分子病毒學(xué)講義RNAiandVirology

思考題什么是基因沉默(genesilencing)?什么是siRNA、RNAi？舉例說(shuō)明RNAi在醫(yī)學(xué)病毒學(xué)中有哪些應(yīng)用？1RNA干擾

在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用

2009.3.12醫(yī)學(xué)分子微生物學(xué)2主要內(nèi)容RNAi的概念發(fā)現(xiàn)作用機(jī)制特點(diǎn)在醫(yī)學(xué)病毒學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用3定義基因沉默(genesilencing)指生物體特定基因由于種種原因不能表達(dá)。RNA干擾

（RNAinterference，RNAi）4基因沉默基因沉默分為兩種：

轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)

指基因在細(xì)胞核內(nèi)RNA合成受阻導(dǎo)致基因沉默

轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)

指基因在細(xì)胞核內(nèi)能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，在胞漿內(nèi)卻無(wú)相應(yīng)的mRNA存在的現(xiàn)象。5定義RNAi由dsRNA介導(dǎo)的有特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象。（RNAiisdsRNA-inducedgenesilencing.）RNAi主要屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)RNA干擾

（RNAinterference，RNAi）6RNAi現(xiàn)象是生物普遍存在基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種方式，是RNA水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方式，是生物界古老而且進(jìn)化上高度保守的現(xiàn)象之一；RNAi能高效特異的阻斷基因的表達(dá)；已經(jīng)證實(shí)植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA介導(dǎo)的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）現(xiàn)象均屬于RNAi在不同物種的表現(xiàn)形式。在基因表達(dá)調(diào)控和基因功能研究中發(fā)揮重要作用，在藥物靶基因的篩選、抗病毒、腫瘤基因治療等領(lǐng)域有很好的發(fā)展前景。

7RNAi的發(fā)現(xiàn)

90年代初，RichJorgensen的設(shè)想

---發(fā)現(xiàn)“共抑制”現(xiàn)象(cosuppression)×8RichJorgensen：“cosuppression”9RNAi的發(fā)現(xiàn)

1992年，Romano和Macino等證明真菌也有類似現(xiàn)象

---基因壓制

(“quelling”inNeurospora

crassa)1995年，SuGuo和kemphues的秀麗線蟲(chóng)(C.elegans)實(shí)驗(yàn)

---表明RNA干擾現(xiàn)象的存在1998年，AndrewZ.Fire等明確了dsRNA介導(dǎo)的RNAi現(xiàn)象；1999年，Hunter等印證了Fire等提出的RNAi現(xiàn)象是dsRNA引起的結(jié)論；

1011DiscoveryofRNAidsRNAinjectC.elegansWt,Notstained

Wt,

UninjectedWt+AntisenseRNAWt+dsRNAsenseantisenseMex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridization12RNAi的作用機(jī)制

長(zhǎng)鏈dsRNA在ATP參與下，被“Dicer”酶切割成20~25nt的

siRNA(smallinterferingRNA);

?“Dicer”酶：RNA酶Ⅲ家族核酸酶，依賴ATP核酸內(nèi)切酶；

?Dicer作用底物：長(zhǎng)度200～500nt左右的dsRNA；

?Dicer作用后的產(chǎn)物：dsRNA經(jīng)切割后形成21～25nt的siRNA；

RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體

(RISC，RNA-inducedsilencing

complex)識(shí)別并降解靶mRNA;

?RISC組成：siRNA、解旋酶、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、ATP等；

RNAi的放大效應(yīng)；13RNAi的作用機(jī)制

(RISC)RNAi的放大效應(yīng)14siRNAsstructure19ntduplex2nt3’overhangs特點(diǎn)：5’末端為pi，3’末端為-OH，并且有2個(gè)突出的單鏈核苷酸15Tuschl,2002theantisensestrandofthesiRNAguidescleavagesteptwo:16RNAi的特點(diǎn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)特異性高高效性需要ATP

可遺傳性及遠(yuǎn)距離效應(yīng)17RNAi的應(yīng)用基因功能的研究疾病的治療cancerviralinfectionparasiticinfectiongeneticdisease18研究基因的功能：簡(jiǎn)單有效代替基因敲除(knockout)的遺傳工具“剔降”(knockdown)

防御病毒感染：研究發(fā)現(xiàn)，利用siRNAs可有效抑制病毒復(fù)制或阻止病毒的侵染，為進(jìn)一步治療病毒性疾病奠定了基礎(chǔ)。

HIV、肝炎病毒、皰疹病毒、登革病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒、HPV-16等。RNAi在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用19RNAi與HIV－靶向病毒RNA的RNAi機(jī)制：

－沉默與HIV復(fù)制密切相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)：如：CD4受體和CCR5/CXCR4聯(lián)合受體的mRNAs

TheHumanImmunodeficiencyVirus(HIV)LifeCycleandRNAInterference.20HIV基因結(jié)構(gòu)21RNAi與HIVSuppressionofCXCR4bysiRNA

22RNAi與肝炎病毒HBV：Shlomai和Shaul將HBV的X-siRNA和core-siRNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)HBV的產(chǎn)生減少了20倍。HCV：針對(duì)HCVRNA的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞4天后，可使細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的HCVRNA降低80倍。

RNAi與流感病毒Ge等針對(duì)流感病毒的不同基因設(shè)計(jì)了20種siRNA，結(jié)果以核蛋白(NP)和RNA聚合酶(PA)基因的siRNA對(duì)流感病毒感染有抑制作用。RNAi與其它病毒針對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒中編碼衣殼蛋白、病毒聚合酶的mRNA的siRNA，可以抑制病毒復(fù)制，加速清