實(shí)驗(yàn)一、RNA提取及檢測ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 一、一、RNA提取及檢測提取及檢測一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩参镎莆罩参颮NA RNARNA RNA提取及檢測方法提取及檢測方法二、實(shí)驗(yàn)試劑及材料二、實(shí)驗(yàn)試劑及材料水稻葉片、液氮、水稻葉片、液氮、TrizolTrizol試劑、氯仿、異試劑、氯仿、異丙醇、丙醇、DEPCDEPC水水三、實(shí)驗(yàn)器材三、實(shí)驗(yàn)器材恒溫水浴鍋、恒溫水浴鍋、PCRPCR儀、臺(tái)式低溫離心機(jī)、儀、臺(tái)式低溫離心機(jī)、移液槍、研缽、紫外分光光度計(jì)，一次性移液槍、研缽、紫外分光光度計(jì)，一次性手套。手套。 四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 采用采用TrizolTrizol法提取法提取RNA(50RNA(50100mg100mg組織組織

2、ml trizol)ml trizol)，以加，以加1ml Trizol1ml Trizol為例，操為例，操作流程如下：作流程如下：(1) (1) 研缽加液氮數(shù)次至足夠冷，加入樣品，研缽加液氮數(shù)次至足夠冷，加入樣品，研磨至粉末。加入研磨至粉末。加入TrizolTrizol每每100mg100mg組織加組織加1ml1ml的的TrizolTrizol），充分研磨，放在室溫下解），充分研磨，放在室溫下解凍。凍。(2) (2) 除不溶性物質(zhì)：除不溶性物質(zhì)：2 28C8C下下12000g12000g離心離心10min10min，不溶性物質(zhì)沉淀，將，不溶性物質(zhì)沉淀，將RNARNA的上清移入的上清移入1.5

3、 ml1.5 ml離心管中。離心管中。(3)(3)相分離：在相分離：在15153030下放置下放置5min5min，使核，使核蛋白復(fù)合物完全解離。加蛋白復(fù)合物完全解離。加0.2ml0.2ml氯仿，劇烈氯仿，劇烈振蕩振蕩15 sec15 sec，室溫下溫浴，室溫下溫浴2 23min3min。2 288下，下，12000g12000g離心離心15min15min，RNARNA全部溶解于全部溶解于上層水相中，把水相移入另一上層水相中，把水相移入另一1.5ml1.5ml離心管離心管中。中。 (4) 氯仿再次去雜：加0.5ml氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫下溫浴23min；28下，12000g離心15m

4、in，把水相轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中。(5) RNA沉積：加入0.5ml異丙醇，1530溫浴10min；2-8下，12000g離心10min，RNA沉積在離心管的底部及側(cè)壁。(6)清洗RNA：加入1ml 75%乙醇，28下7500g離心5min，小心將上清液倒掉。(7)再清洗：加入1ml 75%乙醇，28下，7500g離心5min，小心將上清液倒掉。(8)RNA的溶解：將離心管倒扣在吸水紙上510min，每管加30l的DEPC水，可在5560下助溶10min。(9)RNA濃度：用DEPC水稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì) 測定OD值260nm、280nm 230nm），估算RNA濃度。-70 保管

5、。總RNA定量方法 RNA在260nm波長處有最大吸收峰。OD值為1相當(dāng)于大約40g/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑，用 ddH2O稀釋DNA樣品n倍并以ddH2O為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：RNAmg/ml）=40OD260讀數(shù)稀釋倍數(shù)(n)/1000RNARNA濃度檢測過程濃度檢測過程（1 1取少量待測取少量待測RNARNA樣品，用樣品，用DEPC DEPC 水稀釋水稀釋100100倍。倍。（2 2用用DEPC DEPC 水做空白，在水做空白，在260 nm260 nm、280 nm280 nm、230 nm230 nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)至零

6、。處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)至零。（3 3加入待測加入待測RNARNA樣品在三個(gè)波長處讀取樣品在三個(gè)波長處讀取ODOD值。值。 RNA RNA純品的純品的OD260/OD280OD260/OD280的比值為的比值為2.02.0，故根據(jù)，故根據(jù)OD260/OD280OD260/OD280的比值可以估計(jì)的比值可以估計(jì)RNARNA的純度。若比值較低，的純度。若比值較低，說明有殘余蛋白質(zhì)存在；比值太高，則提示說明有殘余蛋白質(zhì)存在；比值太高，則提示RNARNA有降有降解。解。 OD260/OD230 OD260/OD230比值應(yīng)比值應(yīng) 2.0 2.0，若比值較低說明鹽，若比值較低說明鹽分過高。分過高。電

7、泳檢測電泳檢測RNARNA質(zhì)量：質(zhì)量：（1 1配制配制1.2%1.2%的瓊脂糖凝膠的瓊脂糖凝膠20mL20mL）稱取瓊脂糖稱取瓊脂糖0.24 g0.24 g，加，加DEPCDEPC處理的處理的ddH2O 12.04 mLddH2O 12.04 mL，5 5RNA RNA 電泳緩沖液電泳緩沖液4 mL4 mL，電爐加熱融化瓊脂糖，冷卻，電爐加熱融化瓊脂糖，冷卻至至5555C C，加入甲醛，加入甲醛1.96 mL1.96 mL，冷卻后倒膠。，冷卻后倒膠。（2 2RNARNA電泳電泳取去離子甲酰胺取去離子甲酰胺10 L10 L，甲醛，甲醛1.5 L1.5 L，1010 RNA RNA Buffer

8、2 LBuffer 2 L，RNA (2RNA (24 g, 10 L)4 g, 10 L)混合液，混合液，6565C C加熱加熱15min15min，迅速在冰浴中冷卻片刻，然后加入，迅速在冰浴中冷卻片刻，然后加入3 3 L RNA L RNA 加樣緩沖液和加樣緩沖液和0.5 L EB0.5 L EB，上樣電泳。電泳，上樣電泳。電泳Buffer Buffer 為為1 1 RNA buffer RNA buffer。（2RNA電泳結(jié)果判別質(zhì)量： 出現(xiàn)的電泳條帶有兩條，是兩條最大的核糖體RNArRNA分子，即18S 和28S rRNA，較小的RNA也很豐富但看不到，因?yàn)樘?，跑出了凝膠的邊界。多數(shù)

9、細(xì)胞中的信使RNAmRNA經(jīng)EB染色后不足以形成可見的帶。只要18S 和28SrRNA帶亮，且28S rRNA大約為18S rRNA 的兩倍，說明提取的RNA沒有發(fā)生降解，純度好。五、總五、總RNARNA提取常見問題分析提取常見問題分析vRNA降解降解v1、外源、外源RNA酶的污染：試劑，器械及實(shí)驗(yàn)環(huán)酶的污染：試劑，器械及實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的境中的RNA酶進(jìn)入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。酶進(jìn)入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。v2、內(nèi)源、內(nèi)源RNA酶的污染：抑制劑失效或者用量酶的污染：抑制劑失效或者用量不夠，實(shí)驗(yàn)樣品過多；勻漿時(shí)溫度過高。不夠，實(shí)驗(yàn)樣品過多；勻漿時(shí)溫度過高。v3、外源性污染也可以排除，那么降解幾乎都、外源性污染也可以排除，那么

10、降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如果將裂解液直接加來自裂解液的用量不足。如果將裂解液直接加入培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞，一定要使裂解液能覆蓋入培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞，一定要使裂解液能覆蓋住細(xì)胞。在液氮條件下將組織研碎，并且勻漿住細(xì)胞。在液氮條件下將組織研碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。樣品取材后應(yīng)立即置于液時(shí)使用更多裂解液。樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后移至氮中速凍，然后移至-70冰箱保存。樣品決不冰箱保存。樣品決不能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于-70冰箱中。樣冰箱中。樣品在與裂解液充分接觸前決不能出現(xiàn)融化，所品在與裂解液充分接觸前決不能出現(xiàn)融化，所以研磨用具必須預(yù)冷。以研磨用具必須

11、預(yù)冷。OD260/OD280比值偏低1. 蛋白質(zhì)污染：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，則用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。2.苯酚殘留：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。3.多糖或多酚的殘留：一些特殊的組織和植物中，多糖、多酚含量較多，這些殘留也會(huì)導(dǎo)致OD260/OD280比值偏低。因此，從這類材料中提取RNA時(shí)，需要注意多糖、多酚雜質(zhì)的去除。4.設(shè)備限制：測定OD260及OD280數(shù)值時(shí)，要使OD26

12、0讀數(shù)在0.1-0.5之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測OD值時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用10mM Tris，pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值偏低。vRNA提取得率低提取得率低1. 該組織或者細(xì)胞中該組織或者細(xì)胞中RNA含量偏低：含量偏低：v 不同細(xì)胞和組織中不同細(xì)胞和組織中RNA的豐度不同，如肝臟，胰腺，心臟的豐度不同，如肝臟，胰腺，心臟等是高豐度組織等是高豐度組織(總總RNA含量含量2-4g/mg)，腦，胚胎，腎臟，肺，腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢等是中豐度組織胸腺，卵巢等是中豐度組織(總總RNA含量含量0.05-2g/mg)，膀胱，膀胱，骨，脂肪等是低豐度組織骨，脂肪等是低豐度組織(總總RNA含量含量0.05g/mg)。2. 組織起始量太少或者太多：組織起始量太少或者太多：v 樣品量過少，則細(xì)胞組織中樣品量過少，則細(xì)胞組織中RNA含量較低；樣品量過多則含量較低；樣品量過多則可能超過裂解液的裂解能力，裂解將不完全，從而導(dǎo)致可能超過裂解液的裂解能力，裂解將不完全，從而導(dǎo)致RNA得得率低。率低。v六、本卷須知：六、本卷須知