微生物次級代謝及調(diào)節(jié)3課件

第八章微生物次級代謝與控制

第三節(jié)青霉素發(fā)酵的代謝控制及育種內(nèi)容：青霉素的生物合成途徑及代謝調(diào)節(jié)選育青霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵控制青霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式：青霉素有一個四氫噻唑環(huán)和內(nèi)酰胺環(huán)。R代表側(cè)鏈，不同類型的青霉素含有不同類型的側(cè)鏈。用不同的菌種或培養(yǎng)條件不同，可以得到各種不同類型的青霉素，或同時產(chǎn)生幾種不同類型的青霉素。青霉素簡介：四氫噻唑環(huán)內(nèi)酰胺環(huán)側(cè)鏈6-APA（6-氨基青霉烷酸）歷史：1928年弗萊明發(fā)現(xiàn)點(diǎn)青霉產(chǎn)生可以殺死葡萄糖球菌的物質(zhì)，稱之為青霉素。1940年牛津大學(xué)的H.W.Flory和Chain獲得較為純凈的青霉素，殺菌效果極佳。1943～45年間，發(fā)展成了新的一個工業(yè)部門：抗生素發(fā)酵工業(yè)1945年，對青霉素發(fā)現(xiàn)做出重要貢獻(xiàn)的弗萊明、弗洛里、錢恩分享了諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。一青霉素的生物合成途徑及代謝調(diào)節(jié)

青霉素的生物合成途徑?；D(zhuǎn)移酶酰化酶青霉素G6-APAACV合成酶IPN合成酶青霉素合成的調(diào)節(jié)方式：1碳分解代謝產(chǎn)物的影響2賴氨酸的反饋調(diào)節(jié)3氮調(diào)控4磷酸鹽調(diào)控5硫調(diào)控α-酮戊二酸+乙酰CoA高檸檬酸順-高烏頭酸高異檸檬酸α-氨基己二酸σ-腺苷-α-AAA賴氨酸L-α-AAA-L-半胱氨酸異青霉素N青霉素G產(chǎn)黃青霉賴氨酸和青霉素的生物合成途徑高檸檬酸合成酶2賴氨酸的反饋調(diào)節(jié)α-氨基己二酸的初級代謝產(chǎn)物是賴氨酸，分枝次級代謝產(chǎn)物是青霉素。賴氨酸能抑制青霉素的合成，α-氨基己二酸能逆轉(zhuǎn)這種抑制。賴氨酸能反饋抑制高檸檬酸合成酶，導(dǎo)致α-氨基己二酸合成受阻，因而減少青霉素的合成。3氮調(diào)控產(chǎn)黃青霉生物合成青霉素能高濃度的銨離子抑制，這種抑制與谷胺酰胺合成酶有關(guān)：

NH4+↗，谷氨酸濃度↗，青霉素↘。NH4+還能直接阻遏產(chǎn)黃青霉的青霉素合成基因的表達(dá)。

如：乳糖培養(yǎng)的產(chǎn)黃青霉菌加入40mmol/LNH4Cl，ACV合成酶和IPN合成酶的基因受到阻遏，這種阻遏通過氮調(diào)控蛋白介導(dǎo)，它能結(jié)合到啟動子區(qū)影響其表達(dá)。4磷酸鹽調(diào)控磷酸鹽可強(qiáng)化產(chǎn)黃青霉的葡萄糖阻遏，其本身對青霉素的合成沒有明顯影響。5.硫調(diào)控硫酸鹽作為前體氨基酸半胱氨酸合成酶原料，在青霉素合成中起著重要作用。高濃度的硫酸鹽阻遏低產(chǎn)產(chǎn)黃青霉菌株的硫酸鹽通透酶而影響攝取，在硫酸鹽饑餓時，該酶活性及硫酸鹽攝取率上升。高產(chǎn)產(chǎn)黃青霉菌株呈現(xiàn)脫阻遏現(xiàn)象，即使在較高的硫酸鹽濃度下仍具有較高的通透酶活性。二選育青霉素生產(chǎn)菌1出發(fā)菌株的選擇2切斷支路代謝3解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié)4增加前體物的合成5選育形態(tài)突變株6其他標(biāo)記

1出發(fā)菌株的選擇

產(chǎn)生菌：點(diǎn)青霉菌（表面培養(yǎng)只有幾十個單位）和產(chǎn)黃青霉菌（適合深層培養(yǎng)），以產(chǎn)黃青霉菌經(jīng)過X射線，紫外誘變篩選到51-20號菌常用。●形成綠色孢子和黃色孢子的兩種產(chǎn)黃青霉菌●深層培養(yǎng)中菌絲形態(tài)為球狀和絲狀兩種，我國生產(chǎn)上大多數(shù)生產(chǎn)廠都采用綠孢子絲狀菌。

2切斷支路代謝

（1）初級代謝與次級代謝處于分枝途徑時，初級代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)缺陷型可使次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。

如：亮氨酸營養(yǎng)缺陷型，使產(chǎn)量提高4倍。α-酮戊二酸+乙酰CoA高檸檬酸順-高烏頭酸高異檸檬酸α-氨基己二酸σ-腺苷-α-AAA賴氨酸L-α-AAA-L-半胱氨酸異青霉素N青霉素G產(chǎn)黃青霉賴氨酸和青霉素的生物合成途徑高檸檬酸合成酶（3）篩選前體或前體類似物抗性突變株毒性前體或其類似物對某些微生物的生長產(chǎn)生抑制作用，且可抑制代謝終產(chǎn)物的生物合成。以苯氧基乙酸為青霉素發(fā)酵的前體，選用耐1.3％苯氧基乙酸的突變株，青霉素的發(fā)酵單位可達(dá)5萬u/ml。此外選育苯乙酸，苯乙酰胺抗性突變株也可明顯提高青霉素的產(chǎn)量。（4）選育營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株。

采用原養(yǎng)型菌株誘變成營養(yǎng)缺陷型菌株，再誘變成原養(yǎng)型菌株的途徑，獲得了比親株單位高2倍的青霉素高產(chǎn)菌。當(dāng)一種初級代謝產(chǎn)物是次級代謝產(chǎn)物的前體時，這種初級代謝產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株是獲得高產(chǎn)菌株的有效方法。α-氨基己二酸缺陷的回復(fù)突變株青霉素產(chǎn)量提高2.4倍。此外，半胱氨酸、異亮氨酸或蘇氨酸缺陷的回復(fù)突變株均可使青霉素的產(chǎn)量大幅提高。4.增加前體物的合成增加纈氨酸：丙酮酸選育Val對乙酰羥酸合成酶抑制程度低的菌株增加α-氨基己二酸：采用基因工程技術(shù)克隆同型檸檬酸合成酶基因，使之在菌體內(nèi)大量表達(dá)；進(jìn)一步再通過體外誘變使發(fā)生基因突變，表達(dá)出同型檸檬酸合成酶不再受Lys反饋抑制的酶，增加α-氨基己二酸的量。乙酰羥酸合成酶Val乙酰乳酸5選育形態(tài)突變株長期選育過程中發(fā)現(xiàn)，隨著青霉素產(chǎn)量的增加，產(chǎn)生菌落直徑變小，表面結(jié)構(gòu)由平坦變?yōu)轳薨?，孢子逐漸減少的現(xiàn)象，可以此尋找高產(chǎn)菌。深層培養(yǎng)中菌絲形態(tài)的突變有利于通氣時，可提高產(chǎn)量。（2）篩選耐消泡劑的突變株選育耐合成消泡劑的突變株，減少植物油的消耗（3）選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株產(chǎn)黃青霉菌如果膜滲透性發(fā)生改變，使其攝取無機(jī)硫酸鹽的能力提高，由于硫參與半胱氨酸的合成，這樣青霉素的產(chǎn)量也會提高。（4）構(gòu)建基因工程菌株將青霉素G?；富蜻M(jìn)行克隆，強(qiáng)化青霉素生物合成能力，構(gòu)建出的青霉素生產(chǎn)菌株產(chǎn)量提高3.3倍。三發(fā)酵控制1碳源2pH3溫度4補(bǔ)料5鐵離子的影響1碳源青霉素能利用多種碳源，如乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂等。乳糖是最好的碳源，葡萄糖也較好，但需控制其加入的濃度，因為高濃度的葡萄糖對一些酶具有阻遏作用。常采用連續(xù)添加葡萄糖的方法代替乳糖。苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸均可作為青霉素G的側(cè)鏈前體。菌體對前體的利用有兩個途徑：直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中，或作為養(yǎng)料利用。究竟采取哪個途徑，主要取決于培養(yǎng)條件以及所用菌種的特性。如早期的Q-176菌株71～94％的前體被氧化，只有2～10％轉(zhuǎn)化為青霉素；現(xiàn)代的菌株，前體轉(zhuǎn)化率為46％～96％。為了避免前體加入濃度過大而對菌體有毒害，除基礎(chǔ)料中加入0.07％的前體外，其余按需要同氮源一同補(bǔ)入。保持供應(yīng)速率略大于生物合成需要。2pH控制合成適宜pH6.2-6.8左右，避免超過7.0。pH下降：補(bǔ)加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補(bǔ)加糖、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）直接加酸或堿優(yōu)點(diǎn)：自動控制；缺點(diǎn)：滿足不了菌的代謝和合成抗生素的需要，可致菌的代謝朝不利于抗生素合成的方向發(fā)展）流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢?？蓾M足菌不同生長階段對葡萄糖的需求，對青霉素合成更有利。3溫度控制適宜菌絲生長溫度30℃,分泌青霉素20℃。20℃青霉素破壞少，周期很長。變溫控制：不同階段不同溫度。生長階段：較高溫度，縮短生長時間；生長階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素的合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制24℃。4補(bǔ)料4.1補(bǔ)加無機(jī)氮源：硫酸銨、氨水、尿素氨基氮濃度：0.01-0.05％。基礎(chǔ)料中加入0.05％尿素，并在補(bǔ)糖時再兩次補(bǔ)加尿素，可以扭轉(zhuǎn)發(fā)酵液濃度轉(zhuǎn)稀，pH降低和青霉素單位增長緩慢的情況，提高發(fā)酵單位。4.2提高產(chǎn)量的其他物質(zhì)表面活性劑：新潔爾滅、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、單油酸酯、單月桂酸