《蛋白質(zhì)的分離純化》課件

基因工程下游技術(shù)簡介1《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!

下游工藝的大體步驟細(xì)胞擴增細(xì)胞破碎離心分離（溶解包涵體）層析分離（離子交換層析反相層析疏水層析凝膠層析親和層析等）2《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!發(fā)酵工程主要指利用微生物、包括利用基因工程改造的微生物在全自動發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中大量擴增的技術(shù)。現(xiàn)代發(fā)酵工程是生物代謝、微生物生長動力學(xué)、大型發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器研制、化工原理等密切結(jié)合和應(yīng)用的結(jié)果。

發(fā)酵工程（細(xì)胞擴增）3《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!4《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!5《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!分離純化的要求1、純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作為研究蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達(dá)到一定純度即可，不要求均一。2、活性：要求保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。6《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!2.物理法：1)反復(fù)凍融法：將細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。2)超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時，時間要長一些。7《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!細(xì)胞器的分離細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，植物細(xì)胞還有葉綠體。如果要分離制備分布在這些細(xì)胞器中的生物大分子，為了防止其他細(xì)胞組分對制備物的干擾或污染，還需先將細(xì)胞器分離出來，然后在某一細(xì)胞器中分離某一物質(zhì)。8《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!粗分級分離主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開。優(yōu)點：簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)。缺點：分辨率低，產(chǎn)品雜質(zhì)多9《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!⑴鹽析的基本原理蛋白質(zhì)溶液為親水溶膠體系，其穩(wěn)定因素為：水化膜和電荷。中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時又中和了電荷，破壞了親水溶膠，蛋白質(zhì)分子聚集形成沉淀。10《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!++++++++++++++++等點電時的蛋白質(zhì)（親水膠體）帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）脫水脫水脫水帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）不穩(wěn)定蛋白顆粒陰離子陽離子堿酸酸蛋白質(zhì)聚集沉淀帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）堿++水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）11《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!幾種鹽在不同溫度下的溶解度

（克/100毫升水）

0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3

103

Na2SO4

4.918.943.342.2

NaH2PO41.67.893.8

101硫酸銨在0℃時的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類：12《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!（3）分段鹽析不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出13《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!2.有機溶劑沉淀法⑴基本原理①降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。②由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。14《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!3.等電點沉淀法具有不同等電點的兩性電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實現(xiàn)分離。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離。由于許多蛋白質(zhì)的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，因而此法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。15《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!本方法的優(yōu)點是：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。③沉淀后有機聚合物容易去除。16《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!7.超濾超過濾即超濾，自20年代問世后，直至60年代以來發(fā)展迅速，很快由實驗室規(guī)模的分離手段發(fā)展成重要的工業(yè)操作技術(shù)。超濾現(xiàn)已成為一種重要的生化實驗技術(shù)，廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。17《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!超濾根據(jù)所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。

微孔過濾所用的操作壓通常小于4×104Pa，膜的平均孔徑為500?！?4微米（1微米＝104埃），用于分離較大的微粒、細(xì)菌和污染物等。超濾所用操作壓為4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔徑為10—100埃，用于分離大分子溶質(zhì)。反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達(dá)到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔徑最小，一般為10埃以下，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等。18《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!常用的層析方法 凝膠過濾 離子交換層析 疏水層析 反相層析 親和層析19《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!各類層析的原理和載體類別分離原理基質(zhì)或載體吸附層析化學(xué)、物理吸附硅膠、氧化鋁、羥基磷酸分配層析兩溶劑相中的溶解效應(yīng)纖維素、硅藻土、硅膠凝膠層析

分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng)sepharose、sephadex離子交換層析離子基團的交換反應(yīng)離子交換樹脂、纖維素、葡聚糖親和層析

分離物與配體之間有帶配基的sepharose特殊親和力或sephadex聚焦層析等電點和離子交換作用多緩沖交換劑（與帶有多種電荷基團的配體相偶聯(lián)的sepharose6B）20《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!分子篩（凝膠）層析（gel-filtrationchromatography）

原理（見后）基質(zhì)葡聚糖凝膠（sephadex）瓊脂糖凝膠（sepharose）應(yīng)用測定分子量脫鹽和濃縮分離提純生物大分子除去熱原物質(zhì)21《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!凝膠過濾（分子篩）根據(jù)不同分子量選擇不同凝膠Sephadex:交聯(lián)葡聚糖G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值X10Sepharose：瓊脂糖凝膠Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝膠分子篩Sephacryl：用N，N-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖凝膠22《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!a.分離蛋白質(zhì)b.脫鹽c.蛋白質(zhì)分子量的測定應(yīng)用23《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!

離子交換層析 離子交換介質(zhì)是一些表面帶有電荷的顆粒，可以結(jié)合帶有異性電荷的離子。蛋白質(zhì)或核酸的分子，一般都帶有電荷，不同的蛋白質(zhì)或核酸，攜帶的電荷可能有差異，根據(jù)這些差異，進(jìn)行蛋白質(zhì)或核酸的分離。24《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!12345原始緩沖溶液的反離子25《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!動物細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞工程26《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!單細(xì)胞藻類培養(yǎng)

細(xì)胞工程一些單細(xì)胞低等植物如單細(xì)胞藻類的大規(guī)模培養(yǎng)成為細(xì)胞工程的重要組成部分獲得蛋白質(zhì)資源、營養(yǎng)食品、精細(xì)化工產(chǎn)品等等27《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!細(xì)胞破碎方法1.機械法：1)研磨：將樣品置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。2)組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，通常用10000r/min～20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(即高速分散器)將細(xì)胞打碎。28《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!3)壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa

的高壓下使細(xì)胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。4)冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此法。在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。29《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法，即將破碎后的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細(xì)胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后，即可獲得所需組分。30《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!1.鹽析（中性鹽沉淀）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。鹽析法多用于蛋白質(zhì)分離，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點是：①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。②操作簡單、安全。③對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。31《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!溶解度鹽濃度Salting-outSalting-in32《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!⑵中性鹽的選擇常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4，因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點：1)溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進(jìn)行。由下表可以看到，硫酸銨在0℃時的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類：33《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!2)分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純度提高了四倍。3)不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L濃度的（NH4）2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。4)價格便宜，廢液不污染環(huán)境。34《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!（4）鹽析的影響因素1)蛋白質(zhì)的濃度：若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.5％～3.0％，相當(dāng)于25mg/mL～30mg/mL。2)pH值：在等電點處溶解度小，因此溶液的pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點附近。3)溫度的影響：對于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，一般情況下，可在室溫下進(jìn)行。但對于某些對溫度敏感的蛋白質(zhì)，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。

35《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!（2）有機溶劑沉淀法的優(yōu)點①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。②沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋除去有機溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)用。其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。36《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!5.有機聚合物沉淀法有機聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。其中應(yīng)用最多的是“聚乙二醇”(PolyethyleneGlycol簡寫為PEG)，它的親水性強，對熱穩(wěn)定，有廣泛的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的PEG。

37《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!6.透析自ThomasGraham1861年發(fā)明透析方法至今已有一百多年。透析已成為最簡便最常用的分離純化技術(shù)之一。在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都可使用透析技術(shù)。透析只需要使用專用的半透膜即可。保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋（膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。38《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!加壓的蛋白質(zhì)溶液濃縮的蛋白質(zhì)溶液含小分子的溶液39《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!（二）精分級分離一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。進(jìn)一步提純通常使用高分辨率的柱層析方法。常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析和金屬螯合層析等。另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。40《蛋白質(zhì)的分離純化》課件共47頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!層析技術(shù)原理層析技術(shù)是一種物理的分離方法。其系統(tǒng)通常由互不相溶的兩個相組成：一是固定相（固體或吸附在固體上的液體），一是流動相（液體或氣體）。層析時，利用混合物中各組分理化性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩相