分子生物學(xué)-分子克隆

分子克隆

（基因工程）周坤houkunfu@前言二十世紀(jì)40年代，基因分子生物學(xué)家確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)1944年O.T.Avery等證明了肺炎球菌轉(zhuǎn)化因子是DNA

50年代，Waston和Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制深刻意義在于：解決了基因自我復(fù)制和遺傳信息的傳遞問題50年代末和60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，并成功破譯了遺傳密碼。

從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題DNAmRNA蛋白質(zhì)

轉(zhuǎn)錄

翻譯tRNA，rRNA

逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制這些都為基因工程的誕生奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)

基因工程的誕生70年代初，DNA限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和一整套DNA體外重組技術(shù)又為基因工程的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。1972年，美國學(xué)者Berg.P等人首次在體外把SV40（一種猴病毒）的DNA和噬菌體DNA分別切割，又將兩者接在一起，成功地構(gòu)建了第一個(gè)體外重組的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次將體外重組的DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌中，成功地進(jìn)行了無性繁殖，從而完成了DNA體外重組和擴(kuò)增的全過程。

基因工程這門新興學(xué)科也就由此誕生了。

基本概念基因工程的核心是重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnique），又叫DNA克隆（DNAcloning）。所謂克隆（clone）是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。在基因工程中所指的克隆，是指在體外對(duì)DNA分子按照既定目的和方案進(jìn)行人工重組，并將重組分子導(dǎo)入適合的宿主細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該DNA分子的大量拷貝?；靖拍钸@類克隆是在分子水平上操作，故又稱分子克隆（molecularcloning）。由于研究對(duì)象常常是特異的基因片段，所以又稱作基因克?。╣enecloning）。實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)工作統(tǒng)稱為基因工程（geneticengineering）。基因工程與當(dāng)前發(fā)展的蛋白質(zhì)工程、酶工程以及細(xì)胞工程共同構(gòu)成了當(dāng)代新興的學(xué)科領(lǐng)域——生物技術(shù)工程。生物技術(shù)工程的興起為現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展和工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的進(jìn)步提供了巨大動(dòng)力。細(xì)胞克隆技術(shù)：在制備單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)中運(yùn)用的最為充分。哺乳動(dòng)物的克?。嚎寺「拍钤趥€(gè)體水平上的應(yīng)用采用了核質(zhì)分離、細(xì)胞融合、體外培養(yǎng)及胚胎移植等技術(shù)

主要內(nèi)容①從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，分離出目的基因片段。②在體外，將目的基因片段連接到能自我復(fù)制的并且具有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成重組DNA分子。③將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱宿主細(xì)胞），并與之一起增殖。④篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。⑤從篩選出的陽性克隆中提取出擴(kuò)增的目的基因片段，供進(jìn)一步研究使用。⑥將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)。應(yīng)用實(shí)例重組DNA技術(shù)跨越天然物種屏障，將原核和真核生物，植物和動(dòng)物，細(xì)菌和人，動(dòng)物和人的基因連接起來，進(jìn)行基因交流。利用大腸桿菌（E.coli)、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)人類所需要的，從其他方法又難以大量獲得的重組蛋白質(zhì)。1、第一個(gè)用細(xì)菌表達(dá)的用于人類的基因重組藥物——人胰島素上市（1979年美國基因技術(shù)公司）牛、豬胰島素素，免疫反應(yīng)應(yīng)化學(xué)合成人胰胰島素基因插入E.coli表達(dá)載體中-半乳糖苷苷酶基因后融合蛋白溴化氰水解混合重建2、用酵母細(xì)細(xì)胞生產(chǎn)乙型型肝炎病毒亞亞單位疫苗包膜蛋白核心蛋白病毒DNA乙肝病毒用基因工程方方法制備乙肝肝表面包膜蛋蛋白為抗原亞亞單位疫苗無無致病力，很很安全、高效效。3、生物鋼掃描電子顯微微鏡下的蜘蛛蛛單絲表面掃描電子顯微微鏡觀察下的的蜘蛛單絲斷斷面蜘蛛絲被拉斷斷時(shí)顯示出的的“皮”結(jié)構(gòu)構(gòu)，也稱"鞘"結(jié)結(jié)構(gòu)（箭頭頭所示部分））蜘蛛絲被拉拉斷時(shí)顯示示出的"芯"結(jié)構(gòu)，也稱稱"劍"結(jié)構(gòu)（箭頭頭所示部分分）目前世界范范圍內(nèi)開發(fā)發(fā)的基因工工程多肽藥藥物、疫苗苗、抗體有有五百多種種理論意義1、徹底填填平了生物物種屬間不不可逾越的的鴻溝2、重組技技術(shù)縮短了了進(jìn)化單位位3、能按人人們的意愿愿定向改造造、培育新新品種4、解決醫(yī)醫(yī)學(xué)與生物物學(xué)上長期期無法解決決的許多重重大（如是是什么基因因、在什么么地方、什什么時(shí)間、、起什么作作用？如何何起作用？？）人們預(yù)言，，21世紀(jì)紀(jì)是生命科科學(xué)的世紀(jì)紀(jì)，以基因因工程為主主導(dǎo)的生物物技術(shù)可能能對(duì)世界的的重大問題題－－饑餓餓、疾病、、能源、污污染等提出出切實(shí)的解解決辦法，，推動(dòng)社會(huì)會(huì)生產(chǎn)力的的飛速發(fā)展展。一、分子克克隆中常用用的工具酶酶在重組DNA與基因工程程中，對(duì)目目的基因的的分離、剪剪切和重組組涉及到一一系列酶催催化反應(yīng)，，這些酶就就像外科醫(yī)醫(yī)生的手術(shù)術(shù)刀一樣，，是進(jìn)行基基因工程操操作必不可可少的工具具。常分為為限制性核酸酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）、連接酶（ligase）和核酸修飾酶酶（modifyingenzyme）。限制性核酸酸內(nèi)切酶限制性核酸酸內(nèi)切酶是是指能識(shí)別別DNA的的特殊序列列，并在識(shí)識(shí)別位點(diǎn)或或其周圍切切割雙鏈DNA的一一類酶。它主要來源源于原核生物，可將侵入入宿主細(xì)胞胞的外源性性DNA迅迅速降解，，而對(duì)細(xì)菌菌自身的DNA，則則通過甲基基化酶在該該種限制酶酶切位點(diǎn)甲甲基化修飾飾而保護(hù)自自身的DNA不被降降解。限制性內(nèi)切切酶由于能能限制外源源DNA的的“入侵””而得名。。限制性核酸酸內(nèi)切酶的的命名命名是根據(jù)據(jù)含有該酶酶的微生物物種屬而定定。通常有有三個(gè)斜體字母的縮寫表示示。第一個(gè)大寫寫字母取自自細(xì)菌屬名的第一個(gè)字字母；第二、三個(gè)個(gè)小寫字母母取自微生生物種名的頭兩個(gè)字字母；第四四個(gè)字母代代表該微生生物同種內(nèi)內(nèi)不同的株系；如果同一一株名發(fā)現(xiàn)現(xiàn)幾種限制制酶，則根根據(jù)其被發(fā)發(fā)現(xiàn)和分離離的先后順順序，用羅羅馬數(shù)字表表示。例如，從大大腸桿菌（（EscherichiaColi）RY13株中發(fā)現(xiàn)分分離的第一一種限制酶酶，稱為EcoRI。限制酶的分分類及特點(diǎn)點(diǎn)根據(jù)限制酶酶的組成、、輔因子及及切割DNA方式不不同，可分分為I、II、III型。重組DNA技術(shù)中常常用的是II型限制制性內(nèi)切酶酶。II型酶酶作用特點(diǎn)點(diǎn)是有嚴(yán)格格的識(shí)別、、切割順序序，以內(nèi)切切方式水解解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵鍵，產(chǎn)生的DNA片段段5‘端為為磷酸基，3’端為為羥基。識(shí)別順序一一般為4－－6個(gè)堿基基，通常是是回文結(jié)構(gòu)構(gòu)（palindrome））。識(shí)別序序列的大小小決定其切切割DNA后產(chǎn)生的的片段的長長短。44＝256、46＝＝4096、48＝＝65536II型酶切切割雙鏈DNA產(chǎn)生生3種不同同的切口：：⑴在對(duì)稱軸軸中心同時(shí)時(shí)切割雙鏈鏈，產(chǎn)生平末端或稱鈍性末端（blintend），如如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3‘3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG……5'⑵在對(duì)稱軸軸兩側(cè)相對(duì)對(duì)位點(diǎn)分別別切割一條條鏈。從5'端切切割產(chǎn)生5'端突突出的粘性性末端，如EcoRI：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'……GAATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAAG…5'⑶從3'端端切割產(chǎn)產(chǎn)生3'端突突出的粘性性末端。如PstI：5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCAG…3‘3'…G▲ACGTC……5'3'…GACGTC…5'同工異源酶酶1.定義義：能識(shí)別別相同序列列但來源不不同的兩種種或多種限限制酶2.特點(diǎn)點(diǎn)：1）識(shí)識(shí)別相同順順序2）切割位位點(diǎn)的異同同KpnIGGTACCSstICCGCGGAsp718GGTACCSacICCGCGG同尾酶有些限制酶酶識(shí)別序列列不同，但但產(chǎn)生相同同的粘性末末端，稱這這些酶為同同尾酶。如：BamHI(GGATCC)和Sau3AI(NGATCN)由此產(chǎn)生的的DNA片片段可借粘粘性末端相相互連接，，在DNA重組時(shí)具具有更大的的靈活性5‘…G▼AATTC…3’5‘…N▼AATTN…3’星號(hào)活力EcoRI*

星號(hào)活力：：限制性內(nèi)切切酶在非標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條條件下，能能夠切割一一些與其特特異性識(shí)別別順序類似似的序列，，這種現(xiàn)象象稱星號(hào)活活力。誘發(fā)星號(hào)活活力常見原原因：1、高甘油油含量（>5%，V/V））2、內(nèi)切酶酶用量過大大，（>100U/μgDNA）3、低離子子強(qiáng)度：<25mmol/L4、高pH值：pH>85、含有機(jī)溶溶劑：二甲甲基亞砜、、乙醇、乙乙烯二乙醇醇等6、有Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+等非Mg2+的二價(jià)陽離離子。。。應(yīng)用在分子生物物學(xué)和基因因工程中具具有舉足輕輕重的地位位。其主要要?jiǎng)儆猛荆海?、改造及及組建質(zhì)粒粒2、組建基基因組DNA物理圖圖譜3、基因組組DNA同同源性研究究4、DNA重組克隆隆及亞克隆隆5、、DNA雜雜交交與與序序列列分分析析注意意事事項(xiàng)項(xiàng)酶切切底底物物DNA要要純純，，抽抽提提時(shí)時(shí)酚酚／／氯氯仿仿要要去去除除干干凈凈。。所加加酶酶量量不不應(yīng)應(yīng)超超過過10％％（（RE保保存存在在50％％的的甘甘油油中中－－20度度較較穩(wěn)穩(wěn)定定））。。取酶酶時(shí)時(shí)量量要要準(zhǔn)準(zhǔn)，，最最后后加加酶酶，，最最好好在在冰冰箱箱里里加加。。酶切切反反應(yīng)應(yīng)2小小時(shí)時(shí)左左右右，，可可延延長長，，節(jié)節(jié)約約酶酶量量。。兩種種酶酶有有相相同同的的緩緩沖沖液液，，可可雙雙酶酶切切；；不不同同，，先先用用需需低低鹽鹽緩緩沖沖液液的的限限制制酶酶消消化化，，再再用用需需高高鹽鹽緩緩沖沖液液的的酶酶消消化化。。DNA連連接接酶酶連接接酶酶可可催催化化DNA分分子子中中相相鄰鄰5'磷磷酸酸基基和3'羥羥基基末端端之之間間形形成成磷酸酸二二酯酯鍵鍵，使使DNA切切口口封封合合或或使使兩兩個(gè)個(gè)DNA分分子子或或片片段段連連接接。。常常用用的的有有T4（噬噬菌菌體體））DNA連連接接酶酶和和E.ColiDNA連連接接酶酶。。DNA聚聚合合酶酶重組組DNA技技術(shù)術(shù)中中，，聚聚合合酶酶（（polymerase））的的最最重重要要作作用用是是以以DNA或或RNA為為模模板板在在體體外外合合成成DNA或或RNA。?？煞址譃闉镈NA聚合合酶酶和和RNA聚合合酶酶兩兩大大類類。。RNA聚合合酶酶以以DNA為模模板板合合成成RNA。常常用用于于離離體體條條件件下下，，合合成成單單鏈鏈RNA作為為雜雜交交探探針針。。常用用的的DNA聚聚合合酶酶有有大腸腸桿桿菌菌DNA聚聚合合酶酶I大大片片段段(klenow)以DNA為為模模板板，，催催化化5‘‘→→3’’核核酸酸鏈鏈的的延延長長，，另另有有3‘‘→→5’’的的外外切切酶酶活活性性。。常常用用于于DNA3‘‘末末端端的的標(biāo)標(biāo)記記和和填填充充；；cDNA第第二二鏈鏈的的合合成成，，DNA測測序序。。磷酸酸酶酶牛小小腸腸堿堿性性磷磷酸酸酶酶（（calfintestinalalkalinephosphatase,CIP）），，催催化化DNA或或RNA的的5'磷磷酸酸基基水水解解。。常用用于于去去除除線線狀狀載載體體DNA兩兩端端的的5'磷磷酸酸基基團(tuán)團(tuán)，，防防止止載載體體自自身身連連接接環(huán)環(huán)化化；；也也用用于于用用32P標(biāo)標(biāo)記記DNA的的5'末末端端之之前前除除去去原原來來的的5'磷磷酸酸基基。。逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶以RNA為為模模板板，，合合成成cDNA鏈鏈（（5'→→3'）），，另另有有RNA酶酶H活活性性。。常常用用于于cDNA第第一一，，二二鏈鏈的的合合成成及及反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄PCR（（RT-PCR））。。名稱稱功功能能及及應(yīng)應(yīng)用用大腸腸桿桿菌菌DNA聚聚合合酶酶I以以DNA為為模板板，，催催化化5’’→→3’’核酸酸鏈鏈的的延延長長，，另另有有3’’→→5’’的外外切切酶酶大片片段段（（klenow））活性性。。常常用用于于DNA3’’末末端端的的標(biāo)標(biāo)記記和和填填充充、、cDNA第第二二鏈鏈的的合合成成、、DNA測測序序。。TaqDNA聚聚合合酶酶以以DNA為模模板板，，催催化化5’’→→3’核酸酸鏈鏈的的延延長長，，另另有有弱弱的的5’→→3’的外切酶活性，，耐高溫溫。常用用于PCR及DNA測測序。末端轉(zhuǎn)移移酶催催化化NTP中的NMP通通過其磷磷酸基與與DNA3’’-OH連接接而使DNA鏈鏈延長，無需模板板。常用于于3'端端標(biāo)記記或形成成DNA共聚尾尾巴。逆轉(zhuǎn)錄酶酶以以RNA為模板，，合成cDNA鏈（5’→→3’）），另有有RNA酶酶H活性。常常用于cDNA第第一、二二鏈的合合成及反反轉(zhuǎn)錄PCR（（RT-PCR）。RNA聚聚合酶以以DNA為模板合合成RNA。常常用于離離體條件件下，合合成單鏈鏈RNA作為雜交探針針。二、分子子克隆中中常用的的載體基因工程程載體（（vector）是供供插入目目的基因因并將其其導(dǎo)入宿宿主細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)達(dá)或復(fù)制制的運(yùn)載工具具。什么樣樣的載體體才是較較為理想想的呢？？其基本本條件是是：①能自主主復(fù)制并并能帶動(dòng)動(dòng)插入的的目的基基因一起起復(fù)制。。②具有適適當(dāng)?shù)南尴拗菩悦该盖形稽c(diǎn)點(diǎn)，以便便目的基基因的插插入。③載體分分子大小小合適，，太大不不易復(fù)制制；太小小不易容容納較大大目的基基因。④具有合合適的篩篩選標(biāo)記記（如抗抗藥性基基因，酶酶基因等等），以以便篩選選陽性克克隆。⑤如作為為表達(dá)載載體，要要配備適適當(dāng)?shù)恼{(diào)調(diào)控元件件，如啟啟動(dòng)子、、增強(qiáng)子子等。載體的分分類一般常用用的載體體按來源源分有質(zhì)粒（plasmid）、噬菌菌體（phage）和病毒毒（virus）。天然的的質(zhì)粒、、噬菌體體、病毒毒都需經(jīng)經(jīng)過人工工改造才才能成為為合乎要要求的基基因工程程載體。。質(zhì)粒和噬噬菌體常常用于以以原核細(xì)細(xì)胞為宿宿主的分分子克隆?。粍?dòng)物病毒毒常用于于以真核核細(xì)胞為為宿主的的分子克克隆。載體按得得到的產(chǎn)產(chǎn)物分類類：克隆載體體（cloningvector）主要用用于DNA大量擴(kuò)增增，并不不需要得得到目的的基因所所編碼的的蛋白質(zhì)質(zhì)。表達(dá)載體體（expressionvector），使插插入的目目的基因因可轉(zhuǎn)錄錄、進(jìn)而而翻譯成成多肽鏈鏈而設(shè)計(jì)計(jì)的載體體，具有有表達(dá)外外源基因因的能力力。質(zhì)粒載體體染色體質(zhì)粒質(zhì)粒是存存在于細(xì)細(xì)菌染色色體外的的小型環(huán)環(huán)狀雙鏈鏈DNA分子，，能在宿宿主細(xì)胞胞獨(dú)立自自主地進(jìn)進(jìn)行復(fù)制，并在細(xì)細(xì)胞分裂裂時(shí)保持持恒定地地傳給子子代細(xì)胞胞。質(zhì)粒帶有有某些遺傳信息息，會(huì)賦予予宿主細(xì)細(xì)胞新的的遺傳性性狀，如如質(zhì)粒攜攜帶的氨氨芐青霉霉素抗性性基因使使宿主細(xì)細(xì)胞對(duì)氨氨芐青霉霉素產(chǎn)生生抗性，，從而輕輕易地篩篩選出成成功轉(zhuǎn)化化了質(zhì)粒粒的細(xì)菌菌。載體質(zhì)粒粒上往往往還引入入了“多克隆位位點(diǎn)（multiplecloningsites）”，，即一段段人工合合成的DNA序序列，上上面含有有密集的的多種限限制性酶酶切位點(diǎn)點(diǎn)，以供供插入外外源基因因片段。。另外，較較好的載載體往往往還引入入多種用用途的輔助序列列，如供藍(lán)藍(lán)白斑篩篩選的LacZ基基因。pBR322質(zhì)質(zhì)粒圖圖譜氨芐青霉霉素抗性性基因四環(huán)素抗抗性基因因多克隆位位點(diǎn)pUC質(zhì)質(zhì)粒粒圖譜突變型lac-E.coli表達(dá)β-半乳糖苷苷酶的ω片段。如果插入入的外源源基因是是在lacZ基基因內(nèi)，，就會(huì)影影響lacZ的的表達(dá)，，利用lac-E.coli為轉(zhuǎn)染或或感染細(xì)細(xì)胞，在在含X-gal的培養(yǎng)養(yǎng)基上生生長時(shí)會(huì)會(huì)出現(xiàn)白白色菌落落；若無無外源基基因插入入，則出出現(xiàn)藍(lán)色色菌落。。多克隆位位點(diǎn)編碼β-半乳糖苷酶的的α片段α-互補(bǔ)補(bǔ)：（alphacomplementation）pUC質(zhì)質(zhì)粒帶有有大腸桿桿菌β-半乳糖糖苷酶基基因的一一個(gè)片段段LacZ基因，它編碼碼β-半半乳糖苷苷酶的一一個(gè)片段段，而宿宿主細(xì)胞胞能編碼碼與這個(gè)個(gè)片段互互補(bǔ)的ββ-半乳乳糖苷酶酶的另一一部分，，實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，形成完完整的ββ-半乳乳糖苷酶酶，此酶酶能分解解發(fā)色底底物X-gal，形成成藍(lán)色菌落落。當(dāng)外源源基因插插入后，，LacZ基因因被破壞壞，不能能合成完完整的ββ-半乳乳糖苷酶酶，因此此不能分分解底物物X-gal，，菌落成白白色。因此通過過藍(lán)白斑斑篩選可可以篩選選、鑒定定重組體體與非重重組體載載體。噬菌體載載體是一種細(xì)細(xì)菌病毒毒，可作作為克隆隆載體。。其優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)是可以以在體外外包裝產(chǎn)產(chǎn)生感染染性很高高的噬菌菌體顆粒粒。目前使用用的噬菌菌體載體體主要有有λ噬菌體體衍生物物載體、粘粒載體體和單鏈M13噬菌體載載體等。除M13噬菌體載載體外，，這類載載體的特特點(diǎn)是其其容量比比質(zhì)粒載載體大，，即可插插入較大大的外源源DNA片段（（如20kb以以上）。。噬菌體體頭部尾部尾絲噬菌體感感染細(xì)菌菌示意圖圖M13噬菌體目前常用用的單鏈鏈載體是是經(jīng)改建建的M13mP系列。其其中引入入了lacZ基基因一部部分和多多克隆位位點(diǎn)，因因此也可可用藍(lán)白白斑篩選選重組DNA。。M13噬菌體基基因組是是單鏈環(huán)環(huán)狀DNA，當(dāng)當(dāng)它侵犯犯宿主菌菌后，在在細(xì)菌胞胞內(nèi)酶的的作用下下，單鏈鏈DNA轉(zhuǎn)變成成復(fù)制型型雙鏈DNA，，可提取出出來做基基因重組組。雙鏈DNA在大大腸桿菌菌中復(fù)制制100-200拷貝貝后，M13的合成轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變成不不對(duì)稱地地合成雙雙鏈中的的一條，，產(chǎn)生大大量單鏈鏈DNA，并包包裝成成成熟的噬噬菌體顆顆粒，透透出菌壁壁，釋放放到培養(yǎng)養(yǎng)基中。。因此可可以從大大腸桿菌菌培養(yǎng)基基中分離離單鏈DNA。M13噬菌體的的最大特特點(diǎn)就是是能產(chǎn)生生單鏈DNA，，這是獨(dú)獨(dú)一無二二的。因此從培培養(yǎng)基上上收獲到到的含目目的基因因的M13單鏈DNA可直直接作為為模板進(jìn)進(jìn)行雙脫脫氧鏈終終止法測序和寡核苷酸酸定點(diǎn)突變。λ噬菌體（lambdlabacteriophage）λ噬菌體是是一種大腸腸桿菌病毒毒，為線性性雙鏈DNA，它的的兩端各有有12個(gè)堿堿基的互補(bǔ)補(bǔ)粘性末端端，稱COS位點(diǎn)。。當(dāng)噬菌體體侵入宿主主細(xì)胞，兩兩個(gè)粘性末末端互補(bǔ)結(jié)結(jié)合，形成成環(huán)狀分子子。λ噬菌體侵侵入細(xì)菌后后，即可裂解生長（環(huán)狀DNA在細(xì)菌菌中多次復(fù)復(fù)制，合成成大量噬菌菌體基因產(chǎn)產(chǎn)物，裝配配成噬菌體體顆粒，裂裂解宿主菌菌），又可可以溶源生長（λ噬菌體體DNA整整合到細(xì)胞胞染色體基基因組DNA中，與與染色體DNA一起起復(fù)制，并并遺傳給子子代細(xì)胞，，宿主細(xì)胞胞不被裂解解）。λ噬菌體基基因組中功功能相關(guān)基基因集中分分布。包裝限制性性。重組子子大小在75％－105％，，可被包裝裝成為成熟熟顆粒。λDNA在在體外可包包裝成病毒毒顆粒（將將重組DNA包裝進(jìn)進(jìn)入頭部或或尾部蛋白白中），并并高效感染染大腸桿菌菌。粘粒載體（cosmidvector，又稱稱柯斯質(zhì)粒粒載體）粘粒載體由由質(zhì)粒DNA和λ噬菌體DNA兩部分組成成。粘粒具有質(zhì)質(zhì)粒的特性性，在宿主主細(xì)胞中能能自主復(fù)制制，有克隆隆位點(diǎn)，也也有抗藥性性基因。同時(shí)粘粒又又具有λ噬噬菌體的特特性。在λλDNA中中主要是λλDNA的的粘性末端端COS位位點(diǎn)及其與與包裝有關(guān)關(guān)的短片段段。能按λλ噬菌體DNA分子子的同樣方方式環(huán)化起起來，克隆隆外源DNA后，經(jīng)經(jīng)體外包裝裝能高效進(jìn)進(jìn)入大腸桿桿菌細(xì)胞。。粘粒的一大大特點(diǎn)是能能容納長達(dá)達(dá)35－45kb的的大片段外源源DNA，因此常用用作大片段段外源DNA的克隆隆。外源基因插插入到兩個(gè)個(gè)線狀粘粒粒之間λ噬菌體的的A蛋白切切下COS位點(diǎn)以外外部分，中中間部分包包裝到外殼殼蛋白中，，組成成熟熟的噬菌體體顆粒。重組子與λ噬菌體DNA體外外包裝系混混合真核細(xì)胞用用載體真核細(xì)胞用用作克隆基基因的表達(dá)達(dá)具有很多多優(yōu)點(diǎn)，如如它能識(shí)別別和剪切外外源基因中中的內(nèi)含子子并加工成成成熟的mRNA，，對(duì)表達(dá)的的蛋白質(zhì)進(jìn)進(jìn)行翻譯后后加工和修修飾（如糖糖基化）等等，這些都都是原核細(xì)細(xì)胞辦不到到的。目前所用的的真核載體體大多是所所謂穿梭載體（shuttlevector），，它既含有有原核細(xì)胞胞的復(fù)制原原件，又含含有真核細(xì)細(xì)胞的復(fù)制制原件，因因此它既可可以在原核核細(xì)胞中復(fù)復(fù)制擴(kuò)增，，也可以在在真核細(xì)胞胞中擴(kuò)增、、表達(dá)。由由于在原核核體系中基基因工程的的重組、擴(kuò)擴(kuò)增、測序序等易于進(jìn)進(jìn)行，所以以利用穿梭梭載體，首首先把要表表達(dá)的基因因裝配好后后再轉(zhuǎn)到真真核細(xì)胞中中表達(dá)，這這為真核細(xì)細(xì)胞基因工工程操作提提供了很大大的方便。。真核細(xì)胞載載體又可分分為哺乳動(dòng)物細(xì)細(xì)胞載體，酵母細(xì)胞載載體和昆蟲細(xì)胞載載體。哺乳動(dòng)物物細(xì)胞載體體通常是用用能在真核核細(xì)胞中復(fù)復(fù)制的DNA或RNA病毒來來構(gòu)建，如如腺病毒載載體、逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病毒載載體等。人工染色體體前面我們提提到過用粘粘粒載體可可以克隆長長達(dá)35－－45kb的外源基基因片段，，但是還有有許多基因因過于龐大大，不能作作為單一片片段克隆于于這些載體體中。人類基因組組、水稻基基因組工程程的工作需需要能容納納更長DNA片段的的載體，這這就使人們們組建了一一系列人工工染色體來來滿足克隆隆更長外源源DNA片片段的需要要。如酵母人工染染色體（yeastartificialchromosome，，YAC）），這是由由酵母染色色體基因組組的基本功功能單位和和pBR322構(gòu)成成的，能自自我復(fù)制的的線性克隆隆載體。另另外還有細(xì)菌人工染染色體（bacterialartificialchromosome，，BAC）），以及還還在研究之之中的哺乳動(dòng)物人人工染色體體（mammalianartificialchromosome，，MAC））。三、目的基基因的分離離與合成目的基因（targetgene）又稱外源基因，即我們所所要研究的的感興趣的的基因。從從生物材料料中制備出出包含有目目的基因在在內(nèi)的DNA片段，往往往是分子克克隆最重要要的一步。。限制性內(nèi)切切酶直接分分離獲得直接分離法法用于一些些物理圖譜譜（物理圖圖譜是指標(biāo)標(biāo)明限制性性核酸內(nèi)切切酶在DNA分子上上的限制位位點(diǎn)數(shù)目、、限制片段段大小及其其排列順序序的圖譜））已確立，，背景資料料比較清楚楚的原核生物基基因的制備。從原核生物物中提取純純化DNA后，根據(jù)據(jù)它的限制制酶物理圖圖譜進(jìn)行基基因定位，，用適當(dāng)?shù)牡南拗菩詢?nèi)內(nèi)切酶將巨巨大的基因因組DNA分子切成成多數(shù)片段段，然后進(jìn)進(jìn)行分子克克隆。從基因組文文庫中篩選選分離組織或或細(xì)胞染色體DNA，利用限制制性內(nèi)切酶酶將染色體體DNA切切割成基因因水平的許多片段，其中即含含有我們感感興趣的基基因片段。。將這些片段段隨機(jī)地同適合的克隆載體拼接成重組組DNA分分子，繼而而轉(zhuǎn)入受體體菌擴(kuò)增，，使每個(gè)細(xì)細(xì)菌內(nèi)都攜攜帶一種重重組DNA分子的多多個(gè)拷貝。。不同細(xì)菌所所包含的重重組DNA分子內(nèi)可可能存在不不同的染色色體片段，，這樣生長長的全部細(xì)菌所攜帶的各各種染色體體片段就代代表了整個(gè)個(gè)基因組DNA的所所有序列。。與一般圖書書館不同的的是：基因因組DNA文庫沒有有圖書目錄錄，建立基基因組文庫庫后，需結(jié)結(jié)合適當(dāng)篩選方法從眾多轉(zhuǎn)化化子菌落中中選出含有有某一基因因的菌落，，再進(jìn)行擴(kuò)擴(kuò)增，將重重組DNA分離、回回收，以獲獲得目的基基因。結(jié)合適當(dāng)篩選方法從眾多轉(zhuǎn)化化子菌落中中選出含有有某一基因因的菌落，，再進(jìn)行擴(kuò)擴(kuò)增，將重重組DNA分離、回回收，以獲獲得目的基基因。存在于轉(zhuǎn)化化細(xì)菌內(nèi)，，由克隆載載體所攜帶帶的所有基基因組DNA的集合合稱基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary））。如人的的基因組文文庫包括了了單倍體23條染色色體中所有有的DNA?；蚪M組DNA文文庫就像圖圖書館庫存存萬卷書一一樣，涵蓋蓋了基因組組全部基因因信息，也也包括我們們感興趣的的基因。逆轉(zhuǎn)錄制備備cDNA或從cDNA文庫庫中篩選盡管同一生生物體中不不同組織細(xì)細(xì)胞的基因因組是相同同的，但各各種類型細(xì)細(xì)胞之間以以及同一細(xì)細(xì)胞在不同同的發(fā)育時(shí)時(shí)期所表達(dá)達(dá)的基因是是各不相同同的。大多數(shù)基因因都會(huì)在相相應(yīng)的細(xì)胞胞中特異性性地轉(zhuǎn)錄，，如網(wǎng)織紅紅細(xì)胞階段段，有豐富富的珠蛋白白mRNA。因此由由這些高豐豐度mRNA經(jīng)過逆逆轉(zhuǎn)錄得到到與mRNA互補(bǔ)的的cDNA（complementaryDNA，cDNA）），可直接接進(jìn)行克隆隆。對(duì)于低豐富富mRNA的cDNA克隆，通常常是建成cDNA文庫（cDNAlibrary）。即把細(xì)細(xì)胞總mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄錄合成總cDNA，再與適當(dāng)當(dāng)載體連接接后轉(zhuǎn)入受受體菌，從從而得到含含有某種生生物體全部cDNA集合。它的特點(diǎn)是是它只包括括已經(jīng)被轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因因序列，且且不包括內(nèi)內(nèi)含子及調(diào)調(diào)控序列，，所以cDNA文庫的復(fù)雜性要比比基因組文文庫低的多多。但由于不同同的細(xì)胞類型、發(fā)育階段以及細(xì)胞所處的的特定狀態(tài)態(tài)是由特定基基因的表達(dá)達(dá)所決定的的，因此各各自的mRNA種類就不同同，由此產(chǎn)產(chǎn)生的cDNA又是獨(dú)特的。與基因組DNA文庫類似，，由總mRNA制作的cDNA文庫包含了了細(xì)胞表達(dá)達(dá)的各種mRNA信息，自然然也含有我我們感興趣趣的編碼cDNA。然后用適適當(dāng)?shù)姆椒ǚ◤腸DNA文庫中篩選選出目的cDNA。cDNA文庫cDNA文文庫構(gòu)建過過程化學(xué)合成法法如果已知某某種基因的的核苷酸序列列，或根據(jù)某某種基因產(chǎn)產(chǎn)物的氨基酸序列列推導(dǎo)出編碼碼該多肽鏈鏈的核苷酸酸序列，再再利用DNA合成成儀通過化學(xué)合合成原理合合成目的基基因。利用該法合合成的基因因有：人生生長激素釋釋放抑制因因子、胰島島素原、腦腦啡肽及干干擾素基因因等。聚合酶鏈反反應(yīng)聚合酶鏈反反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）是一一種體外快快速的特定定DNA片片段擴(kuò)增技技術(shù)。PCR技術(shù)。?？梢詮囊灰粋€(gè)細(xì)胞、、一滴血液液、一根毛毛發(fā)中，經(jīng)經(jīng)過30次次左右的循循環(huán)擴(kuò)增，，使目的基基因擴(kuò)增上上百萬倍。。應(yīng)用時(shí)，，常常在在目的基因5'端和和3'端端分別設(shè)計(jì)計(jì)引物，，引物中中又分別別引入合合適的限限制性內(nèi)內(nèi)切酶切切位點(diǎn)，，以帶有有目的基因因的載體體或細(xì)胞胞基因組組DNA為模板板擴(kuò)增，限制性性內(nèi)切酶酶酶切后后，PCR產(chǎn)物物兩端易易形成粘粘性末端端而利于于進(jìn)一步步克隆。。逆轉(zhuǎn)錄──PCR（reversetranscriptionPCR，RT─PCR））技術(shù)，，使得人人們可以以從mRNA入入手，通通過逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄得到到cDNA，，在適當(dāng)當(dāng)引物存存在下，，經(jīng)PCR擴(kuò)增增目的基基因。所所得到的的目的基基因無內(nèi)內(nèi)含子、、無調(diào)控控序列，，而獲得得連續(xù)編編碼的序序列。以上幾種種獲取目目的基因因的方法法多用與與編碼序序列已知知的基因因，目前前人體已已知基因因只有1／10左右，，所以獲獲取大量量未知基基因則更更為誘人人和富于于挑戰(zhàn)性性，所涉涉及的方方法更多多，如基基因芯片片技術(shù)、、酵母雙雙雜交技技術(shù)以及及噬菌體體、細(xì)菌菌展示技技術(shù)等等等，這些些都有待待我們?nèi)トミM(jìn)一步步學(xué)習(xí)和和研究。。四、DNA分子子的體外外連接通過不同同途徑獲獲取含目目的基因因的外源源DNA，選擇擇或改建建適當(dāng)?shù)牡目寺≥d載體后，，下一步步工作是是如何將將外源DNA與與載體DNA連連接在一一起，即即DNA的體外外重組。。這種人工工DNA重組是是靠DNA連連接酶催化兩個(gè)個(gè)雙鏈DNA片片段相鄰鄰的5'端磷磷酸與3'端端羥基之之間形成成磷酸二二酯鍵。。通常所所用的連連接酶是是T4噬菌體DNA連連接酶和大腸桿菌菌DNA連接酶酶。質(zhì)粒載體體外源DNA抗生素抗性基因因EcoRI含重組質(zhì)質(zhì)粒的克克隆轉(zhuǎn)化進(jìn)抗抗生素敏敏感的受受體細(xì)胞胞涂布含抗抗生素的的瓊脂平平板連接EcoRI外源DNA含抗生素素的瓊脂脂平板粘性末端端連接堿性磷酸酸酶處理理載體分分子后連連接如果是構(gòu)構(gòu)建表達(dá)達(dá)型重組組體，因因?yàn)閱?dòng)動(dòng)子啟動(dòng)動(dòng)轉(zhuǎn)錄以以及轉(zhuǎn)錄錄后翻譯譯閱讀都都是有方方向的，，因此插插入的目目的基因因也應(yīng)注注意方向向。一般般采用兩種限制制酶消化，由由于粘性性末端不不同，載載體分子子和外源源DNA片段只只能按一一種方向向形成重重組分子子，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)定向克隆隆定向克隆隆連接效果果與載體體和目的片段段質(zhì)量有有關(guān)3：110μl連接反應(yīng)應(yīng)一般約4-5小時(shí)，，室溫，，20度度左右平端連接接因載體分分子和目目的DNA分子子之間并并不一定定都產(chǎn)生生互補(bǔ)的的粘性末末端，有有的限制制性內(nèi)切切酶只能能切成平平端。有有時(shí)所需需用的兩兩種限制制性內(nèi)切切酶切割割后形成成非互補(bǔ)補(bǔ)的粘性性末端，，此時(shí)需需設(shè)法使使之變成成平端，，如用S1核酸酶消消化或用用Klenow片段和和dNTP補(bǔ)平平3‘端端，成成為平末末端。平末端仍仍用T4DNA連連接酶連連接，只只是效率率低，需需要的DNA濃濃度更高高。人工接頭頭連接連接子（（linker）是指指人工合合成的一一段雙鏈寡核核苷酸，其中包包含一個(gè)個(gè)（或兩兩個(gè)）酶切位點(diǎn)點(diǎn)。首先將將接頭與與目的DNA片片段進(jìn)行行平末端端連接，，繼而用用適當(dāng)?shù)牡膬?nèi)切酶酶將接頭頭部位切切出粘性性末端，，最后與與載體進(jìn)進(jìn)行粘性性末端連連接。加插頭連連接插頭（adaptor，又叫叫適配子）與接頭頭的區(qū)別別在于其其一側(cè)末末端是一一個(gè)粘性性末端（（內(nèi)含限限制性內(nèi)內(nèi)切酶位位點(diǎn)），，而另一一側(cè)為平平末端，，也可以以是粘末末端。將將其與目目的DNA片段段進(jìn)行平平端或粘粘端連接接后，即即可直接接與載體體連接。。通過PCR獲得得粘末端端PCR技技術(shù)的出出現(xiàn)大大大方便了了基因的的克隆。。在進(jìn)行行PCR時(shí)，可可根據(jù)載載體上的的克隆位位點(diǎn)設(shè)計(jì)計(jì)PCR引物，，使引物上帶有與與載體克克隆位點(diǎn)點(diǎn)相匹配配的限制性內(nèi)內(nèi)切酶識(shí)識(shí)別序列列，通過PCR或或RT──PCR直接產(chǎn)產(chǎn)生可用用于重組組的外源源基因片片段。T-A克克隆TaqDNA聚合酶擴(kuò)增增目的DNA同時(shí)，在其其末端加兩個(gè)個(gè)游離的“A”只要載體切口口處人工加上上游離的“T”，PCR產(chǎn)物即可與與載體連接。。五、重組DNA導(dǎo)入受體體細(xì)胞目的基因與載載體在體外重重組后應(yīng)導(dǎo)入入受體細(xì)胞中中才能擴(kuò)增并并進(jìn)一步篩選選。轉(zhuǎn)化（transformation））將質(zhì)粒或以以它為載體構(gòu)構(gòu)建的重組分分子導(dǎo)入受體體細(xì)胞的過程程。感染（infection））以噬菌體粘粘性質(zhì)粒和真真核病毒作載載體構(gòu)建的重重組分子，在在體外經(jīng)過包包裝成具有感感染能力的病病毒或嗜菌體體顆粒，感染染適當(dāng)細(xì)胞并并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)擴(kuò)增的過程。。還有一個(gè)易混混淆的名稱是是轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction），它它是指細(xì)菌基基因被一個(gè)噬噬菌體從一個(gè)個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到到另一個(gè)細(xì)菌菌的過程。轉(zhuǎn)染（transfection）是是由轉(zhuǎn)化和感感染兩個(gè)詞構(gòu)構(gòu)成的新詞，，指真核細(xì)胞胞主動(dòng)攝取或或被動(dòng)導(dǎo)入外外源DNA片片段而獲得新新的表型的過過程?；蚬こ讨械牡氖荏w細(xì)胞又又叫宿主細(xì)胞胞，分為兩類類：原核細(xì)胞（如大腸桿菌菌、枯草桿菌菌等）和真核細(xì)胞（如酵母細(xì)胞胞、哺乳動(dòng)物物細(xì)胞及昆蟲蟲細(xì)胞等）。。1、容易接納納重組分子。。2、對(duì)載體的的復(fù)制擴(kuò)增無無嚴(yán)格限制。。3、不存在特特異的內(nèi)切酶酶降解外源DNA。4、不對(duì)外源源DNA進(jìn)行行修飾。5、還需根據(jù)選用的載載體及其所具具備的篩選標(biāo)標(biāo)記。如質(zhì)粒pBR322用氨芐青霉素素抗性基因（（Ampr）和四環(huán)素抗抗性基因（Tetr）作篩選標(biāo)記記，受體細(xì)胞胞則用對(duì)Amp和Tet敏感的大腸桿桿菌HB101細(xì)胞。將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞胞的方法很多多，應(yīng)根據(jù)實(shí)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、受受體細(xì)胞種類類、外源基因因大小等不同同來選擇。導(dǎo)入方法大致致分為三類⑴化學(xué)方法：：如CaCl2轉(zhuǎn)化法、磷酸酸鈣共沉淀法法。在磷酸鈣鈣DNA共沉沉淀方法中將將被轉(zhuǎn)化的DNA同正在在溶液中形成成的磷酸鈣微微粒共沉淀后后，通過內(nèi)吞吞作用進(jìn)入受受體細(xì)胞。另另外還有DEAE─葡聚聚糖轉(zhuǎn)化法等等。⑵物理方法：：如電脈沖介導(dǎo)導(dǎo)法、顯微注注射法、基因因發(fā)射槍一類類的顆粒轟擊擊技術(shù)等。在在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)對(duì)體積較大的的受精卵細(xì)胞胞或胚胎干細(xì)細(xì)胞，可將目目的基因重組組體通過微吸吸管直接注射射入細(xì)胞核，，即顯微注射射法，此法需需要精密儀器器及高超技術(shù)術(shù)。⑶生物方法：：包括原生質(zhì)融融合法、脂質(zhì)質(zhì)體介導(dǎo)法，，以及λ噬菌菌體的體外包包裝感染法和和逆轉(zhuǎn)錄病毒毒和DNA病病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染法。其中中重組逆轉(zhuǎn)錄錄病毒和重組組DNA病毒毒（如腺病毒毒）轉(zhuǎn)染受體體細(xì)胞目前常常應(yīng)用于遺傳傳疾病或腫瘤瘤的基因治療療中?；蚱危ㄌ靥貏e是純化的的DNA）很很難直接導(dǎo)入入受體細(xì)胞，，通常將受體體細(xì)胞預(yù)先加加以處理，使使其提高基因因?qū)爰?xì)胞的的效率。例如如用低溫CaCl2（冰?。┨幚砝泶竽c桿菌，，可以大大提提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化效率。這這種經(jīng)過預(yù)處處理的、容易易導(dǎo)入外源核核酸分子的受受體細(xì)胞被稱稱作“感受態(tài)態(tài)細(xì)胞”（competentcell）。。感受態(tài)細(xì)胞Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（（大腸桿菌，，革蘭氏陽性性）1970年建立了此此技術(shù)，其原原理是與細(xì)菌菌外膜磷脂在在低溫下形成成液晶結(jié)構(gòu)，，并發(fā)生收縮縮作用，使細(xì)細(xì)胞出現(xiàn)空隙隙，細(xì)菌這時(shí)時(shí)的狀態(tài)就是是感受態(tài)。六、陽性克隆隆的篩選與鑒鑒定通過轉(zhuǎn)化、感感染、轉(zhuǎn)染等等方式，重組組體DNA分分子被導(dǎo)入受受體細(xì)胞，經(jīng)經(jīng)適當(dāng)涂布的的培養(yǎng)基培養(yǎng)養(yǎng)得到大量轉(zhuǎn)化子菌落或或轉(zhuǎn)染噬菌斑斑。因?yàn)槊恳恢亟M組體只攜帶某某一段外源基基因，而轉(zhuǎn)化化或轉(zhuǎn)染時(shí)每每一受體菌又又只能接受一一個(gè)重組體分分子，所以設(shè)設(shè)法將眾多的的轉(zhuǎn)化菌落或或噬菌斑區(qū)分分開來，并鑒定哪一菌落落或噬菌斑所所含的重組DNA分子確確實(shí)帶有目的的基因，即可得到目目的基因的克克隆，這一過過程即為篩選（screening）。根據(jù)載體體系系、宿主細(xì)胞胞特性及外源源基因在受體體細(xì)胞表達(dá)情情況不同，可可采取不同的的篩選方法。。遺傳表型改變變篩選法如果克隆載體體攜帶有某種種抗藥性標(biāo)志志基因，如Ampr或Tetr，轉(zhuǎn)化后只有有含這種抗藥基基因的轉(zhuǎn)化子子細(xì)菌才能在含該抗生素的培培養(yǎng)板上生存并形成成菌落，這樣樣就可將轉(zhuǎn)化化菌與非轉(zhuǎn)化化菌區(qū)別開來來。如果重組DNA時(shí)將外源源基因插入標(biāo)標(biāo)志基因內(nèi)，，如插入Tetr內(nèi)，使標(biāo)志基基因Tetr失活，陽性重重組子則不能能在含有Tet的培養(yǎng)板板上生長。用用插入失活篩選的重組子子載體往往帶帶有另一個(gè)抗抗生素抗性基基因如Ampr，因此可以通通過雙抗生素對(duì)照照篩選，即陽性轉(zhuǎn)化化子可以在含含Amp的培培養(yǎng)板上生長長而不能在含含Tet的培培養(yǎng)板上生長長。顯色反應(yīng)------藍(lán)藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)當(dāng)然，非目的的基因插入的的載體或自身身環(huán)化的載體體導(dǎo)入的受體體菌也能在含含抗生素的培培養(yǎng)板上生長長，造成假陽性克隆，因此抗菌標(biāo)標(biāo)志篩選只能能是初篩（噬噬菌體載體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化菌形成的的噬菌斑也可可以進(jìn)行初篩篩），還需要要進(jìn)一步確定定重組體是否否含有目的基基因。雙抗生素對(duì)照照篩選電泳篩選法直接提取重組組DNA進(jìn)行行核酸凝膠電電泳。DNA的電泳遷移移率與其分子子量的大小成成反比。因此此那些帶有外外源DNA的的重組體分子子量大于空載載體DNA，，在凝膠中““跑得慢”。另外用不同的的限制性內(nèi)切切酶切割重組組DNA，分分析酶切圖譜，也可進(jìn)一步步驗(yàn)證陽性克克隆。分子雜交法篩篩選核酸分子雜交交廣泛應(yīng)用于于鑒別陽性重組組體、篩選基因、確定DNA同源性、研研究基因定位位等，是現(xiàn)代代分子生物學(xué)學(xué)和基因工程程中最基本、、最重要的技技術(shù)之一。主要方式是將將待雜交的核核酸分子固定定在適當(dāng)?shù)闹еС治锷?，用用放射性?biāo)記記或生物素等等非放射性標(biāo)標(biāo)記的探針與被固定的分子子雜交，以檢測目的的DNA或RNA分子存存在與否及其其位置等。將轉(zhuǎn)化后得到到的菌落或噬噬菌斑原位轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到硝酸纖纖維素濾膜（（nitrocellulosefiltermembrane，NC膜）上，得到到一個(gè)與平板板菌落或噬菌菌斑分布完全全一致的復(fù)制制品。原位裂解細(xì)胞胞，堿變性，，核酸分子被被固定于膜上上。然后加入標(biāo)記記的DNA或RNA探