生態(tài)毒理學(xué)6課件

研究生物富集的方法2.4研究生物富集的方法

生物富集的研究，可在個體（單獨(dú)生物種）和食物鏈兩個水平上進(jìn)行。前述的許多富集規(guī)律就是在個體水平研究的基礎(chǔ)上得出的。無論在哪個水平上的研究，都可以采取野外采樣調(diào)查、室內(nèi)分析的方法和室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)的方法。

前者的優(yōu)點(diǎn)在于污染物的富集是各種因素綜合作用的結(jié)果，與實(shí)際情況相符；后者的優(yōu)點(diǎn)在于影響富集的各種因素便于控制，便于分析各個因素各自的作用和它們的綜合作用。也可以將兩種方法結(jié)合，互相印證。2.4.1模擬研究

模擬研究的方法是在一個容器內(nèi)，栽培和放養(yǎng)若干種生物，并按食物、營養(yǎng)關(guān)系組成若干條食物鏈。在這樣的生態(tài)系統(tǒng)中，研究污染物在食物鏈中的遷移、富集規(guī)律。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將放射性標(biāo)記農(nóng)藥涂在石英砂、植物上或直接加入水相中。間隔一定時間后，測定砂和水中各種生物的放射性標(biāo)記農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)的目的是：

(1)水相中放射性農(nóng)藥的污染速度；

(2)在生態(tài)系統(tǒng)中．農(nóng)藥對生物的毒害作用；

(3)水相和各種生物體內(nèi)，放射性農(nóng)藥代謝、變化情況；

(4)測定農(nóng)藥在各生物體內(nèi)的富集系數(shù)。

把5.0mg的14C-DDT（1%丙酮溶液）涂在高粱葉上，一個月后測定結(jié)果：調(diào)查試驗(yàn)研究

確定一個污染區(qū)，以污染源為中心，調(diào)查污染物在環(huán)境(氣、水、土)中的含量、時空分布規(guī)律；生物對環(huán)境中污染物的富集規(guī)律以及污染物在生態(tài)系統(tǒng)中沿食物鏈逐級富集的規(guī)律以及對人體的危害。（一）環(huán)境調(diào)查大氣、水、土壤（二）植物調(diào)查（三）動物調(diào)查

第六章環(huán)境污染物的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)大綱環(huán)境污染物生態(tài)毒性作用的特點(diǎn)分子水平的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)細(xì)胞、組織及器官水平的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)個體水平的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)種群、群落及生態(tài)水平的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)景觀及全球水平的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)1.涉及面廣、范圍大，接觸污染的生物種類多、數(shù)量大環(huán)境污染物的生態(tài)效應(yīng)特點(diǎn)環(huán)境污染物的生態(tài)效應(yīng)特點(diǎn)2、在不同生物學(xué)水平上產(chǎn)生毒性作用環(huán)境污染物的生態(tài)效應(yīng)特點(diǎn)3、低濃度、長時間、反復(fù)作用結(jié)果

2）引起三致作用：某些環(huán)境污染物可進(jìn)入懷孕母體，通過胎盤進(jìn)入胎兒引起胎盤中毒，導(dǎo)致死胎或流產(chǎn)，或者影響胎兒生長發(fā)育而產(chǎn)生畸形。環(huán)境污染物的生態(tài)效應(yīng)特點(diǎn)3、低濃度、長時間、反復(fù)作用結(jié)果1984年，12月3日，美國聯(lián)合碳化物公司在印度的波爾市農(nóng)藥廠用異氰酸甲酯制造殺蟲劑，由于毒氣泄漏造成重大急性中毒事件致該市2500多人死亡。環(huán)境污染物的生態(tài)效應(yīng)特點(diǎn)4、多種途徑進(jìn)入體內(nèi)環(huán)境污染物的生態(tài)效應(yīng)特點(diǎn)4、多種途徑進(jìn)入體內(nèi)(高等植物)環(huán)境污染物的生態(tài)效應(yīng)特點(diǎn)5、多種污染物同時存在、作用類型多樣、作用機(jī)制復(fù)雜協(xié)同相加拮抗獨(dú)立20一概述

生態(tài)系統(tǒng)污染物進(jìn)入機(jī)體后，首先將導(dǎo)致機(jī)體一系列的生物化學(xué)變化。這些變化廣義上說可分為兩種：一種是用來保護(hù)生物體抵抗污染物的傷害，稱之為防護(hù)性生化反應(yīng)。防護(hù)性生化反應(yīng)的機(jī)理是通過降低細(xì)胞中游離污染物的濃度，從而防止或限制細(xì)胞組成部分發(fā)生可能的有害反應(yīng)，消除對機(jī)體的影響。另一種不起這種作用，稱之為非防護(hù)性生化反應(yīng)。21一概述

要確定某種污染物對環(huán)境造成的危害程度，就需要檢測并衡量其引起的生物效應(yīng)。這對污染物質(zhì)的鑒定和來源分析十分有用。生物監(jiān)測就是根據(jù)化學(xué)物質(zhì)能夠引起生物效應(yīng)的原理進(jìn)行的。作為生物標(biāo)志物，生化水平的生物效應(yīng)應(yīng)該有著很明顯的優(yōu)勢

；與更高層次的生物組織水平相比較，生化系統(tǒng)的改變能更為靈敏地起到指示作用。

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所討論的酶和蛋白質(zhì)系統(tǒng)與特定的有毒化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生的生物效應(yīng)有關(guān)。在許多情況下，這些效應(yīng)具有一定的普遍性，然而導(dǎo)致同樣的毒性效應(yīng)必然會有同一個或幾個系統(tǒng)在起作用。目前對環(huán)境污染物產(chǎn)生效應(yīng)的主要系統(tǒng)有：一概述24一概述

1)細(xì)胞色素P450單加氧酶是一種蛋白質(zhì)，與有機(jī)化合物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化有關(guān)，導(dǎo)致分子變化和有毒代謝物的活化或是鈍化。

2)金屬硫蛋白是一種低相對分子質(zhì)量能與金屬結(jié)合的蛋白質(zhì)，與重金屬的整合及代謝有關(guān)。

3)應(yīng)激蛋白或熱沖擊蛋白是一組可以用不同物理?xiàng)l件和化學(xué)制劑誘導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)。其中的一些被認(rèn)為在保護(hù)細(xì)胞使其免受環(huán)境干擾中起著重要作用。另一些與各種基因的調(diào)節(jié)有關(guān)。

26二細(xì)胞色素P450

細(xì)胞色素P450(或簡稱P450)指的是轉(zhuǎn)化有機(jī)化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)混合功能氧化酶反應(yīng)的一系列酶。由這些酶催化的反應(yīng)一般被統(tǒng)稱為或是單加氧化酶反應(yīng)。

通過影響化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞色素P450酶可能會產(chǎn)生某種特定的無毒化合物，但是也可能大大增強(qiáng)化學(xué)物質(zhì)的毒性。

P450的誘導(dǎo)能對有機(jī)體承載的毒物含量或是有機(jī)體對環(huán)境中化學(xué)誘導(dǎo)物暴露程度起到靈敏的指示作用。

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用P450誘導(dǎo)來進(jìn)行污染物的監(jiān)測有很多優(yōu)點(diǎn)。

1.

大多數(shù)的有毒物質(zhì)都能誘導(dǎo)P450作用；

2.P450是生物暴露在有毒物質(zhì)中產(chǎn)生效應(yīng)最及時、最敏感的指標(biāo)。

3.可以應(yīng)用很多現(xiàn)代技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測。因此，這種方法在未來幾十年中仍然有著很大的發(fā)展?jié)摿?。二?xì)胞色素P45028三金屬硫蛋白

金屬硫蛋白指的是一些相對分子質(zhì)量低的、富含半胱氨酸的，能夠結(jié)合金屬的蛋白或多肽。無論在動物界，還是在植物界和真核生物界，都能夠發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白。鎬、銅、鋅、汞、鉆、鎳、鈕、銀等重金屬都能夠誘導(dǎo)金屬硫蛋白的合成。由于已經(jīng)有一些科學(xué)基礎(chǔ)和測定金屬硫蛋白的合成與金屬化合物的方法，金屬硫蛋白可以作為指示過度暴露于有毒金屬的生物標(biāo)志物，并且具有一定的優(yōu)勢。30四應(yīng)激蛋白質(zhì)

近來，日益明顯地作為對環(huán)境脅迫的反應(yīng)，所有細(xì)胞都經(jīng)歷著基因表達(dá)的變化。由于最開始發(fā)現(xiàn)于高溫暴露中，因此將這種反應(yīng)最初被稱為熱沖擊反應(yīng)。同時這種反應(yīng)能被包括缺氧癥、金屬、外源異生物質(zhì)在內(nèi)的多種物理和化學(xué)脅迫誘導(dǎo)，所以現(xiàn)在它被稱為應(yīng)激蛋白反應(yīng)，與這種反應(yīng)相聯(lián)系的基因表達(dá)的變化相當(dāng)迅速，并導(dǎo)致應(yīng)激蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)合成與積累。

31四應(yīng)激蛋白質(zhì)

應(yīng)激蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物，主要是熱沖擊蛋白質(zhì)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白。許多被特定壓力因素(包括血紅素氫氧基和金屬硫蛋白)誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)，也可以被歸入應(yīng)激蛋白質(zhì)的廣義種類。但是這些蛋白質(zhì)將在其他部分加以討論。

應(yīng)激蛋白質(zhì)可以作為環(huán)境污染生物標(biāo)志物的理想候選指標(biāo)，其原因有三個：一是它們是細(xì)胞自我保護(hù)反應(yīng)的一部分；二是它們被多種多樣的環(huán)境壓力因子所誘導(dǎo)；三是從微生物到人的所有生物中的高度保守性。32五第二階段酶

外來化合物的生物轉(zhuǎn)化常常是有順序的反應(yīng)。第一步(階段1)通常是一個氧化過程，引入了一個如羥基基團(tuán)的極性部分。其后的反應(yīng)包括一個第二類酶催化反應(yīng)，稱其為第二階段反應(yīng)或連接反應(yīng)。第二階段酶(又稱結(jié)合酶)將代謝產(chǎn)物與細(xì)胞中多種高濃度水溶性內(nèi)生化合物連接。研究最廣而且或許是最重要的第二階段酶是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶和硫轉(zhuǎn)移酶。33六以氧化為介質(zhì)的反應(yīng)

近些年生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中關(guān)于自由基生物學(xué)和氧化壓力方面的研究已得到加強(qiáng)。這些研究闡述了由內(nèi)源性或外源異生物質(zhì)引起氧自由基形成、抗氧化防御機(jī)理和超越解毒途徑的氧自由基流的毒性。近些年，對各種生物中(特別是水生動植物)暴露于環(huán)境污染物的生物體中有關(guān)氧化壓力的反應(yīng)的比較研究結(jié)果表明，在該領(lǐng)域有可能形成有用的生物監(jiān)測方法學(xué)。

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如今研究所得結(jié)果大大推動了這一領(lǐng)域中的持續(xù)研究。在基于自由基生物學(xué)的實(shí)用生物標(biāo)志物得到廣泛應(yīng)用以前，還需要繼續(xù)研究：

1.對相關(guān)系統(tǒng)的正常生理學(xué)和環(huán)境的影響研究；

2.由暴露于多種外源異生物質(zhì)而引起的效應(yīng)研究。值得注意的是氧化壓力包含了一系列復(fù)合的現(xiàn)象，因此一個單獨(dú)的反應(yīng)也許不可能為此提供一個廣譜的標(biāo)志物。六以氧化為介質(zhì)的反應(yīng)35

生物對氧化的反應(yīng)為評價各種強(qiáng)氧化的化學(xué)污染物效應(yīng)提供了有用的方法。這一類化合物不僅包括了大氣氧化物（如O3、NOX和SO2），還有其他的直接氧化劑（如H2O2、亞硝酸鹽、氯等），以及具有氧化活性的化合物（如芳香醌、硝基芳香化合物等）。六以氧化為介質(zhì)的反應(yīng)36七血紅素和卟啉

在過去的15年中，哺乳動物生態(tài)毒理學(xué)中一項(xiàng)關(guān)鍵性研究是利用化學(xué)性誘導(dǎo)產(chǎn)生的血紅素的改變作為暴露和效應(yīng)的生物標(biāo)志物。其所闡明的許多化學(xué)反應(yīng)已被證明在低劑量和早期檢測中十分有效。這一基本的細(xì)胞途徑的改變在反應(yīng)金屬/非金屬和有機(jī)物效應(yīng)十分明顯。37七血紅素和卟啉

血紅素/卟啉途徑是血紅素蛋白和各種細(xì)胞色素合成的必要途徑。研究表明，一些試劑如鉛、砷、汞、PCBS,二，六氨苯和乙醇等化合物都會高度特異性地導(dǎo)致某一血紅素途徑的酶發(fā)生變化，并同時伴隨有尿樣中的血紅素前體和卟啉的增加。并研究了這種干擾與細(xì)胞損傷的聯(lián)系，以及與細(xì)胞損傷相關(guān)的微結(jié)構(gòu)、形態(tài)變化等。38八污染對酶的抑制作用

與酶的誘導(dǎo)作用相反，一些環(huán)境污染物可抑制酶的活性（如腺苷三磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、蛋白磷酸酶等）。酶活性的抑制可分為不可逆性抑制、非競爭性抑制和競爭性抑制。

除上述抑制外，有些污染物是通過生成中間代謝產(chǎn)物抑制酶活性，造成生物化學(xué)損害。39

不可逆性抑制是由于污染物與酶蛋白的活性中心功能基團(tuán)不可逆性結(jié)合而引起的。如有機(jī)磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制作用。非競爭性抑制是一種可逆抑制，污染物與酶分子的結(jié)合位置不是底物的結(jié)合位置，因此增加底物濃度，不能使抑制作用逆轉(zhuǎn)。競爭性抑制一般取決于抑制劑的濃度與底物濃度的相對比例。八污染對酶的抑制作用40九脫氧核糖核酸(DNA)變化

脫氧核糖核酸是生物體內(nèi)重要的大分子，也是生物體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)。DNA可以受到不同途徑的損傷，如正常細(xì)胞活動過程中的損傷；紫外線和放射性物質(zhì)的直接損傷；外源性化合物及其活性代謝產(chǎn)物與DNA結(jié)合等。

DNA發(fā)生損傷的生物學(xué)后果是嚴(yán)重的，但細(xì)胞本身具有修復(fù)能力，一旦損傷發(fā)生，修復(fù)能力迅速被誘導(dǎo)，各種修復(fù)酶增加并被活化。如果損傷的DNA不能被修復(fù)，則產(chǎn)生DNA結(jié)構(gòu)和功能影響，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或細(xì)胞突變，產(chǎn)生遺傳疾病。41九脫氧核糖核酸(DNA)變化

大量的研究表明，外源性化合物及其活性代謝產(chǎn)物能引起DNA損傷。對生物機(jī)體暴露于污染物后DNA加合物形成有不同的研究方法：①放射性標(biāo)記法和薄層層析分析；②鑒定特異加合物方法，如分光光度法，層折技術(shù)、酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)等。

③現(xiàn)代分子生物學(xué)方法：彗星實(shí)驗(yàn)，微核實(shí)驗(yàn)，SSCP，RAPD，DGGE，RFLP等。42

化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的DNA損傷不僅反映了作用于DNA的多種化合物質(zhì)的綜合效應(yīng)，也反映了化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)的代謝、組織中的分布、生物可利用性和解毒作用等，反映了機(jī)體對DNA損傷的修復(fù)能力。

DNA損傷的修復(fù)是生物保持遺傳機(jī)構(gòu)相對穩(wěn)定的重要因素。目前了解比較清楚的修復(fù)途徑有以下幾種。九脫氧核糖核酸(DNA)變化43光復(fù)活修復(fù)：是最簡單、最特異性的酶催化修復(fù)過程。由可見光(波長310—500nm)提供能量，光復(fù)活酶與嘧啶二聚體結(jié)合，催化解聚，使DNA恢復(fù)到原來狀態(tài)，酶即釋放，繼續(xù)參與下次修復(fù)。在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)此種光復(fù)活酶。九脫氧核糖核酸(DNA)變化44切除修復(fù)：

通過切除DNA的損傷部位，再重新合成，并恢復(fù)切除的DNA序列。主要有：內(nèi)切、外切、修補(bǔ)DNA聚合酶催化三種方式。九脫氧核糖核酸(DNA)變化切除修復(fù)示意圖45九脫氧核糖核酸(DNA)變化復(fù)制后修復(fù)：①復(fù)制后重組修復(fù)。DNA聚合酶進(jìn)行復(fù)制時，于親鏈損傷區(qū)子鏈留下800-1000個核苷酸的缺口，然后，DNA分子的姐妹鏈發(fā)生重組，缺口與末損傷的姐妹鏈相對時，以此姐妹鏈作修復(fù)模板，由DNA聚合酶及連接酶進(jìn)行修復(fù)并連結(jié)。②分支移動修復(fù)。當(dāng)DNA復(fù)制在損傷處受阻時，新合成的子鏈分支移動。原已解螺旋的親鏈重新纏繞，因損傷而復(fù)制受阻的短子鏈利用正常子鏈為模板修補(bǔ)合成。46

除此以外，還有誘導(dǎo)性修復(fù)和易錯修復(fù)(又稱SOS系統(tǒng))。許多因