菌體，將將此噬菌體與與相應(yīng)的結(jié)核核分枝桿菌混混合，接種在在固體培養(yǎng)基基上培養(yǎng)，觀觀察蝕斑的產(chǎn)產(chǎn)生。蝕斑的的數(shù)量與噬菌菌體數(shù)量有關(guān)關(guān)，也與臨床床標(biāo)本中活的的結(jié)核分枝桿桿菌有關(guān)。如果用噬菌體體做藥敏試驗驗，若有耐藥藥結(jié)核分枝桿桿菌存在，細細菌能存活，，會出現(xiàn)蝕斑斑，蝕斑的數(shù)數(shù)量與在含抗抗結(jié)核藥物培培養(yǎng)基上存活活的結(jié)核分枝枝桿菌有關(guān)。。分枝桿菌菌種種鑒定的意義義非結(jié)核分枝桿桿菌的發(fā)病率率在不同的國國家、不同的的地區(qū)報告差差別很大。據(jù)據(jù)資料報道，，日本在1980年報告告：在分枝桿桿菌感染中，，非結(jié)核分枝枝桿菌的發(fā)病病率為12%，并有逐年年上升趨勢，，其中主要為為鳥胞內(nèi)復(fù)合合群，高達89.6%，其次為堪薩薩斯占8.0%我國年對非結(jié)結(jié)核分枝桿菌菌的研究資料料尚不充足，，也缺乏較大大規(guī)模的流調(diào)調(diào)，據(jù)報告非非結(jié)核分枝桿桿菌在我國的的發(fā)病率占分分枝桿菌的4.3%左右。分枝桿菌菌種種鑒定的意義義一般來說，非非結(jié)核分枝桿桿菌對抗結(jié)核核藥物的敏感感性低于結(jié)核核菌，但各型型和各菌株之之間對藥物的的敏感性差別別甚大。分枝桿菌菌種種鑒定形態(tài)學(xué)菌落形態(tài)、顏顏色生長條件28℃生長試驗，，結(jié)核分枝桿桿菌在28℃的孵育環(huán)境境中不能生長長；而TNM菌群的大部分分分枝桿菌可可以生長。生化反應(yīng)硝酸還原、煙酸試驗酶尿素酶耐熱熱觸酶分子生物學(xué)方方法分枝桿菌菌種種鑒定分枝桿菌菌群群鑒定的目的的既是鑒定菌菌株屬于結(jié)核核分枝桿菌復(fù)復(fù)合群還是非非結(jié)核分枝桿桿菌，也是進進一步菌種鑒鑒定的基礎(chǔ)。。分枝桿菌臨床床分離株藥物物敏感性試驗驗應(yīng)與菌種初初步鑒定同步步進行，以對對硝基苯甲酸酸（PNB）、噻吩-2-羧酸肼（TCH）鑒別培養(yǎng)基初初步鑒別結(jié)核核分枝桿菌、、牛分枝桿菌菌和非結(jié)核分分枝桿菌鑒別培養(yǎng)基的的制備過程略略。分枝桿菌菌種種初步鑒定分枝桿菌PNBTCH28℃生長耐熱觸酶硝酸還原煙酸試驗牛分枝桿菌——————結(jié)核分枝桿菌—+————

NTM++++++分枝桿菌菌種種鑒定質(zhì)量控控制要求經(jīng)過初步鑒定定的分枝桿菌菌，需進一步步進行菌種鑒鑒定，可送上上一級實驗室室。鑒別菌株應(yīng)生生長旺盛，生生長時間為3~4周為宜宜。所有培養(yǎng)基、、試劑應(yīng)在規(guī)規(guī)定期限內(nèi)使使用。所有試劑均應(yīng)應(yīng)用標(biāo)準菌株株對照試驗合合格后使用。。分枝桿菌細菌菌庫的建立分枝桿菌菌株株庫是結(jié)核病病控制、流行行病學(xué)檢查及及開展進一步步檢測和研究究的基礎(chǔ)。通通過對菌株庫庫的基因分型型和耐藥性檢檢測，可以發(fā)發(fā)現(xiàn)本地區(qū)菌菌株流行情況況，調(diào)查耐藥藥性趨勢，為為結(jié)核病控制制、流行病學(xué)學(xué)提供細菌學(xué)學(xué)方面的依據(jù)據(jù)。菌種保存決不不是簡單的對對臨床標(biāo)本的的單純的存放放。菌株貯存存要求有嚴格格的貯存條件件，嚴