呼吸道病毒7項檢測試劑

某復星醫(yī)學科技發(fā)展某呼吸道病毒7項檢測試

劑2011-1-10呼吸道病毒7項檢測試劑目錄1.1.概述1D3UltraDFA試劑11D3UltraDFA試劑規(guī)格1D3UltraDFA試劑用途2D3UltraDFA試劑特點和優(yōu)勢2D3UltraDFA試劑實驗操作步驟3D3UltraDFA試劑實驗結果判讀4D3UltraDFA試劑競爭優(yōu)勢50/10檢驗的特異性和靈敏度5市場競爭5附錄1七種病毒檢測的臨床意義6附錄2實驗室所需設備清單（試劑盒中不含）7附錄3進口熒光顯微鏡參數(shù)8概述日常生活中，幾種常見的呼吸道病毒往往給人們的工作和生活帶來極大的不便，有些甚至威脅到人們的健康和生命。在醫(yī)院和急診室中，這些呼吸道病毒也常常是診斷和治療的難題。常見的呼吸道病毒包括：A型（甲型）流感病毒，B型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV）,腺病毒，副流感病毒1型，副流感病毒2型和副流感病毒3型。在病毒檢測方法中，抗原檢測有其無法比擬的優(yōu)勢：1.可以用于病毒的早期診斷，這對治療非常重要；2.快速、簡便的診斷方法，短時間內得出結果，節(jié)省實驗室的勞動力和成本。DHI公司的D3UltraDFA試劑屬于抗原檢測中的直接免疫熒光法。該試劑可以同時篩查和鑒定出常見的7種呼吸道病毒。D3UltraDFA試劑主要的測試對象為嬰幼兒和兒童，所以目標客戶群體為：兒童醫(yī)院、婦幼保健院和有兒科的三甲醫(yī)院。D3UltraDFA試劑D3UltraDFA試劑規(guī)格D3UltraDFA試劑分為7項呼吸道病毒篩查試劑和7項呼吸道病毒鑒定試劑。檢測病毒種類：A型（甲型）流感病毒，B型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV）,腺病毒，1、2、3型副流感病毒。具體規(guī)格如下：1/10篩查試劑：10mL,可用于400次測試鑒定試劑：每項鑒定試劑2mLX7,可用于80次測試另外，每盒試劑中含有40x濃縮洗液25mL,固定液15mL,正常鼠丙種球蛋白試劑10mL（用于陰性質控），含有7種呼吸道病毒抗原的陽性質控板5塊。D3UltraDFA試劑用途D3UltraDFA試劑能對疑似呼吸道病毒感染的患者進行快速的病毒篩查和鑒定。及時、準確地診斷對于病人的治療非常重要，這主要體現(xiàn)在以下幾點：1、病毒治療針對性強金剛烷乙胺、瑞樂沙、奧司他韋（達菲）等是抗流感病毒的特效藥。RSV和副流感病毒可以使用利巴韋林和免疫球蛋白進行治療。目前沒有專門的抗腺病毒藥物，主要采取支持療法。2、病毒治療有時效性大部分呼吸道病毒越早治療效果越好。比如，奧司他韋在體內的活性形式是一種強效的高選擇性的流感病毒NA抑制劑，它主要通過干擾病毒從被感染的宿主細胞中釋放，從而減少甲型或乙型流感病毒的傳播。因此，在出現(xiàn)流感癥狀的48小時內使用奧司他韋才有用，過了這個時間段后療效甚微。3、避免抗生素的濫用病毒不同于細菌、衣原體、支原體等原核生物，其對抗生素不敏感，不能使用抗生素進行治療。準確的診斷能幫助醫(yī)生確定是否使用抗生素來治療病人。D3UltraDFA試劑特點和優(yōu)勢1、產(chǎn)品幾乎覆蓋了所有常見呼吸道病毒的診斷2、采用直接免疫熒光法，較其他檢測方法有較大優(yōu)勢（詳見表一）3、實驗步驟較簡便，在短時間內能得出結果，從而幫助醫(yī)生更好地治療病人4、使用質量優(yōu)異的抗體，染色步驟僅需15分鐘，大大節(jié)省了實驗室的勞動力和成本，同時提高了臨床診斷的成功率，減少重復實驗5、可以監(jiān)控感染的大規(guī)模流行6、擁有強大的科研團隊，不斷研制和改進單克隆抗體表1、幾種常用檢測方法的比較2/10檢測方法優(yōu)點缺點病毒分離培養(yǎng)特異性高耗時耗力，靈敏度較低抗原檢測酶聯(lián)免疫吸附法較快速、簡便有非特異性反應間接免疫熒光法較快速有非特異性反應直接免疫熒光法（D3UltraDFA試劑）快速、簡便，靈敏度和特異性均較高需要使用熒光顯微鏡血清學檢測快速、特異性較高對疾病初期診斷沒有太大幫助分子生物學方法較快速，靈敏度和特異性均較高操作繁瑣，價格昂貴DsUltreDFA試劑實驗操作步驟1、樣品準備步驟：①將樣本充分震蕩混勻約10-15秒。②在400-600xg轉速下離心5-10分鐘。③棄上清（如果預留上清可用于細胞培養(yǎng)）。④在沉淀中加5mLPBS緩沖液（請使用普通PBS，不要使用試劑盒內配套的濃縮洗液），充分震蕩混勻約10-15秒。⑤在400-600xg轉速下離心5-10分鐘。⑥吸走上清和黏液層，小心不要吸到沉淀⑦重復步驟4到6,直至黏液層被完全去除。注意：一定要將黏液去除干凈，否則會造成非特異熒光從而影響實驗結果。⑧在沉淀中加0.5到1mL的PBS緩沖液。⑨用移液器反復吹吸來重懸細胞沉淀，形成一個略混濁的懸液。這個懸濁液可用于直接樣本測試。2、直接樣本測試步驟：①在2孔或8孔板上的每孔內滴加25nL的細胞懸濁液。②樣本完全風干。③在20°C到25°C，用預冷的100%丙酮固定細胞約5到10分鐘。注意：丙酮是易揮發(fā)、可燃性物質，使用時請遠離明火。④從丙酮中取出載玻片并風干。⑤在固定并風干的細胞上滴加一滴DFA染色試劑（如圖1），使其完全覆蓋細胞注意：2孔或8孔板上有一孔是陰性對照孔，請勿滴加DFA染色試劑）。3/10⑥在呼吸道病毒抗原對照板的每孔內也要滴加DFA染色試劑?？乖瓕φ瞻灏吮徊《靖腥镜募毎臀锤腥镜募毎?，只能一次性使用。⑦在陰性對照孔內滴加正常鼠丙種球蛋白試劑，使其完全覆蓋細胞。⑧將載玻片放于35°C到37°C的恒溫箱內孵育15到30分鐘，為保持其濕潤最好放置于帶蓋的盒子內。⑨用事先稀釋好的洗液漂洗染色細胞。為了更有效地洗滌，請將玻片在洗液中反復浸蘸4次左右。⑩使用新的1X洗液再洗一次。?用去離子水再洗一遍。圖1、在玻璃板上滴加D3UltraDFA染色試劑3、觀察實驗結果滴加2到3滴固定液，并加蓋蓋玻片（20X50mm），要注意避免產(chǎn)生氣泡。在200倍放大熒光顯微鏡下觀察結果。D3UltraDFA試劑實驗結果判讀帶FITC標記的抗體在熒光顯微鏡下會呈現(xiàn)明亮的綠色，如果細胞表面存在病毒抗原，染色后就會顯綠色。在熒光顯微鏡下，感染不同病毒的細胞會呈現(xiàn)獨有的特征（如圖2）。4/10

圖2、顯微鏡下觀察染色細胞（注：根據(jù)不同熒光顯微鏡，背景色不一定為紅色）D3UltraDFA試劑競爭優(yōu)勢檢驗的特異性和靈敏度檢驗的特異性：用D3UltraDFA呼吸道病毒篩查和鑒定試劑對多種細胞和微生物進行交叉反應測試。對64種病毒、18種細胞、19種細菌均沒有交叉反應。檢驗的靈敏度：熒光標記的單克隆抗體平均能檢測出病毒的最低濃度約為1.0PFU。3.2市場競爭主要競爭對手為西班牙Vircell公司的9項呼吸道產(chǎn)品。D3UltraDFA試劑與其主要有兩點不同：1.檢測項目不同；2.檢測原理不同1、Vircell產(chǎn)品檢測項目除了以上7種病毒外，還包含肺炎衣原體、支原體等原核生物檢測項目。但是，90%的感冒是由病毒引起的。如果是細菌、衣原體、支原體等感染，一般白細胞和C-反應蛋白（CRP）都會顯著升高，而病毒感染，這5/10兩項指標一般不會升高。我們建議醫(yī)生可以先做血常規(guī)或者CRP檢測，這樣就能區(qū)分是病毒還是細菌感染，而這兩項測試不僅快速（一般20-30分鐘），而且價格相對便宜。2、D3UltraDFA試劑的檢測原理是用熒光（FITC）標記的單克隆抗體檢測病毒抗原，屬于直接熒光免疫法。Vircell產(chǎn)品的檢測原理是用抗原檢測抗體（IgM），使用的方法是間接免疫熒光法。雖然檢測IgM能區(qū)分出是既往感染還是急性感染，但是抗體產(chǎn)生的個體差異較大，特別是1歲以下的嬰幼兒和有免疫缺陷的人群，其抗體往往產(chǎn)生較慢。短時間內，在體內抗體不足的情況下，可能會出現(xiàn)假陰性，從而錯過了治療的最佳時期。甲型流感病毒其表面抗原變異較快，而人體往往不能及時產(chǎn)生針對新毒株的抗體，這時也會造成假陰性。間接免疫熒光法會增加非特異性反應的幾率。表2、Vircell與D3UltraDFA試劑對比VircellD3UltraDFA檢測項目9項呼吸道病原體，其中包含在我國發(fā)病率很低的Q熱立克次氏體只檢測呼吸道病毒，降低患者的看病成本，患者更易接受檢測原理需要體內產(chǎn)生抗體后才能檢測出病原體，如果抗體產(chǎn)生較慢或者無抗體產(chǎn)生會有假陰性只要有病原體存在即可檢測，可在發(fā)病早期進行快速診斷臨床意義*作為回顧性診斷，對病例的早期診斷意義不大可用于疾病早期診斷，對患者的治療有重大意義檢測靈敏度不能很好地檢測變異的病毒將多種抗體進行組合，能更好地應對變異的病毒，在多項檢測項目中靈敏度達到100%檢測方法間接免疫熒光法，二抗的使用會增加非特異性反應直接免疫熒光法，特異性提高實驗步驟二抗的使用讓實驗步驟變得較為繁瑣一步染色，不易交叉污染*備注：引用自《流行性感冒診斷與治療指南（2011年版）》附錄1七種病毒檢測的臨床意義6/10流感病毒侵入呼吸道，經(jīng)1-2天的潛伏期，感染者即可出現(xiàn)流感癥狀。病毒在上皮細胞內復制，很少入血，但可釋放內毒素樣物質入血，引起全身中毒癥狀：發(fā)熱、頭痛、全身酸痛、疲乏無力、白細胞數(shù)下降等。幼兒或年老體弱病人感染流感病毒易繼發(fā)細菌感染，如合并肺炎等，病死率高。嬰幼兒特別是2-6個月的嬰兒對RSV特別敏感，常引起較為嚴重的呼吸道疾病，如細支氣管炎、肺炎等，患兒常出現(xiàn)呼吸暫停，氣管或細支氣管壞死物與粘液、纖維蛋白等結集在一起，極易阻塞患兒的呼吸道，嚴重者造成死亡。在我國RSV還是引發(fā)流行性喘憋性肺炎的主要病原，可引起嬰幼兒尤其是新生兒較高的死率。腺病毒主要引起呼吸道感染，癥狀有急性發(fā)燒、咽炎、扁桃體炎等。腺病毒肺炎約占兒童期肺炎的10%，多由腺病毒3、7型引起；嬰幼兒腺病毒肺炎的病死率為8%-10%。除呼吸道疾病外，腺病毒亦可引起其他疾病，如流行性角膜炎、出血性結膜炎、急性濾泡性結膜炎等。腺病毒與嬰幼兒胃腸道疾病也有可能相關，包括闌尾炎、急性胃腸炎，有時可引起腦炎和腦膜炎、出血性膀胱炎等。副流感病毒是引起小兒急性呼吸道感染的常見病因，僅次于RSV。副流感1、2型是哮喘的主要病因，以2-4歲兒童中最為嚴重。副流感3型，亦可引起哮喘，但主要易引起嬰幼兒支氣管炎、肺炎，并以1歲以內的嬰兒較為嚴重。病毒及其對應抗病毒藥病毒種類抗病毒藥物流感病毒金剛烷乙胺、瑞樂沙、奧司他韋（達菲）呼吸道合胞病毒利巴韋林噴霧劑副流感病毒病情嚴重者可使用利巴韋林腺病毒沒有專門的抗病毒藥物，主要采取支持療法附錄2實驗室所需設備清單（試劑盒中不含）此列表中的器材和試劑是實驗所必需的，但是未包含在試劑盒中，需要單獨購買。器材和試劑規(guī)格1鼻咽拭子建議使用DHI配套鼻咽拭子2載玻片約70mmX20mm7/10

3蓋玻片約50mmX20mm4生物安全柜2級5恒溫培養(yǎng)箱35°C-37°C6離心機管式7熒光顯微鏡可以看FITC（490/520nm），總200倍光學變焦8燒杯多種，用于洗玻片9量筒1L（配置洗液）10帶蓋瓶1L（儲存稀釋洗液）11加樣槍和槍頭多種12丙酮純度100%13普通PBS溶液0.01M(Na2HpO4,KH2PO4)，pH7.414去離子水15乳膠手套16鑷子附錄3進口熒光顯微鏡參數(shù),DigitalBioSmartftuorescentcellanatyzer,DigitalBioSmartftuorescentcellanatyzerJust