重組人胰島素 信息資料

CN1177928A［中文］發(fā)明名稱一生產(chǎn)人胰島素出】主n申請(qǐng)?zhí)朇N94195231申請(qǐng)日1994.12.29公開(kāi)（公告）號(hào)CN1177928A公開(kāi)（公告）日1998.04.01IPC分類號(hào)A61K38/28;C12N15/17申請(qǐng)（專利權(quán)）人生物技術(shù)通用公司；發(fā)明人J?R?哈特曼;S?口德羅維茨;M?戈雷基；優(yōu)先權(quán)號(hào)優(yōu)先權(quán)日申請(qǐng)人地址美國(guó)新澤西州；摘要［支持框選翻譯］簡(jiǎn)體中文->英文英文->簡(jiǎn)體中文其他語(yǔ)種提供了改進(jìn)且有效的通過(guò)折疊胰島素原雜交多肽來(lái)生產(chǎn)重組人胰島素的方法。摘要附圖發(fā)明名稱--Generationofhumaninsulin出】主n申請(qǐng)?zhí)朇N94195231申請(qǐng)日1994.12.29公開(kāi)（公告）號(hào)CN1177928A公開(kāi)（公告）日1998.04.01IPC分類號(hào)A61K38/28;C12N15/17;C12N15/16

申請(qǐng)(專利權(quán))人BIOTECHNOLOGYGENERALCORP;發(fā)明人HARTMANJR;MENDELOVITZS;GORECKIM;優(yōu)先權(quán)號(hào)CN94195231優(yōu)先權(quán)日1994.12.29摘要［支持框選翻譯］申請(qǐng)(專利權(quán))人BIOTECHNOLOGYGENERALCORP;發(fā)明人HARTMANJR;MENDELOVITZS;GORECKIM;優(yōu)先權(quán)號(hào)CN94195231優(yōu)先權(quán)日1994.12.29Animprovedandefficientprocessfortheproductionofrecombinanthumaninsulinbyfoldingofaproinsulinhybridpolypeptideisprovided.摘要附圖生產(chǎn)胰島素的方法包括：在允許形成正確二硫鍵的條件下，折疊含胰島素原的雜種多肽；使折疊的、二硫鍵鍵合的雜種多肽經(jīng)酶促裂解以產(chǎn)生胰島素；純化胰島素。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)還包括在約pH8.5-12.0,約4-37^將雜種多肽保溫約1-30小時(shí)。根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中在存在抗壞血酸的條件下進(jìn)行保溫。根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中pH為11.0-11.25。根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中pH為11.0-11.25。根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中在折疊混合物中，抗壞血酸的濃度為每摩爾SH基約2摩爾抗壞血酸。根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述保溫時(shí)間為約5小時(shí)。根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述保溫時(shí)間為約5小時(shí)。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)還包括：(I)將pH調(diào)到約8.8-9.0；和(ii)在16-37^用胰蛋白酶和羧肽酶B裂解雜種多肽30分鐘-16小時(shí)。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)還包括用DEAE-Sepharose層析和RP-HPLC純化。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)還包括用超濾和CM-Sepharose層析純化。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)還包括用DEAE-Sepharose層析和苯基-Sepharose層析。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用ATCC保藏號(hào)為69361的質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)胰島素原雜種多肽。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用ATCC保藏號(hào)為69363的質(zhì)粒p入BAST-LAT表達(dá)胰島素原雜種多肽。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用ATCC保藏號(hào)為69362的質(zhì)粒pBAST-LAT表達(dá)胰島素原雜種多肽。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)處理含編碼雜種多肽之DNA的細(xì)菌細(xì)胞，以便DNA指導(dǎo)所述多肽的表達(dá)，從而得到步驟(a)的雜種多肽。根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中從所述細(xì)胞中回收雜種多肽。根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述處理包括存在葡萄糖，甘油或半乳糖的條件下發(fā)酵。根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述回收包括：(I)破壞所述細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞壁或其片段以產(chǎn)生溶胞產(chǎn)物；通過(guò)離心從溶胞產(chǎn)物中分離細(xì)胞內(nèi)沉淀物；和增溶所述沉淀物。含有胰島素原和與所述胰島素原的N-末端相連的前導(dǎo)肽的多肽，其中所述多肽被折疊并含有正確的二硫鍵。根據(jù)權(quán)利要求20的多肽，其中所述前導(dǎo)肽衍生于CuZnSOD的N-末端。根據(jù)權(quán)利要求21的多肽，其中所述前導(dǎo)肽含有62個(gè)氨基酸，其前為氨基酸Met，其后為Arg殘基。根據(jù)權(quán)利要求20的多肽，其中所述胰島素原含有通過(guò)單Arg殘基與胰島素A鏈共價(jià)相連的胰島素B鏈。根據(jù)權(quán)利要求20的多肽，其中所述胰島素原含有通過(guò)二肽Lys-Arg殘基與胰島素A鏈共價(jià)相連的胰島素B鏈。根據(jù)權(quán)利要求20的多肽，其中前導(dǎo)肽的Cys殘基已經(jīng)被Ser殘基所取代。說(shuō)明書生產(chǎn)人胰島素這是美國(guó)系列申請(qǐng)08/175298，1993年12月29日申請(qǐng)的接續(xù)申請(qǐng)。發(fā)明背景在本發(fā)明說(shuō)明書中，用括號(hào)內(nèi)的阿拉伯?dāng)?shù)字列出了各種文獻(xiàn)。在說(shuō)明書后，權(quán)利要求前可以找到這些參考文獻(xiàn)的所有引述。將這些文獻(xiàn)公開(kāi)的所有內(nèi)容均引入本說(shuō)明書作為參考以便更全面地描述本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)的狀態(tài)。胰島素是控制葡萄糖代謝所必需的多肽激素，每天施用給患糖尿病的患者，糖尿病是胰島素供應(yīng)不足而引起的代謝紊亂。體內(nèi)，首先將該激素合成成長(zhǎng)前體分子，隨后加工成由A和B鏈組成的其生物活性形式。更詳細(xì)地說(shuō)，在內(nèi)分泌胰腺的8細(xì)胞內(nèi)，將前原胰島素的基因轉(zhuǎn)錄成mRNA前體，然后剪接生產(chǎn)成熟mRNA。將所述mRNA翻譯成前原胰島素(NH2-前區(qū)-B鏈-C肽-A鏈-COOH)，接著再加工成胰島素原并最終加工成胰島素。該過(guò)程的第一步就是蛋白水解除去前區(qū)，該區(qū)是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體膜來(lái)轉(zhuǎn)移新鏈的疏水信號(hào)序列。在人前原胰島素中，前區(qū)的長(zhǎng)度是24個(gè)氨基酸。在胰島素原中，將變成成熟胰島素的多肽鏈的兩個(gè)區(qū)，B-和A鏈通過(guò)C肽(或C-鏈)彼此相連，所述C肽在N和C末端含有兩對(duì)堿性氨基酸。在大多數(shù)C肽中，這些配對(duì)是Arg-Arg和Lys-Arg。人C肽，包括兩個(gè)側(cè)對(duì)的堿性氨基酸，含有35個(gè)氨基酸。C肽與所述多肽的兩個(gè)部分相連以便有助于在B和A片段之間形成二硫鍵。因此，C肽的作用很大程度上不依賴其結(jié)構(gòu)。事實(shí)上，用較短的合成橋鍵代替仍能適當(dāng)?shù)卣郫B胰島素原分子(1，2)。胰島素原折疊，同時(shí)發(fā)生兩個(gè)鏈間二硫鍵和一個(gè)A鏈二硫鍵的氧化。在成熟化的最后階段，蛋白水解酶在堿性氨基酸處裂解以釋放C肽并形成成熟胰島素(3)。在人胰島素中，A鏈有21個(gè)氨基酸，B鏈有30個(gè)氨基酸。世界上每年胰島素的需求超過(guò)數(shù)噸，而且嚴(yán)重供不應(yīng)求。傳統(tǒng)上，胰島素是從有限的動(dòng)物源中生產(chǎn)的，主要是牛和豬胰腺制品，它們不同于人胰島素，因此會(huì)引發(fā)有害的免疫反應(yīng)。在六十年代完成的研究表明，可以體外生產(chǎn)胰島素。通過(guò)用其S-磺化形式(4)將A和B鏈結(jié)合或通過(guò)自發(fā)再氧化還原的胰島素原(5)來(lái)合成胰島素。后一種方法由于在氧化混合物中蛋白質(zhì)濃度很低，不能用于大規(guī)模生產(chǎn)胰島素。在用胰蛋白酶和羧肽酶B處理后(6)，可以回收胰島素。最近半合成和生物合成的(重組)人胰島素也可以得到。半合成的人胰島素是通過(guò)胰蛋白酶催化B鏈30位的Ala換成Thr(是豬胰島素和人胰島素之間的唯一不同)而從豬胰島素生產(chǎn)的。在大腸桿菌或酵母中生產(chǎn)的重組人胰島素最終將取代所有其它生產(chǎn)途徑?，F(xiàn)在通過(guò)兩種途徑制備半合成重組人胰島素：在大腸桿菌中分開(kāi)生產(chǎn)A和B鏈，然后將其結(jié)合在一起(7,8)，或酶促轉(zhuǎn)變?cè)诖竽c桿菌(1，8)或酵母(2,9沖表達(dá)的胰島素原等多肽。在大多數(shù)情況下，胰島素原是作為雜種蛋白質(zhì)而生產(chǎn)的，以細(xì)胞內(nèi)沉淀蛋白質(zhì)的形式積累。正常純化所述雜交物，然后用CNBr裂解以釋放胰島素原多肽。后者再通過(guò)氧化亞硫酸水解(sulfitolysis)修飾得到胰島素原S-磺酸鹽。然后在還原條件下純化并折疊胰島素原S-磺酸鹽，得到胰島素原(8)。通過(guò)胰蛋白酶和羧肽酶B(6)的聯(lián)合作用將胰島素原轉(zhuǎn)變成胰島素。專利公開(kāi)EP195691(NovoNordiskA/B)描述了分子式為B-Lys-Arg-A的胰島素原以及其用于在酵母中制備胰島素的用途。專利公開(kāi)EP196056B1(ChironCorp.，)描述了用酵母生產(chǎn)的hSOD-胰島素原蛋白質(zhì)。在折疊前，使hSOD-胰島素原蛋白質(zhì)經(jīng)漠化氰裂解和亞硫酸水解。Hoechst在EPO379162中描述了可以將’胰島素前體的錯(cuò)重組體“(即，有不正確或部分不正確分子間二硫鍵的重組胰島素產(chǎn)物)不通過(guò)亞硫酸水解，而是在有機(jī)氧化還原系統(tǒng)的存在的條件下，在含水介質(zhì)中通過(guò)將錯(cuò)重組體與過(guò)量硫醇反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成正確的胰島素產(chǎn)物。在氨基酸或肽基從融合多肽裂解后(化學(xué)或酶促)(發(fā)生在宿主細(xì)胞溶解后)進(jìn)行源(original)亞硫酸水解(sulfitolysis)步驟，因?yàn)槿缓笠獙⒁葝u素前體的6個(gè)半胱氨酸轉(zhuǎn)變成其S-磺酸鹽。在隨后的復(fù)性步驟中，通過(guò)形成三個(gè)正確的二硫鍵而從所述胰島素原S-磺酸鹽生產(chǎn)天然胰島素原。在該復(fù)性步驟，產(chǎn)生了所謂“錯(cuò)重組體”。Hoechst在PCTWO91/03550中還公開(kāi)了制備含所需蛋白質(zhì)(如胰島素原)和“平衡組分”的方法。亞硫酸水解在折疊前完成，而在折疊后，與胰島素原的C-鏈同時(shí)裂解掉“平衡組分”。另外，Hoechst在EP347781B1中描述了“小胰島素原”(B-Arg-A)和其用于致病單-Arg胰島素和胰島素的用途。他們還描述了含有B-Arg-A和“平衡組分”的融合蛋白質(zhì)。在折疊多肽前，用漠化氰裂解“平衡組分”并完成亞硫酸水解。本發(fā)明公開(kāi)了用改進(jìn)并有效的方法生產(chǎn)重組人胰島素。在大腸桿菌中合成含有前導(dǎo)序列的重組胰島素原雜種多肽。部分純化后，在可以進(jìn)行之前折疊的條件下，將其折疊，但仍連接著前導(dǎo)肽。然后通過(guò)用胰蛋白酶和羧肽酶B結(jié)合處理而產(chǎn)生有生物活性的人胰島素，其中這些酶同時(shí)裂解掉了前導(dǎo)肽和C鏈。因此生產(chǎn)的純化人胰島素與天然產(chǎn)生的人胰島素相同。在雜種多肽的CNBr裂解和用于保護(hù)豐富SH基團(tuán)的亞硫酸水解中所涉及的有害和麻煩的過(guò)程在所述新方法中除去了，因?yàn)榭梢詫⑼暾囊葝u素原雜種多肽有效折疊成其天然結(jié)構(gòu)，甚至是在存在前導(dǎo)肽和未保護(hù)的半胱氨酸的情況下。通過(guò)酶促裂解釋放活性重組人胰島素，然后將其純化。附圖的簡(jiǎn)要描述在附圖3-5中所列三個(gè)質(zhì)粒的限制圖譜中，并未鑒定出在這些質(zhì)粒上的所有限制位點(diǎn)。但是，列出了完全理解本發(fā)明所必需的那些限制位點(diǎn)。圖1：通過(guò)酶促裂解表達(dá)質(zhì)粒pBAST-R而產(chǎn)生的折疊的、二硫鍵結(jié)合的胰島素原雜種多肽，從而得到人胰島素。只表明了部分SOD前導(dǎo)序列。圖2：通過(guò)酶促裂解表達(dá)質(zhì)粒pBAST-LAT或質(zhì)粒p入BAST-LAT而產(chǎn)生的折疊的、二硫鍵結(jié)合的胰島素原雜種多肽，從而得到人胰島素。只表明了部分SOD前導(dǎo)序列。圖3：質(zhì)粒pBAST-R的結(jié)構(gòu)，編碼SOD-胰島素原雜種多肽的表達(dá)質(zhì)粒，保藏號(hào)為ATCC69362。圖4：質(zhì)粒pDBAST-LAT的結(jié)構(gòu)，編碼SOD-胰島素原雜種多肽的表達(dá)質(zhì)粒，保藏號(hào)為ATCC69361。圖5：質(zhì)粒p入BAST-LAT的結(jié)構(gòu)，編碼SOD-胰島素原雜種多肽的表達(dá)質(zhì)粒，保藏號(hào)為ATCC69363。圖6：用質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的SOD-胰島素原雜種多肽的氨基酸序列和相應(yīng)的DNA核苷酸序列。圖7：用質(zhì)粒pDBAST-LAT和p入BAST-LAT表達(dá)的SOD-胰島素原雜種多肽的氨基酸序列和相應(yīng)的DNA核苷酸序列。圖8：人胰島素生產(chǎn)，來(lái)自用質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽，作為折疊混合物pH的函數(shù)。在4°C，經(jīng)16小時(shí)，用1mg/ml或0.5mg/ml雜種多肽，在100mM甘油中，于不同pH完成胰島素原雜種多肽的折疊(按實(shí)施例2所述生產(chǎn)的)。37C，pH9用(胰蛋白酶1:500w/w)(Sigma)和羧肽酶B(CPB，Sigma，1:200w/w)將折疊材料處理30分鐘，然后通過(guò)利用1251-胰島素(Amersham)和人重組胰島素(Calbiochem)為標(biāo)準(zhǔn)的放射性免疫檢測(cè)法檢測(cè)免疫反應(yīng)性(IR)。圖9：用質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)人胰島素將胰島素原雜種多肽(按實(shí)施例2所述生產(chǎn)的)溶解在8M脲，濃度為約30mg/ml的5mMHCl，然后用100mM甘油-NaOH稀釋1mg/ml，pH11.0中。在22C(室溫)折疊20小時(shí)。然后用HCl將pH調(diào)到8.8。加入羧肽酶B(1:1000w/w，Sigma)和胰蛋白酶(1：2000w/w，Sigma)在37C將反應(yīng)混合物保溫60分鐘。在用10mMHCl稀釋前，將消化混合物酸化到pH3。在250X4mm，5pLichrosphere100RP-8柱(Merch)上，通過(guò)反相高壓液體層析(RP-HPLC)分析150pl的樣品，所述柱用含31.5%(v/v)乙月青的50mM磷酸四乙胺，162mMNacl4,pH3平衡。用31.5%-40.5%乙青的現(xiàn)象梯度，在75分鐘內(nèi)，以1ml/分的流速使該柱展開(kāi)。檢測(cè)在220nm的吸收值。A：5ug標(biāo)準(zhǔn)胰島素(Boehringer-Mannheim)；B：酶促處理后產(chǎn)生的重組人胰島素；C：折疊的SOD-胰島素原雜種多肽。圖10：質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)人胰島素作為折疊混合物中pH的函數(shù)將胰島素原雜種多肽(按實(shí)施例2中所述生產(chǎn)的)用有標(biāo)明pH值的100mM甘油-NaOH緩沖液稀釋到1mg/ml，然后在22C折疊16小時(shí)。按圖9所述完成酶處理和RP-HPLC分析。根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)胰島素有相同滯留時(shí)間的峰的面積計(jì)算從雜種多肽產(chǎn)生的重組人胰島素的量。圖11：質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)人胰島素作為折疊混合物中抗壞血酸濃度的函數(shù)存在標(biāo)明抗壞血酸濃度的條件下，在100mM甘油-NaOH，pH11.2中，于22C以1mg/ml折疊SOD-胰島素原雜種多肽(按實(shí)施例2所述生產(chǎn)的)。在5和25小時(shí)的折疊過(guò)程后，用胰蛋白酶和羧肽酶B(按圖9)處理樣品。在RP-HPLC(按圖9)上分析重組人胰島素產(chǎn)品。圖12：從質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)的人胰島素的可靠性22°C,,在100mM甘油-NaOH,pH11.2和1.2mM抗壞血酸中，22°C以1mg/ml折疊SOD-胰島素原雜種多肽16小時(shí)。酶處理后（按圖9）,在用20mMTris-HCl,pH8平衡的DEAE-Sepharose柱上層析分析所述混合物。用在20mMTris-HCl,pH8中0-0.4M的NaCl現(xiàn)象梯度洗脫重組人胰島素。收集峰部分，然后用HCl酸化到pH3。再按圖9所述，用RP-HPLC從胰島素樣分子進(jìn)一步純化重組人胰島素。收集主峰，用0.25M乙酸在SephadexG-25柱上脫鹽，然后凍干。用制備于10mMHCl中的樣品（5ug重組人胰島素），在相同的條件下用RP-HPLC分析。A：標(biāo)準(zhǔn)胰島素；B：HPLC純化的重組人胰島素；C：HPLC純化的重組人胰島素和標(biāo)準(zhǔn)胰島素的組合樣品。圖13：從質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)的人胰島素作為蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)在100mM甘油-NaOH，pH11.2中，按標(biāo)明的0.5mg/ml-10mg/ml的終蛋白質(zhì)濃度，折疊SOD-胰島素原雜種多肽（按照實(shí)施例2所述生產(chǎn)的）。用每molSH基2.5mol抗壞血酸補(bǔ)充各折疊混合物。24C（室溫）折疊16小時(shí)。按照?qǐng)D9中的描述完成酶促處理和RP-HPLC分析。圖14：用質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的，來(lái)自粗細(xì)胞內(nèi)沉淀的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)的人胰島素，作為折疊時(shí)間的函數(shù)以每ml約2.6A280的濃度，將細(xì)胞內(nèi)沉淀溶解在20mM甘油-NaOH，33uMEDTA，pH11.2中。用10N氫氧化鈉將pH調(diào)到12。將溶液放置并攪拌10分鐘。用濃縮的鹽酸將pH滴到11.2。加入活化的活性炭（酸洗滌的，Sigma）到0.1%w/v的終濃度，然后將混合物攪拌30分鐘。澄清上清液的A280為約2.15。補(bǔ)充抗壞血酸達(dá)到3mM終濃度。在室溫（22-23C）劇烈攪拌，按所示折疊胰島素原雜種多肽。在試驗(yàn)的不同時(shí)間點(diǎn)（從溶解開(kāi)始），依次取10ml樣品，滴到pH8.8,然后存在50uMZnCl2的條件下，用羧肽酶B（1:1000w/w）和胰蛋白酶（1：2000w/w）消化。按圖9所述，用RP-HPLC分析確定各消化樣品中的胰島素含量。根據(jù)胰島素的增加（消化后），游離SH基降低的水平確定折疊反應(yīng)的進(jìn)展，用Ellman反應(yīng)（16）檢測(cè)后者。本發(fā)明概述本發(fā)明提供了生產(chǎn)人胰島素的方法，包括在允許正確二硫鍵形成的條件下，折疊含胰島素原的雜種多肽，使折疊的，二硫鍵結(jié)合的雜種多肽經(jīng)酶促裂解產(chǎn)生活性人胰島素，然后純化活性人胰島素。本發(fā)明還提供了含胰島素原以及與所述胰島素原N-末端相連的前導(dǎo)肽的多肽，其中所述多肽被折疊，并含有正確的二硫鍵。本發(fā)明的詳細(xì)描述按照并符合布達(dá)佩斯條約對(duì)用于質(zhì)粒目的的微生物保藏之國(guó)際承認(rèn)的要求，將在大腸桿菌中的質(zhì)粒pBAST-R,pDBAST-LAT,p久BAST-LAT于1993年7月26日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心（ATCC）（12301ParklawnDrive,Rochville,Maryland20852）保藏號(hào)分別為69362,69361和69363。如本文所用的，雜種多肽含有與所需多肽共價(jià)相連的前導(dǎo)肽。本發(fā)明的雜種多肽含有胰島素原，優(yōu)選含有作為前導(dǎo)肽的SOD。如本文所用的，折疊包括折疊雜種多肽，所述雜種多肽含有在折疊前，未用CNBr裂解，而且在折疊前未進(jìn)行亞硫酸水解以保護(hù)SH基團(tuán)的胰島素原，其中折疊可以使得在所述雜種多肽中形成正確的二硫鍵。如本文所用的，雜種多肽形成正確的二硫鍵包括在胰島素的CysB7-CysA20，CysB19-CysA20和CysA6-CysA11之間形成三個(gè)二硫鍵（按照成熟胰島素中的編號(hào)標(biāo)注Cys殘基）。如本文所用的，胰島素原含有包括胰島素B,C和A鏈，從N-末端到C-末端的多肽。如本文所用的，胰島素的C-鏈肽含有天然產(chǎn)生的C-肽和任何其它可以通過(guò)胰蛋白酶和羧肽酶B裂解的寡肽，二肽或單氨基酸。如本文所用的，前導(dǎo)肽含有與胰島素B鏈共價(jià)相連的任何肽或多肽，所述前導(dǎo)肽使得可以進(jìn)行折疊并形成二硫鍵，而且可以用胰蛋白酶裂解。前導(dǎo)肽優(yōu)選是SOD。如本文所用的，SOD包括任何實(shí)質(zhì)部分的CuZnSOD或MnSOD的氨基酸序列，而且所述部分不必有SOD的生物學(xué)活性，與天然產(chǎn)生的SOD的氨基酸序列相比，所述部分也不必有相同的氨基酸序列。用本領(lǐng)域已知的方法，如Bauer等人(1985)，Gene，37：73-81可以突變編碼SOD的DNA。前導(dǎo)肽除SOD夕卜，可包括任何其它肽，多肽或蛋白質(zhì)或任何所述肽，多肽或蛋白質(zhì)之任何實(shí)質(zhì)部分的氨基酸序列，其中所述部分既不必有是肽，多肽或蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，與天然產(chǎn)生的肽，多肽或蛋白質(zhì)相比，所述部分也不必有相同的氨基酸序列；然而，前導(dǎo)肽必須允許雜種多肽折疊并形成正確的二硫鍵。如本文所用的，胰島素可以包括天然胰島素的同系物。如本文所用的，胰島素原可以包括天然胰島素原的同系物。如本文所用的，與用本發(fā)明方法生產(chǎn)的胰島素多肽有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“同系物”指與胰島素有基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的生物學(xué)活性的多肽。因此，同系物可以因一個(gè)或多個(gè)非必需氨基酸殘基的增加，缺失或取代而不同于用本發(fā)明方法生產(chǎn)的胰島素多肽，只要所得的多肽保留了胰島素的生物學(xué)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員用熟知的方法，包括，例如用于設(shè)計(jì)制備DNA序列的常規(guī)方法，所述DNA序列用于細(xì)菌表達(dá)多肽之多肽同系物，通過(guò)定點(diǎn)誘變技術(shù)修飾cDNA和基因組序列，構(gòu)建重組蛋白質(zhì)和表達(dá)載體，細(xì)菌表達(dá)多肽以及用常規(guī)生物化學(xué)方法檢測(cè)多肽的生物化學(xué)活性，很容易確定可以增加，缺失或取代哪個(gè)氨基酸(包括可以用哪個(gè)氨基酸進(jìn)行取代)。胰島素同系物的上述定義等同用于胰島素原的同系物。用本發(fā)明方法生產(chǎn)的胰島素同系物的實(shí)例是含有少于天然胰島素之所有殘基的缺失同系物，其中一個(gè)或多個(gè)特定殘基由其它殘基取代的取代同系物以及其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基增加到所述胰島素多肽末端或中間部分的增加同系物，所有這些均有胰島素的生物學(xué)活性。同系物的實(shí)例是在EPO專利申請(qǐng)EP384472中公開(kāi)的類似物以及在“EliLillyandCompanyReporttoShareholder1992”中公開(kāi)的EliLilly的胰島素類似物“Humalog”。本文將基本上相同的氨基酸序列定義為包括氨基酸序列中的取代和/或缺失和/或增加，而且根據(jù)例如由AlbertL.Lehninger，Biochemistry，第二版，WorthPublishersInc.(1975),第4章；Creighton，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，實(shí)踐方法，IPLPressatOxfordUniversityPress,Oxford，England(1989)；和MargaretO.Dayhoff，AtlasofProteinSequenceandStructure,Vol.5,TheNationalBiomedicalResearchFoundation(1972)，Chapter9描述的同源或等同基團(tuán)，可包括最多達(dá)10個(gè)殘基。所述取代是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法，例如Baueretal.，(1985)，Gene37：73-81可以突變編碼胰島素多肽的DNA。胺本文所述，可以將突變序列插入到適宜的表達(dá)載體中，再將所述載體導(dǎo)入到然后再處理的細(xì)胞中，以便突變的DNA表達(dá)多肽同系物。含有編碼含胰島素原之雜種多肽的序列的本發(fā)明質(zhì)?？梢栽诩?xì)菌，酵母，真菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO,雞胚胎，成纖維母細(xì)胞或其它已知的細(xì)胞系中表達(dá)，它們通常還含有在細(xì)菌，酵母，真菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)克隆基因所必需的調(diào)節(jié)元件，隨編碼雜種多肽的核酸這樣定位，以便使其進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件包括與RAN聚合酶結(jié)合的啟動(dòng)子序列和與核糖體結(jié)合的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的質(zhì)粒表達(dá)含胰島素原的雜種多肽。本發(fā)明的專業(yè)人員可以理解：用已知技術(shù)(如通過(guò)定點(diǎn)誘變或插入接頭)可以很容易改變與本申請(qǐng)有關(guān)的保藏的質(zhì)粒以表達(dá)同源多肽。在例如SambrookJ.，F(xiàn)ritsch，E.F.andManiatis,T.(1989)分子克?。簩?shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社中描述了所述技術(shù)。適宜的調(diào)節(jié)元件位于與編碼含胰島素原之多肽的DNA有關(guān)的質(zhì)粒內(nèi)，以便在適宜的宿主細(xì)胞中影響所述雜種多肽的表達(dá)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)元件位于編碼雜種多肽之DNA的附近和上游。本發(fā)明還包括各種核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS），用于提供從編碼含胰島素原之雜種多肽的DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA，以便結(jié)合宿主細(xì)胞內(nèi)的核糖體，如deoRBS。本發(fā)明的質(zhì)粒還含有ATG起始密碼子。編碼含胰島素原之雜種多肽的DNA與ATG起始密碼子同相。本發(fā)明的質(zhì)粒還包括含復(fù)制源點(diǎn)的DNA序列，它們來(lái)自細(xì)菌質(zhì)粒，能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制?？梢詮母鞣N來(lái)源得到適宜的復(fù)制源點(diǎn)，如從質(zhì)粒pBR322（ATCCNo.37016）中得到。本發(fā)明質(zhì)粒含包括含與可選擇或可鑒定表型特征相關(guān)之基因的DNA序列，如藥物抗性基因，如氨芐青霉素抗性，氯霉素或青霉素抗性，當(dāng)質(zhì)粒存在于宿主中時(shí)，所述表型特征就會(huì)顯出?？捎糜诒磉_(dá)編碼雜種多肽（含胰島素原）的載體的實(shí)例是病毒，如細(xì)菌病毒，如噬菌體（如入噬菌體），粘粒，質(zhì)粒和其它載體。用本領(lǐng)域熟知的方法，將編碼含胰島素原之雜種多肽的基因插入到適宜的載體中。例如用常規(guī)的限制核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，可以裂解插入片段和載體DNA以產(chǎn)生剪接配對(duì)的互補(bǔ)末端，然后用DNA連接酶連在一起。另外，可以將含與載體DNA中的限制位點(diǎn)互補(bǔ)之堿基序列的合成接頭與插入DNA相連，然后用在給位點(diǎn)切割的限制酶消化。也可以施用其它方法。優(yōu)選的細(xì)菌宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。適宜大腸桿菌細(xì)胞的適宜是菌株S^733（cytRstrA）或4300，但也可以用其它大腸桿菌菌株和其它細(xì)菌作為質(zhì)粒的宿主。作為宿主的細(xì)菌可以是任何菌株，包括營(yíng)養(yǎng)缺陷型（如A1645），原養(yǎng)型（如A4255）和裂解菌株；F+和F-菌株；含入原噬菌體之CI857阻遏物序列的菌株（如A1645和A4255）以及沒(méi)有deo阻遏物和/或deo基因的菌株（參見(jiàn)歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)030972，1989年2月22日公開(kāi)）。已經(jīng)將大腸桿菌菌株中733和大腸桿菌菌株4300保藏在ATCC，保藏號(hào)分別為69361和69363。用本領(lǐng)域熟知的方法，如R.PNovick（Bacteriol.Review33,210（1969））所述的，所有上述大腸桿菌宿主菌株都可能是它們所攜帶質(zhì)粒的“cured”。本發(fā)明提供了生產(chǎn)胰島素的方法，包括在允許形成正確二硫鍵的條件下折疊含胰島素原的雜種多肽，使（處理）折疊的、二硫鍵鍵合的雜種多肽經(jīng)酶促裂解以產(chǎn)生胰島素，然后純化胰島素。所述胰島素具有市售人胰島素的活性和特性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，折疊包括在4-37°C，將雜種多肽在約pH8.5-12.0保溫約1-30小時(shí)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，折疊包括在存在抗壞血酸的條件下，在4-37C，將雜種多肽在約pH8.5-12.0保溫約1-30小時(shí)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，折疊期間的pH為11.0-11.25。在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，折疊混合物中抗壞血酸的濃度為約每摩爾SH基團(tuán)約2摩爾抗壞血酸。在另一實(shí)施方案中，保溫時(shí)間為約5小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，處理包括將pH調(diào)整到約8.8-9.0,然后在16-37C，用胰蛋白酶和羧肽酶B將雜種多肽裂解約30分鐘到16小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，純化包括DEAE-Sepharose層析和RP-HPLC。在另一實(shí)施方案中，純化還包括超濾和CM-Sepharose層析。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，純化還包括DEAE-Sepharose層析和Phenyl-Sepharose層析。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用保藏于ATCC，保藏號(hào)為69361的質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)雜種多肽。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，用保藏于ATCC，保藏號(hào)為69363的質(zhì)粒p入DBAST-LAT表達(dá)雜種多肽。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，用保藏于ATCC,保藏號(hào)為69362的質(zhì)粒pBAST-LAT表達(dá)雜種多肽。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)處理含編碼雜種多肽之DNA的細(xì)菌細(xì)胞以便DNA指導(dǎo)其表達(dá)然后從所述細(xì)胞中回收雜種多肽，從而得到雜種多肽。設(shè)想處理包括存在葡萄糖，甘油或半乳糖的條件下發(fā)酵。進(jìn)一步設(shè)想從細(xì)胞中回收雜種多肽，包括破壞細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞壁或其片段以產(chǎn)生溶胞產(chǎn)物，通過(guò)離心從溶胞產(chǎn)物中分離細(xì)胞內(nèi)沉淀，溶解沉淀，可選的用層折或超濾純化雜種多肽。本發(fā)明還提供含胰島素原和連于所述胰島素原N-末端之前導(dǎo)肽的多肽，其中所述多肽被折疊并含有正確的二硫鍵。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，前導(dǎo)肽衍生于CuZnSOD的N-末端。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，前導(dǎo)肽含62個(gè)氨基酸，其前為Met，其后為Arg殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素原含通過(guò)單個(gè)Arg殘基，與胰島素A鏈相連的胰島素B-鏈。在另一實(shí)施方案中，胰島素原含通過(guò)二肽Lys-Arg與胰島素A鏈相連的胰島素B鏈。將所述兩種胰島素原分子作為雜種蛋白質(zhì)生產(chǎn)，否則表達(dá)水平極低而且沒(méi)有商業(yè)顯著性。在所有優(yōu)選的實(shí)施方案中，用Ser殘基取代前導(dǎo)肽的Cys殘基。實(shí)施例下列實(shí)施例是為了有助于理解本發(fā)明，但不打算也不應(yīng)當(dāng)以任何方式限制其范圍。實(shí)施例不包括構(gòu)建載體，將編碼所述多肽之基因插入所述載體或?qū)⑺觅|(zhì)粒導(dǎo)入宿主中所用常規(guī)方法的詳細(xì)描述。所述實(shí)施例也不包括檢測(cè)用所述宿主載體系統(tǒng)生產(chǎn)之多肽所用的常規(guī)方法詳細(xì)描述。所述方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的，而且在包括下列實(shí)例的大量文獻(xiàn)中作了描述：Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，2ndedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress.實(shí)施例1構(gòu)建表達(dá)SOD-胰島素原雜種多肽的生產(chǎn)質(zhì)粒pBAST-R，pBAST-LAT和p入BAST-LAT構(gòu)建在deoP1P2或入PL啟動(dòng)子控制下的細(xì)菌表達(dá)載體，它們?cè)诖竽c桿菌中過(guò)是生產(chǎn)雜種蛋白質(zhì)。將胰島素原生產(chǎn)成雜種蛋白質(zhì)，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)含編碼胰島素B-鏈-Lys-Arg-胰島素A-鏈之表達(dá)載體的細(xì)菌生產(chǎn)不出可檢測(cè)的多肽。雜種蛋白質(zhì)含有一個(gè)衍生于CuZnSOD(11)的N-末端的62個(gè)氨基酸長(zhǎng)的前導(dǎo)肽，在該前導(dǎo)肽N-末端前為Met殘基，C-末端后為Arg殘基，該Arg殘基使其與胰島素B鏈相連。胰島素B鏈通過(guò)由Lys-Arg或Arg組成的短C鏈肽與胰島素A鏈相連。原存于SOD的兩個(gè)Cys由Ser殘基取代。A質(zhì)粒pBAST-R構(gòu)建一系列的質(zhì)粒得到pBAST-R，在轉(zhuǎn)化了適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主細(xì)胞后，能夠指導(dǎo)有效表達(dá)用于人胰島素生產(chǎn)的胰島素原雜種多肽。在圖3中列出了質(zhì)粒pBAST-R的結(jié)構(gòu)，該質(zhì)粒編碼SOD-胰島素B-鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈雜種多肽；圖6中列出了所述雜種多肽的DNA序列和相應(yīng)的氨基酸序列。質(zhì)粒pBAST-R約4380bp長(zhǎng)，含有下列元件(以逆時(shí)針?lè)较?：1521bp長(zhǎng)的DNA片段，跨pBR322上的AatII-MscI位點(diǎn)，包括四環(huán)素抗性基因。1497bp長(zhǎng)的DNA片段，跨pBR322上的scaI-HaeII位點(diǎn)，包括截?cái)嗟陌逼S青霉素抗性基因和DNA復(fù)制源。930bp長(zhǎng)的DNA片段，跨大腸桿菌上的AvaII-PpuMI位點(diǎn)，包括deoP1P2啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)(13)。188bp長(zhǎng)的DNA片段，跨人CuAnSODcDNA的NdrI-PpuMI位點(diǎn)。通過(guò)寡核苷酸定點(diǎn)誘變(12)用Ser參見(jiàn)取代成熟SOD6位和57位的Cys。172bp長(zhǎng)的合成DNA片段，有PpuMI和BamHI末端。該區(qū)編碼Arg-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈。6合成的36bp的多克隆位點(diǎn)多接頭，有BamHI和Hindlll末端。7合成的44bp寡核苷酸，含TrpA轉(zhuǎn)錄終止子，有Hindlll和Aatll末端(10)。將賦予四環(huán)素抗性并編碼SOD-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈雜種多肽的質(zhì)粒pBAST-R導(dǎo)入到大腸桿菌菌株S^733(cytRstrA)中，然后于1993年7月26日保藏在ATCC，保藏號(hào)為ATCC69362。B質(zhì)粒pDBAST-LAT構(gòu)建另一系列的質(zhì)粒，得到質(zhì)粒pDBAST-LAT，在轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主細(xì)胞后，能夠指導(dǎo)有效高水平表達(dá)用于人胰島素生產(chǎn)的胰島素原雜種多肽。圖4中列出了編碼SOD-胰島素B鏈-Arg-胰島素A鏈雜種多肽的質(zhì)粒pDBAST-LAT的結(jié)構(gòu)；圖7中列出了所述雜種多肽的DNA序列和相應(yīng)的氨基酸序列。質(zhì)粒pDBAST-LAT約4377bp長(zhǎng)，含下列元件(以逆時(shí)針?lè)较?：1.1521bp長(zhǎng)的DNA片段，跨pBR322上的Aatll-MscI位點(diǎn)，包括四環(huán)素抗性基因。2.1497bp長(zhǎng)的DNA片段，跨pBR322上的Scal-Haell位點(diǎn)，包括截?cái)嗟陌逼S青霉素抗性基因和DNA復(fù)制源。3.930bp長(zhǎng)的DNA片段，跨大腸桿菌上的Avall-PpuMI位點(diǎn)，包括deoP1P2啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)(13)。4.188bp長(zhǎng)的DNA片段，跨人CuAnSODeDNA的Ndrl-PpuMI位點(diǎn)。通過(guò)寡核苷酸定點(diǎn)誘變(12)用Ser參見(jiàn)取代成熟SOD6位57位的Cys，該片段的GC含量降到38%。5.169bp長(zhǎng)的合成DNA片段，有PpuMI和BamHI末端。該區(qū)編碼Arg-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈。合成的36bp的多克隆位點(diǎn)多接頭，有BamHI和Hindlll末端。合成的44bp寡核苷酸，含TrpA轉(zhuǎn)錄終止子，有Hindlll和Aatll末端(10)。將賦予四環(huán)素抗性并編碼SOD-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈雜種多肽的質(zhì)粒pDBAST-LAT導(dǎo)入到大腸桿菌菌株S^733(cytRstrA沖，然后于1993年7月26日保藏在ATCC，保藏號(hào)為ATCC69361。C質(zhì)粒p入BAST-LAT構(gòu)建另一系列的質(zhì)粒，得到質(zhì)粒p入BAST-LAT，在轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主細(xì)胞(含cI1857阻遏物)后，能夠指導(dǎo)有效高水平表達(dá)用于人胰島素生產(chǎn)的胰島素原雜種多肽。圖5中列出了編碼SOD-胰島素B鏈-Arg-胰島素A鏈雜種多肽的質(zhì)粒p入BAST-LAT的結(jié)構(gòu)。圖7中列出了所述雜種多肽的DNA序列和相應(yīng)的氨基酸序列。質(zhì)粒p入BAST-LAT約3777bp長(zhǎng)，含下列元件(以逆時(shí)針?lè)较?：1.1521bp長(zhǎng)的DNA片段，跨pBR322上的Aatll-MscI位點(diǎn)，包括四環(huán)素抗性基因。2.1497bp長(zhǎng)的DNA片段，跨pBR322上的Scal-Haell位點(diǎn)，包括截?cái)嗟陌逼S青霉素抗性基因和DNA復(fù)制源。3.330bp長(zhǎng)的DNA片段，跨質(zhì)粒pSOFa13(14)上的BamHI-EcoRI位點(diǎn)，包括入PL啟動(dòng)子和和一Avrll-Ndel30個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的deo核糖體結(jié)合位點(diǎn)。4.188bp長(zhǎng)的DNA片段，跨人CuAnSODcDNA的Ndrl-PpuMI位點(diǎn)。通過(guò)寡核苷酸定點(diǎn)誘變(12)用Ser參見(jiàn)取代成熟SOD6位57位的Cys，該片段的GC含量降到38%。5.169bp長(zhǎng)的合成DNA片段，有PpuMI和BamHI末端。該區(qū)編碼Arg-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈。合成的36bp的多克隆位點(diǎn)多接頭，有BamHI和Hindlll末端。合成的44bp寡核苷酸，含TrpA轉(zhuǎn)錄終止子，有Hindlll和Aatll末端(10)。將賦予四環(huán)素抗性并編碼SOD-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈雜種多肽的質(zhì)粒p入BAST-LAT導(dǎo)入到大腸桿菌菌株4300(F-,bio,cI857)中，然后于1993年7月26日保藏在ATCC，保藏號(hào)為ATCC69363。30^繁殖細(xì)菌細(xì)胞。在溫度升高到42r后，誘導(dǎo)雜種多肽的生產(chǎn)。實(shí)施例2SOD-胰島素原雜種多肽的發(fā)酵，生長(zhǎng)條件和純化I原種培養(yǎng)物使含質(zhì)粒pDBAST-LAT(或pBAST-R)的大腸桿菌菌株S°733的原培養(yǎng)物在用時(shí)速(10mg/ml)補(bǔ)充的酪蛋白培養(yǎng)基(20gr/L酪蛋白水解產(chǎn)物，10gr/酵母提取物和5gr/LNaCl)中生長(zhǎng)。然后用冷凍培養(yǎng)基將培養(yǎng)物稀釋兩倍，然后于-80r貯存。冷凍培養(yǎng)基：K2HPO46.3grKH2PO41.8gr檸檬酸鈉0.45grMgSO4?7H2O0.09gr(NH4)2SO40.9gr甘油44gr每500mlII接種物使接種物在生產(chǎn)培養(yǎng)基(見(jiàn)下文)中生長(zhǎng)。從原培養(yǎng)物中接種在振蕩燒瓶中的滅菌培養(yǎng)基，然后37r，200rpm保溫15小時(shí)。如果需要，在攪拌的通氣發(fā)酵罐中完成接種物繁殖的隨后階段。用2-10%燒瓶培養(yǎng)物接種滅菌培養(yǎng)基，然后37r，pH7±0.5,同時(shí)攪拌并通氣的條件下培養(yǎng)15小時(shí)以保持溶解氧的水平在20%的空氣飽和度以上。III生產(chǎn)生產(chǎn)培養(yǎng)基：K2HPO48gr/LKH2PO42gr/L檸檬酸鈉2gr/LNH4Cl3gr/LK2SO40.6gr/LFeSO4?7H2O0.04gr/LMgSO4?7H2O0.4gr/LCaCl2?2H2O0.02gr/L痕量元素溶液3ml/L四環(huán)素0.01gr/L葡萄糖2gr/L甘油1ml/L痕量元素溶液：MnSO4?H2O1gr/LZnSO4?7H2O2.78gr/LCoCl2?7H2O2gr/LNa2MoO4?2H2O2gr/LCaCl2?2H2O3gr/LCuSO4?5H2O1.85gr/LH3BO30.5gr/LHCl(32%)100ml/L用0.5-10%接種培養(yǎng)物接種生產(chǎn)培養(yǎng)基，然后在37r培養(yǎng)。設(shè)定攪拌-通氣率以使溶解氧的水平保持了約20%的空氣飽和度上。用NH3將pH保持在7±0.2。輸入50%葡萄糖和30%甘油的滅菌溶液以補(bǔ)充能量和碳源。在細(xì)胞濃度達(dá)到OD660為25時(shí)，輸入10%葡萄糖和30%甘油的滅菌溶液，然后繼續(xù)生長(zhǎng)約5小時(shí)，直到細(xì)胞濃度達(dá)到約OD660為60。然后猝冷培養(yǎng)物，并通過(guò)離心回收細(xì)胞。存在葡萄糖，甘油，半乳糖中的任何一種或其組合作為碳源的條件下，反擊大腸桿菌，有利于表達(dá)SOD-胰島素原雜種多肽。IV純化由質(zhì)粒pBAST-R和pDBAST-LAT表達(dá)的SOD-胰島素原雜種多肽在細(xì)胞內(nèi)沉淀物中積累，用下列方法分離所述沉淀物：將1gr(凈重)的細(xì)菌餅懸浮在10ml含50mMTris-HCl，pH8，10mMEDTA的緩沖液中，37r用溶菌酶(Merck，2500u/ml)處理2小時(shí)。然后聲處理該混合物，加入Nonidet-P-40(Sigma)或TritonX100達(dá)到2%的終濃度，然后在室溫?cái)嚢?小時(shí)。通過(guò)離心沉淀沉淀物，然后用水洗滌。按如下用陰離子交換層析純化雜種多肽至接近均一。將沉淀物溶解在8M脲，20mMTris-HCl，200mMP-巰基乙醇，pH8.2中。離心澄清溶液，然后在用8M脲Tris-HCl，200mMP-巰基乙醇，pH8.2中預(yù)平衡的20DEAE-SepharoseFast-Flow柱(PharmaciaLKB)上層析。收集流出物，用40%飽和度的(NH4)SO4沉淀所述雜種蛋白質(zhì)，或通過(guò)在10K膜上超濾，然后用100mMGlycine-HCl，pH3.1透濾來(lái)濃縮。另外，通過(guò)溶解在8M脲，20mM二硫蘇糖醇，50mM醋酸鈉，pH5中，然后通過(guò)100kD和50kD膜(Filtron)系列膜而將質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的SOD-胰島素原雜種多肽純化至均一。在10kD膜上濃縮雜種多肽，然后用40%飽和度的(NH4)SO4沉淀。實(shí)施例3SOD-胰島素原雜種多肽的折疊和酶促裂解將通過(guò)(NH4)SO4沉淀或通過(guò)超濾(實(shí)施例2)得到的胰島素原雜種多肽溶解在8M脲，5mMHcl中，然后稀釋到100mM甘油沖液，pH8.5-12.0中，終濃度為約1mg/ml。A在約4-37r，約1-24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)折疊質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的SOD-胰島素原雜種多肽以便形成正確的二硫鍵。將含折疊的二硫鍵鍵合的雜種多肽之溶液的pH用HCl調(diào)到約8.8-9.0,在16-37r用胰蛋白酶和羧肽酶B將所述蛋白質(zhì)處理30-120分鐘。在許多試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)最佳條件如下：將質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的雜種多肽溶解在8M脲，5mMHCl中，然后稀釋到100mM甘油緩沖液，pH11.0(圖8)，終濃度為約1mg/ml，此后，在25r將雜種多肽折疊6-16小時(shí)，其后，在37r，用胰蛋白酶(1：500w/w)和羧肽酶B(1:200w/w)將折疊的二硫鍵鍵合的雜種多肽裂解30-60分鐘。圖1中圖示說(shuō)明了酶促裂解質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的，折疊的二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽，從而產(chǎn)生胰島素。B在約7-31r，約5-30小時(shí)的時(shí)間內(nèi)折疊質(zhì)粒pBAST-LAT表達(dá)的SOD-胰島素原雜種多肽以便形成正確的二硫鍵。將含折疊的二硫鍵鍵合的雜種多肽之溶液的pH用HCl調(diào)到約8.8-9.0,在22-37r用胰蛋白酶和羧肽酶B將所述蛋白質(zhì)處理16小時(shí)。在許多試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)最佳條件如下:將質(zhì)粒pBAST-LAT表達(dá)的雜種多肽溶解在8M脲，5mMHCl中，然后稀釋到100mM甘油緩沖液，pH11.0-11.25(圖8)，終濃度為約1mg/ml，此后，在25將雜種多肽折疊6-16小時(shí)，其后，在25r，用胰蛋白酶(1：15.00w/w)和羧肽酶B(1:10.00w/w)將折疊的二硫鍵鍵合的雜種多肽裂解16小時(shí)。圖2中圖示說(shuō)明了酶促裂解質(zhì)粒pBAST-LAT表達(dá)的，折疊的二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽，從而產(chǎn)生胰島素。在圖8-14的圖注中詳細(xì)說(shuō)明了上述A和B的特定條件。實(shí)施例4對(duì)從質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的SOD-胰島素原雜種多肽得到的人胰島素進(jìn)行蛋白質(zhì)分析和純化用市售的人胰島素為標(biāo)準(zhǔn)（Calbiochem），用放射性免疫檢測(cè)和RP-HPLC確定從質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的SOD-胰島素原雜種多肽得到的人胰島素。根據(jù)胰島素原的氨基酸序列計(jì)算的重組人胰島素的理論產(chǎn)率為45.6%。從圖8看出，最佳折疊在pH11。在該pH,胰島素的生產(chǎn)達(dá)理論產(chǎn)率的約80%（相當(dāng)于輸入雜種多肽的約40%）。用RP-HPLC檢測(cè)從質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)的胰島素。室溫使用Vydac218TP54,250X4.6mmI.D（Separationgroup）,5um,300A孔大小柱，流速為1ml/分鐘。用0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液作為洗脫劑A。用在乙月青中的0.08%TFA作為洗脫劑B。用平衡緩沖液（25%洗脫劑B）將柱洗滌5分鐘，然后在37.5分鐘內(nèi)用洗脫劑B25-50%的線性梯度。檢測(cè)在220nm或280nm的吸收值。用反相高壓液體層析分析酶促消化折疊的、二硫鍵鍵合的雜種多肽后的人胰島素表明主峰與標(biāo)準(zhǔn)人胰島素有相同的滯留時(shí)間。制備兩小批次，分別得到26mgh和13mg人胰島素。在3K或5K膜（Filtron）上通過(guò)超濾，然后用CM-Sepharose層析（檸檬酸鹽緩沖液，pH3）從酶處理的溶液（pH9）中純化人胰島素。將峰餾分脫鹽，凍干，然后進(jìn)行N-末端測(cè)序和氨基酸分析。這兩批次的重組人胰島素的氨基酸組成與天然人胰島素的基本相同（參見(jiàn)表1，制劑1）。用Edamn降解法確定胰島素制劑氨基末端5個(gè)氨基酸的序列。發(fā)現(xiàn)與人胰島素A和B鏈的NH2-末端的相同，這確定了體外產(chǎn)物的可靠性。然而，測(cè)序結(jié)果表明約25%的分子在第一個(gè)位置有一額外的Arg。該結(jié)果與在Lys和Arg（在接頭序列Lys-Arg內(nèi)）之間的胰蛋白酶裂解相符，裂解后在A鏈的氨基末端剩下Arg殘基。發(fā)現(xiàn)在pH11完成反應(yīng)可以用在胰蛋白酶在Arg的C-末端進(jìn)行特異性水解。在該升高的pH，大部分Lys的8-氨基不帶電（pK=10.3），因此能夠進(jìn)行選擇性裂解。通過(guò)在pH11完成胰蛋白酶步驟（參見(jiàn)表1，制劑2），然后在pH8.5用羧肽酶B消化，這兩批次分別得到1mg和6.5mg純化的胰島素。N-末端測(cè)序表明含額外Arg的胰島素的量降低到約5%。表1重組人胰島素的氨基酸組成氨基酸殘基數(shù)目理論值標(biāo)準(zhǔn)胰島素制劑1制劑2Asx33.203.383.26Thr32.982.832.68Ser32.842.532.77Glx77.157.737.23Pro11.281.131.09Gly44.244.394.25Ala11.001.281.04Cys65.885.115.79Val43.824.583.88Ile22.041.961.96Leu65.876.105.99Tyr43.803.803.87Phe33.153.563.03His22.042.052.08Lys11.011.051.02Arg10.961.301.18制劑1和2表示從質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)的重組人胰島素的氨基酸組成。在pH9（制劑1）或pH11（制劑2）完成胰蛋白酶裂解。過(guò)甲酸氧化和氣相水解純化的胰島素制劑后，進(jìn)行氨基酸分析。實(shí)施例5肽分析從質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)之SOD-胰島素原雜種多肽生產(chǎn)的純化人胰島素用內(nèi)蛋白酶Glu-C（Sigma）（該酶水解在谷氨?；然鶄?cè)的肽鍵）使按上述實(shí)施例生產(chǎn)的純化人胰島素經(jīng)肽分析。更詳細(xì)地說(shuō)，在37°C，100ul0.1MTris-Hcl，pH7.8中，用5ugGlu-C將胰島素樣品消化6小時(shí)，所述樣品是通過(guò)裂解質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的折疊的、二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽而生產(chǎn)的。完成HPLC分析：將市售（對(duì)照）胰島素和通過(guò)裂解質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的折疊的、二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽而生產(chǎn)的胰島素樣品酸化到約pH3,然后用RP-HPLC分離。使用Vydac218TP54,250X4.6mmI.D（Separationgroup）,5um,300A孔大小柱。用含31.5%（v/v）乙月青的50mM磷酸四乙胺，162mMNaClO4,pH3平衡該柱，然后在75分鐘內(nèi)，以1ml/分鐘的流速，用35-45%乙青的線性梯度顯色。在220nm測(cè)量吸收值。按照對(duì)照反應(yīng)產(chǎn)生了所有預(yù)期的肽，甚至在峰后相當(dāng)于片段之一的小肩可能相當(dāng)于des-Thr（B30）胰島素樣分子（15）。實(shí)施例4和5表明質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的重組多肽含有天然人胰島素序列。生產(chǎn)的小部分重組蛋白質(zhì)包括Arg（Ao），desamido-或des-Thr（B30）胰島素樣分子形式。用層析方法，如上述的RP-HPLC可以除去這些不想要的副產(chǎn)物。實(shí)施例6對(duì)從質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的SOD-胰島素原雜種多肽得到的人胰島素進(jìn)行蛋白質(zhì)分析和純化為了避免產(chǎn)生Arg（Ao）胰島素副產(chǎn)物（實(shí)施例4和5），修飾表達(dá)質(zhì)粒pBAST-R以得到只含有編碼胰島素原雜種多肽AB鏈之間的Arg殘基的DNA，這與編碼Lys-Arg的DNA，Lys-Arg位于質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的胰島素原雜種多肽AB鏈之間。得到表達(dá)質(zhì)粒pDBAST-LAT（實(shí)施例1B）和p久BAST-LAT（實(shí)施例1C）。折疊并用胰蛋白酶和CPB酶促處理由新表達(dá)質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的折疊的、二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽后，有效生產(chǎn)胰島素。存在的胰島素樣污染物少（圖9）。最佳折疊在pH11.25（圖10），在反應(yīng)混合物中，每摩爾SH基團(tuán)存在約2摩爾抗壞血酸的條件下，折疊顯著增加（圖11）。在其它最佳折疊條件下，用系列反應(yīng)確定蛋白質(zhì)濃度對(duì)從胰島素原雜種多肽生產(chǎn)的胰島素的影響。蛋白質(zhì)濃度不超過(guò)1.5mg/ml時(shí)，產(chǎn)率最佳（圖13）。用DEAE-Sepharose層析，然后用RP-HPLC（如圖9所述）純化胰島素。正如從圖12中所看到的，生產(chǎn)的重組人胰島素與標(biāo)準(zhǔn)（市售）人胰島素有相同的滯留時(shí)間。純化的重組人胰島素制劑的氨基酸組成與標(biāo)準(zhǔn)胰島素的相同（參見(jiàn)表2）。表2表明從質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)的胰島素沒(méi)有如實(shí)施例4所述的，粘附于胰島素A鏈的額外Arg（Arg（Ao）胰島素）。因此生產(chǎn)胰島素的優(yōu)選質(zhì)粒是質(zhì)粒pDBAST-LAT，圖7中列出了胰島素原雜種多肽的優(yōu)選序列。表2重組人胰島素的氨基酸組成氨基酸殘基的數(shù)目理論值標(biāo)準(zhǔn)胰島素重組胰島素Asx33.203.32Thr32.982.73Ser32.842.71Glx77.157.41Pro11.281.02Gly44.244.46Ala11.001.09Cys65.885.28Val43.824.00Ile22.041.91Leu65.876.34Tyr43.803.64Phe33.153.06His22.042.18Lys11.011.02Arg10.961.07表明了標(biāo)準(zhǔn)人胰島素和從質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)的重組人胰島素的氨基酸組成。在過(guò)甲酸氧化和氣相水解純化的胰島素制劑后，完成氨基酸分析。實(shí)施例7從粗細(xì)胞內(nèi)沉淀物生產(chǎn)來(lái)自質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽的人胰島素使用粗細(xì)胞內(nèi)沉淀物，刪去實(shí)施例2中的起始純化步驟，部分IV，可以完成折疊并將胰島素原雜種多肽轉(zhuǎn)變成胰島素的改進(jìn)后的方法。胰島素的有效生產(chǎn)是在用胰蛋白酶和羧肽酶B（圖14和表3）酶促裂解折疊的，二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽后。將胰島素產(chǎn)率計(jì)算為在pH12，沉淀物溶解步驟確定的起始蛋白質(zhì)濃度(A280)(圖14)。表明從粗細(xì)胞內(nèi)沉淀物折疊SOD-胰島素原雜種多肽是在從開(kāi)始試驗(yàn)的約4.5小時(shí)(圖14)。表3總結(jié)了從質(zhì)粒pBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽部分純化胰島素的情況，所述多肽來(lái)自從O.D.660=45的一升發(fā)酵培養(yǎng)物質(zhì)粒的粗細(xì)胞內(nèi)沉淀物。按圖14所述完成溶解和折疊。在開(kāi)始后的4.5小時(shí)，用濃縮的鹽酸將含折疊的、二硫鍵鍵合的胰島素原雜種多肽的折疊的堆積溶解滴定到pH8.8。加入znCl2(到50uM的終濃度)，羧肽酶B(1:4000w/w)和胰蛋白酶(1:6000w/w)。37°C消化3小時(shí)，然后通過(guò)加入苯基甲基磺基氟化物(PMSF)到0.5mM的終濃度而終止消化。用HPLC分析(如圖9所述)表明，胰島素的產(chǎn)率為169mg。通過(guò)連續(xù)的陰離子交換和疏水層析步驟純化胰島素。以約每ml樹(shù)脂50A280單位將消化的折疊混合物負(fù)載到用20mMTris-HCl，10mMNaClpH8緩沖液預(yù)平衡的DEAESepharoseFastFlow(Pharmacia)柱上。用20mMTris-HCl，100mMNaClpH8緩沖液洗滌結(jié)合的物質(zhì)，然后用在相同的緩沖液中的250mMNaCl洗脫。含胰島素的池餾分代表20%的負(fù)載蛋白質(zhì)，純度為37.1%。將硫酸銨加到DEAE洗脫池中達(dá)到410mM的濃度，然后以約每ml樹(shù)脂12A280單位負(fù)載到用20mMTrisHCl，540mM硫酸銨預(yù)平衡的苯基-SepharoseFastFlow柱上。用平衡緩沖液洗滌結(jié)合的物質(zhì)，用20mMTrisHCl，220mM硫酸銨，pH8緩沖液洗脫胰島素。含胰島素的餾分表示負(fù)載蛋白質(zhì)的42.3%，純度為74.1%。該部分純化步驟的結(jié)果是生產(chǎn)的120mg(等于標(biāo)準(zhǔn)胰島素)，胰島素的產(chǎn)率為5.16%。用領(lǐng)域已知的方法，如凝膠過(guò)濾，RP-HPLC和結(jié)晶(17)可以進(jìn)行進(jìn)一步純化。表3溶解粗細(xì)胞內(nèi)沉淀物，折疊并用胰蛋白酶和羧肽酶B酶促處理后，純化從質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)的重組人胰島素純化步驟A280minimumamountofTOC\o"1-5"\h\zinsulinbyHPLC-inmg%purity沉淀物溶解2326--活性炭處理1915--折疊和酶促處理19151698.8DEAE-Sepharose池38314237.1苯基Sepharose池16212074.1A280表示各純化步驟，在280nm的總吸收值。按照?qǐng)D9所述，參照標(biāo)準(zhǔn)胰島素，用HPLC確定胰島素的存在，并對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)胰島素的主胰島素峰。參考文獻(xiàn)：Cousens，L.S.，Shuster，J.R.，Gallegos，C.，Ku，L.，Stempien，M.M.，Urdea，M.S.，Sanchez-Pescador，R.，Taylor，A.andTeKamp0Olson,P.，基因61：265-275，1987。Davidson，H.W.，Rhodes，C.J.andHutton，J.C.，自然333：93-96，1988。Ellman，G.L.，Arch.Biochem.Biophys.82：70-77，1959。Fischer，M.，F(xiàn)ytlovitch，S.，Amit，B.，Wortzel，A.andBeck，Y.，應(yīng)用微生物生物技術(shù)(Appl.Microbio.Biotechnol.)33：424-428，1990。Frank，B.H.andChance，R.E.(1985)，F(xiàn)rank，B.H.andChance，R.E.(1985)，制備并表征人胰島素的重組DNA源，用于通過(guò)遺傳工程生產(chǎn)的治療藥物(ThepreparationandcharacterizationofhumaninsulinofrecombinantDNAorigin，inTherapeuticagentsproducedbygeneticengineering，)，QuoVadissymposium，sanofigroup，1985年5月29-30，Toulouse-Labege，法國(guó)，pp：137-146。Goeddel，D.V.，Kleid，D.G.，Bolivar，F(xiàn).，Heyneker，H.L.，Yansura，D.G.，Crea，R.，Hirose，T.，Kraszewski，a.，Itakura，K.andRiggs，A.D.，Proc.Natl.，Acad.Sci.76：106-110.1979.Grau，U.，糖尿病(Diabetes)34：1174-1180，1985.Hartman等人，美國(guó)專利5143836，1992年9月1日。Kemmler，W.，Peterson，J.D.andSteiner，D.f.，生物化學(xué)期刊(J.Biol.Chem)246：6786-6791，1971.Morinaga,Y.,Franceschini,T.,Inouye,S.andInouye,M.,生物技術(shù)2：636-639,1984。Panayotis,G.,Katsoyannis,G.andTometsko,A.,Proc.Natl.,Acad.Sci.U.S.A.55：1554-1561.1966.Schlichtkrull,J.,ActaChem.Scand.10：1459-1464,1956.Sherman,L.,Dafni,L.,Liehman-Hurwitz,J.andGroner,Y,Proc.Natl.,Acad.Sci.80：5465-5469,1983.Steiner，D.F.andClark，J.L.，Proc.Natl.，Acad.Sci.60：622-629，1968.Thim,L.,Hansen,M.T.,Norris,K.,Hoegh,I.,Boel,E.,Forstrom,J.,ammerer,G.andFiil,N.P.,Proc.Natl.,Acad.Sci.美國(guó)，83：6766-6770,1986.Wetzel,R.,Kleid,D.G.,Crea,R.,Heyneker,H.L.,Yansura,D.G.,Hirose,T.,Kraszewski,A.,Riggs,A.D.,Itakura,K.andGoeddel,D.V.,基因16：63-71,1981.Yanofsky,C.,Platt,T.,Crawford,I.P.,Nichols,B.P.,Christie,G.E.,Horowitz,H.,VanCleemput,M.andWu,A.M.,核酸研究.9：6647-6668,1981CN1231259C［中文］發(fā)明名稱--生產(chǎn)人胰島素出】主n申請(qǐng)?zhí)朇N94195231申請(qǐng)日1994.12.29公開(kāi)（公告）號(hào)CN1231259C公開(kāi)（公告）日2005.12.14IPC分類號(hào)A61K38/28;C12N15/17

申請(qǐng)（專利權(quán)）人薩文特醫(yī)藥公司；發(fā)明人J?R?哈特曼;S?口德羅維茨;M?戈雷基；優(yōu)先權(quán)號(hào)優(yōu)先權(quán)日申請(qǐng)人地址美國(guó)新澤西州；摘要［支持框選翻譯］簡(jiǎn)體中文-＞英文英文-＞簡(jiǎn)體中文其他語(yǔ)種提供了改進(jìn)且有效的通過(guò)折疊胰島素原雜交多肽來(lái)生產(chǎn)重組人胰島素的方法。摘要附圖發(fā)明名稱--Generationofhumaninsulin出】主n申請(qǐng)?zhí)朇N94195231申請(qǐng)日1994.12.29公開(kāi)（公告）號(hào)CN1231259C公開(kāi)（公告）日2005.12.14IPC分類號(hào)A61K38/28;C12N15/17;C12N15/16申請(qǐng)（專利權(quán)）人SAWENTEMEDICALINC;發(fā)明人GORESKIJRHARTMANSMENDELOV;優(yōu)先權(quán)號(hào)CN94195231優(yōu)先權(quán)日1994.12.29摘要［支持框選翻譯］簡(jiǎn)體中文-＞英文英文-＞簡(jiǎn)體中文其他語(yǔ)種Abstract：Animprovedandefficientprocessfortheproductionofrecombinanthumaninsulinbyfoldingofaproinsulinhybridpolypeptideisprovided.摘要附圖權(quán)利要求書生產(chǎn)胰島素的方法，包括：通過(guò)處理含編碼雜種多肽之DNA的細(xì)菌細(xì)胞，以便表達(dá)并且從細(xì)胞回收雜種多肽，從而獲得含胰島素原的雜種多肽；在允許形成正確二硫鍵的條件下，折疊含胰島素原的雜種多肽，而未經(jīng)亞硫酸鹽解該雜種多肽；使折疊的、二硫鍵鍵合的雜種多肽經(jīng)酶促裂解以產(chǎn)生胰島素；純化胰島素。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)還包括將雜種多肽保溫。根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中在4-37^的溫度下進(jìn)行保溫。根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中保溫進(jìn)行1-30小時(shí)。根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中在pH8.5-12.0下進(jìn)行保溫。根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中在存在抗壞血酸的條件下進(jìn)行保溫。根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中在折疊混合物中，抗壞血酸的濃度為每摩爾SH基1-10摩爾抗壞血酸。根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中pH為11.0-11.25。根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中pH為11.0-11.25。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)還包括：(I)將pH調(diào)到8.8-9.0；和(ii)在16-37^用胰蛋白酶和羧肽酶B裂解雜種多肽30分鐘-16小時(shí)。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(d)還包括用DEAE-Sepharose層析和RP-HPLC純化。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(d)還包括用超濾和CM-Sepharose層析純化。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟d)還包括用DEAE-Sepharose層析和苯基-Sepharose層析。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用ATCC保藏號(hào)為69361的質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)胰島素原雜種多肽。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用ATCC保藏號(hào)為69363的質(zhì)粒pABAST-LAT表達(dá)胰島素原雜種多肽。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用ATCC保藏號(hào)為69362的質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)胰島素原雜種多肽。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述處理包括存在葡萄糖，甘油或半乳糖的條件下發(fā)酵。根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述回收包括：(I)破壞所述細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞壁或其片段以產(chǎn)生溶胞產(chǎn)物；通過(guò)離心從溶胞產(chǎn)物中分離細(xì)胞內(nèi)沉淀物；和溶解所述沉淀物。說(shuō)明書生產(chǎn)人胰島素發(fā)明背景在本發(fā)明說(shuō)明書中，用括號(hào)內(nèi)的阿拉伯?dāng)?shù)字列出了各種文獻(xiàn)。在說(shuō)明書后，權(quán)利要求前可以找到這些參考文獻(xiàn)的所有引述。將這些文獻(xiàn)公開(kāi)的所有內(nèi)容均引入本說(shuō)明書作為參考以便更全面地描述本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)的狀態(tài)。胰島素是控制葡萄糖代謝所必需的多肽激素，每天施用給患糖尿病的患者，糖尿病是胰島素供應(yīng)不足而引起的代謝紊亂。體內(nèi)，首先將該激素合成成長(zhǎng)前體分子，隨后加工成由A和B鏈組成的其生物活性形式。更詳細(xì)地說(shuō)，在內(nèi)分泌胰腺的0細(xì)胞內(nèi)，將前原胰島素的基因轉(zhuǎn)錄成mRNA前體，然后剪接生產(chǎn)成熟mRNA。將所述mRNA翻譯成前原胰島素(NH2-前區(qū)-B鏈-C肽-A鏈-COOH)，接著再加工成胰島素原并最終加工成胰島素。該過(guò)程的第一步就是蛋白水解除去前區(qū)，該區(qū)是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體膜來(lái)轉(zhuǎn)移新鏈的疏水信號(hào)序列。在人前原胰島素中，前區(qū)的長(zhǎng)度是24個(gè)氨基酸。在胰島素原中，將變成成熟胰島素的多肽鏈的兩個(gè)區(qū)，B-和A鏈通過(guò)C肽(或C-鏈)彼此相連，所述C肽在N和C末端含有兩對(duì)堿性氨基酸。在大多數(shù)C肽中，這些配對(duì)是Arg-Arg和Lys-Arg。人C肽，包括兩個(gè)側(cè)對(duì)的堿性氨基酸，含有35個(gè)氨基酸。C肽與所述多肽的兩個(gè)部分相連以便有助于在B和A片段之間形成二硫鍵。因此，C肽的作用很大程度上不依賴其結(jié)構(gòu)。事實(shí)上，用較短的合成橋鍵代替仍能適當(dāng)?shù)卣郫B胰島素原分子(1，2)。胰島素原折疊，同時(shí)發(fā)生兩個(gè)鏈間二硫鍵和一個(gè)A鏈二硫鍵的氧化。在成熟化的最后階段，蛋白水解酶在堿性氨基酸處裂解以釋放C肽并形成成熟胰島素(3)。在人胰島素中，A鏈有21個(gè)氨基酸，B鏈有30個(gè)氨基酸。世界上每年胰島素的需求超過(guò)數(shù)噸，而且嚴(yán)重供不應(yīng)求。傳統(tǒng)上，胰島素是從有限的動(dòng)物源中生產(chǎn)的，主要是牛和豬胰腺制品，它們不同于人胰島素，因此會(huì)引發(fā)有害的免疫反應(yīng)。在六十年代完成的研究表明，可以體外生產(chǎn)胰島素。通過(guò)用其S-磺化形式(4)將A和B鏈結(jié)合或通過(guò)自發(fā)再氧化還原的胰島素原(5)來(lái)合成胰島素。后一種方法由于在氧化混合物中蛋白質(zhì)濃度很低，不能用于大規(guī)模生產(chǎn)胰島素。在用胰蛋白酶和羧肽酶B處理后(6)，可以回收胰島素。最近半合成和生物合成的(重組)人胰島素也可以得到。半合成的人胰島素是通過(guò)胰蛋白酶催化B鏈30位的Ala換成Thr(是豬胰島素和人胰島素之間的唯一不同)而從豬胰島素生產(chǎn)的。在大腸桿菌或酵母中生產(chǎn)的重組人胰島素最終將取代所有其它生產(chǎn)途徑?，F(xiàn)在通過(guò)兩種途徑制備半合成重組人胰島素：在大腸桿菌中分開(kāi)生產(chǎn)A和B鏈，然后將其結(jié)合在一起(7,8)，或酶促轉(zhuǎn)變?cè)诖竽c桿菌(1，8)或酵母(2,9沖表達(dá)的胰島素原等多肽。在大多數(shù)情況下，胰島素原是作為雜種蛋白質(zhì)而生產(chǎn)的，以細(xì)胞內(nèi)沉淀蛋白質(zhì)的形式積累。正常純化所述雜交物，然后用CNBr裂解以釋放胰島素原多肽。后者再通過(guò)氧化亞硫酸鹽解(sulfitolysis)修飾得到胰島素原S-磺酸鹽。然后在還原條件下純化并折疊胰島素原S-磺酸鹽，得到胰島素原(8).通過(guò)胰蛋白酶和羧肽酶B(6)的聯(lián)合作用將胰島素原轉(zhuǎn)變成胰島素。專利公開(kāi)EP195691(NovoNordiskA/B)描述了分子式為B-Lys-Arg-A的胰島素原以及其用于在酵母中制備胰島素的用途。專利公開(kāi)EP196056B1(ChironCorp.,)描述了用酵母生產(chǎn)的hSOD-胰島素原蛋白質(zhì)。在折疊前，使hSOD-胰島素原蛋白質(zhì)經(jīng)漠化氰裂解和亞硫酸鹽解。Hoechst在EPO379162中描述了可以將〃胰島素前體的錯(cuò)重組體〃(即，有不正確或部分不正確分子間二硫鍵的重組胰島素產(chǎn)物不通過(guò)亞硫酸鹽解，而是在有機(jī)氧化還原系統(tǒng)的存在的條件下，在含水介質(zhì)中通過(guò)將錯(cuò)重組體與過(guò)量硫醇反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成正確的胰島素產(chǎn)物。在氨基酸或肽基從融合多肽裂解后(化學(xué)或酶促)(發(fā)生在宿主細(xì)胞溶解后)進(jìn)行源(original)亞硫酸鹽解(sulfitolysis)步驟，因?yàn)槿缓笠獙⒁葝u素前體的6個(gè)半胱氨酸轉(zhuǎn)變成其S-磺酸鹽。在隨后的復(fù)性步驟中，通過(guò)形成三個(gè)正確的二硫鍵而從所述胰島素原S-磺酸鹽生產(chǎn)天然胰島素原。在該復(fù)性步驟，產(chǎn)生了所謂“錯(cuò)重組體”。Hoechst在PCTWO91/03550中還公開(kāi)了制備含所需蛋白質(zhì)(如胰島素原)和“平衡組分”的方法。亞硫酸鹽解在折疊前完成，而在折疊后，與胰島素原的C-鏈同時(shí)裂解掉“平衡組分”。另外，Hoechst在EP347781B1中描述了“小胰島素原”(B-Arg-A)和其用于致病單-Arg胰島素和胰島素的用途。他們還描述了含有B-Arg-A和“平衡組分”的融合蛋白質(zhì)。在折疊多肽前，用漠化氰裂解“平衡組分”并完成亞硫酸鹽解。本發(fā)明公開(kāi)了用改進(jìn)并有效的方法生產(chǎn)重組人胰島素。在大腸桿菌中合成含有前導(dǎo)序列的重組胰島素原雜種多肽。部分純化后，在可以進(jìn)行之前折疊的條件下，將其折疊，但仍連接著前導(dǎo)肽。然后通過(guò)用胰蛋白酶和羧肽酶B結(jié)合處理而產(chǎn)生有生物活性的人胰島素，其中這些酶同時(shí)裂解掉了前導(dǎo)肽和C鏈。因此生產(chǎn)的純化人胰島素與天然產(chǎn)生的人胰島素相同。在雜種多肽的CNBr裂解和用于保護(hù)豐富SH基團(tuán)的亞硫酸鹽解中所涉及的有害和麻煩的過(guò)程在所述新方法中除去了，因?yàn)榭梢詫⑼暾囊葝u素原雜種多肽有效折疊成其天然結(jié)構(gòu)，甚至是在存在前導(dǎo)肽和未保護(hù)的半胱氨酸的情況下。通過(guò)酶促裂解釋放活性重組人胰島素，然后將其純化。附圖的簡(jiǎn)要描述在附圖3-5中所列三個(gè)質(zhì)粒的限制圖譜中，并未鑒定出在這些質(zhì)粒上的所有限制位點(diǎn)。但是，列出了完全理解本發(fā)明所必需的那些限制位點(diǎn)。圖1：通過(guò)酶促裂解表達(dá)質(zhì)粒pBAST-R而產(chǎn)生的折疊的、二硫鍵結(jié)合的胰島素原雜種多肽，從而得到人胰島素。只表明了部分SOD前導(dǎo)序列。圖2：通過(guò)酶促裂解表達(dá)質(zhì)粒pBAST-LAT或質(zhì)粒p入BAST-LAT而產(chǎn)生的折疊的、二硫鍵結(jié)合的胰島素原雜種多肽，從而得到人胰島素。只表明了部分SOD前導(dǎo)序列。圖3：質(zhì)粒pBAST-R的結(jié)構(gòu)，編碼SOD-胰島素原雜種多肽的表達(dá)質(zhì)粒，保藏號(hào)為ATCC69362。圖4：質(zhì)粒pDBAST-LAT的結(jié)構(gòu)，編碼SOD-胰島素原雜種多肽的表達(dá)質(zhì)粒，保藏號(hào)為ATCC69361。圖5：質(zhì)粒p入BAST-LAT的結(jié)構(gòu)，編碼SOD-胰島素原雜種多肽的表達(dá)質(zhì)粒，保藏號(hào)為ATCC69363。圖6：用質(zhì)粒pBAST-R表達(dá)的SOD-胰島素原雜種多肽的氨基酸序列和相應(yīng)的DNA核苷酸序列。圖7：用質(zhì)粒pDBAST-LAT和p入BAST-LAT表達(dá)的SOD-胰島素原雜種多肽的氨基酸序列和相應(yīng)的DNA核苷酸序列。圖8：人胰島素生產(chǎn)，來(lái)自用質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽，作為折疊混合物pH的函數(shù)。在4°C，經(jīng)16小時(shí)，用1mg/ml或0.5mg/ml雜種多肽，在100mM甘油中，于不同pH完成胰島素原雜種多肽的折疊(按實(shí)施例2所述生產(chǎn)的)。37C，pH9用(胰蛋白酶1:500w/w)(Sigma)和羧肽酶B(CPB，Sigma，1:200w/w)將折疊材料處理30分鐘，然后通過(guò)利用125I-胰島素(Amersham)和人重組胰島素(Calbiochem)為標(biāo)準(zhǔn)的放射性免疫檢測(cè)法檢測(cè)免疫反應(yīng)性(IR)。圖9：用質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)人胰島素將胰島素原雜種多肽（按實(shí)施例2所述生產(chǎn)的）溶解在8M脲，濃度為約30mg/ml的5mMHCl,然后用100mM甘油-NaOH稀釋1mg/ml，pH11.0中。在22°C（室溫）折疊20小時(shí)。然后用HCl將pH調(diào)到8.8。加入羧肽酶B（1：1000w/w,Sigma）和胰蛋白酶（1：2000w/w,Sigma）在37C將反應(yīng)混合物保溫60分鐘。在用10mMHCl稀釋前，將消化混合物酸化到pH3。在250X4mm,5pLichrosphere100RP-8柱（Merch）上，通過(guò)反相高壓液體層析（RP-HPLC）分析150pl的樣品，所述柱用含31.5%（v/v）乙月青的50mM磷酸四乙胺，162mMNacl4,pH3平衡。用31.5%-40.5%乙青的現(xiàn)象梯度，在75分鐘內(nèi)，以1ml/分的流速使該柱展開(kāi)。檢測(cè)在220nm的吸收值。A：5ug標(biāo)準(zhǔn)胰島素（Boehringer-Mannheim）；B：酶促處理后產(chǎn)生的重組人胰島素；C：折疊的SOD-胰島素原雜種多肽。圖10：質(zhì)粒pDBAST-LAT表達(dá)的胰島素原雜種多肽生產(chǎn)人胰