第十二章其他分子診斷檢測技術(shù)課件

第十二章

其他分子診斷檢測技術(shù)第十二章

其他分子診斷檢測技術(shù)1目錄第一節(jié)基因變異檢測技術(shù)第二節(jié)脈沖電場凝膠電泳第三節(jié)分子影像目錄第一節(jié)基因變異檢測技術(shù)2第一節(jié)基因變異檢測技術(shù)檢測已知的基因突變檢測未知的基因突變分子診斷檢測基因突變的目的：第一節(jié)基因變異檢測技術(shù)檢測已知的基因突變分子診斷檢測基因3幾種常見的基因變異檢測方法PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)溫度梯度凝膠電泳和變性梯度凝膠電泳變性高效液相色譜法錯配接合蛋白質(zhì)截短測試法幾種常見的基因變異檢測方法PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)4一、PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)

(PCRamplificationregractorymytationsystem,PCR-ARMS)以PCR方法為基礎(chǔ)，檢測已知點(diǎn)突變的一種方法。又叫做PCR等位基因特異性擴(kuò)增法（PCRamplificationofspecificalleles,PASA）或等位基因特異性PCR

(alleles-specificPCR,ASPCR)一、PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)

(PCRamplificati5（一）基本原理PCR的引物3’末端的核苷酸與模板之間存在錯配時，PCR擴(kuò)增效果差，或者不能擴(kuò)增。模板3’5’引物5’3’×ATGTTATACAACPCR-ARMS（一）基本原理PCR的引物3’末端的6設(shè)計2對引物，一對引物（P1）與正?；蛲耆ヅ洌粚σ?P2)與突變基因完全匹配。用這兩對引物分別擴(kuò)增模板。如果模板基因?yàn)檎；?，那么P1擴(kuò)增可以得到大量產(chǎn)物，而P2無產(chǎn)物。如果模板已經(jīng)突變，那么P2擴(kuò)增可以獲得大量產(chǎn)物，而P1無產(chǎn)物。PCR-ARMS基本原理PCR-ARMS設(shè)計2對引物，一對引物（P1）與正常基因完全匹配，一對引物(75’3’3’5’

ATGGTTCCTG

TACCAAGGAC5’3’3’5’ATGGTACCTGTACCATGGAC突變等位基因正常等位基因順利延長不能延長5’3’ATCGTT5’3’ATCGTT×突變基因的引物P2的擴(kuò)增PCR-ARMS5’8（二）應(yīng)用檢測單一點(diǎn)突變基因分型檢測多位點(diǎn)突變PCR-ARMS的應(yīng)用（二）應(yīng)用檢測單一點(diǎn)突變PCR-ARMS的應(yīng)用91.檢測單一點(diǎn)突變設(shè)計一對引物，可以擴(kuò)增突變基因而對正?；虺蕯U(kuò)增阻遏；附加一對引物，可以擴(kuò)增標(biāo)志性基因作為陽性對照；PCR擴(kuò)增完成，進(jìn)行電泳，即可得知點(diǎn)突變是否發(fā)生。MMGNG異常陽性對照突變基因PCR-ARMS的應(yīng)用1.檢測單一點(diǎn)突變設(shè)計一對引物，可以擴(kuò)增突變基因而對正?；?02.基因分型可用于單個突變的基因分型（鑒別雜合子和純合子）或多態(tài)性分析PCR-ARMS的應(yīng)用1:正?；虻囊飻U(kuò)增結(jié)果；2：突變基因的引物擴(kuò)增結(jié)果MWt1Wt2Ht1Ht2Hm1Hm2野生純合子雜合子突變純合子方法一：正常等位基因野生純合子點(diǎn)突變突變雜合子穩(wěn)定遺傳突變純合子2.基因分型可用于單個突變的基因分型（鑒別雜合子和純合子）11方法二：野生純合子雜合子突變純合子MWtHtHm5’3’3’5’496bp371bp野生型基因引物突變型基因引物突變點(diǎn)PCR-ARMS的應(yīng)用方法二：野生突變MWt123.檢測多位點(diǎn)突變突變點(diǎn)1突變點(diǎn)2片段1片段2PCR-ARMS的應(yīng)用PCR-ARMS可同時檢測多個點(diǎn)突變。3.檢測多位點(diǎn)突變突變點(diǎn)1突變點(diǎn)2片段1片段2PCR-A13（三）方法學(xué)評價適用于較少點(diǎn)突變的檢測；具有低-中等批量處理能力；可借助多重PCR檢測多個點(diǎn)突變；無需放射性標(biāo)記；無需昂貴的試劑；無需復(fù)雜的檢測系統(tǒng)PCR-ARMS優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)只能檢測已知的基因突變及多態(tài)性（三）方法學(xué)評價適用于較少點(diǎn)突變的檢測；PCR-ARMS優(yōu)點(diǎn)14二、寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)

(oligonucleotideligationassay,OLA)利用DNA連接酶，將2段寡核苷酸探針順向連接，從而檢測靶基因型的一種方法。該方法因?yàn)榭煽?、精確、重現(xiàn)性好，已成為臨床遺傳病分子診斷的一種基本方法。二、寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)

(oligonucleotideli15（一）基本原理嗜溫性或耐熱的連接酶具有高特異性和高保真性，它能連接與模板序列完全互補(bǔ)的兩段核苷酸片段。OLA的基本原理DNA連接酶5’3’

TACCAAGGACGATTCCTGATC

ATGGTTCCTG

CTAAGGACTAG3’5’5’3’

TACCAAGGACGATTCCTGATC

ATGGTTCCTA

CTAAGGACTAG3’5’×（一）基本原理嗜溫性或耐熱的連接酶具有高特異性和高保真性，它16雙等位基因變異的檢測OLA的基本原理探針15’

等位基因A

3’

TACCAAGGACGATTCCTGATC

ATGGTTCCTG

CTAAGGACTAG3’5’

TACCAAGGAGGATTCCTGATC

ATGGTTCCTC

CTAAGGACTAG3’5’探針25’等位基因a3’通用探針雙等位基因變異的檢測OLA的基本原理探針15’17OLA實(shí)驗(yàn)的操作耐熱連接酶，可使變性和連接連續(xù)進(jìn)行，產(chǎn)物呈線性增長，大大增加了檢測的靈敏度；若PCR擴(kuò)增引物的Tm值大于探針的Tm值，可在同一管內(nèi)先進(jìn)行PCR，再進(jìn)行OLA實(shí)驗(yàn)，大大減少了污染，提高檢測效率。2.條件：1.反應(yīng)體系：3.方法的發(fā)展：2個探針、DNA連接酶、模板探針與靶序列的雜交區(qū)域足夠長（>20bp）溫度：能使探針和靶序列雜交OLA的基本原理OLA實(shí)驗(yàn)的操作耐熱連接酶，可使變性和連接連續(xù)進(jìn)行，產(chǎn)物呈線18（二）臨床應(yīng)用鐮狀細(xì)胞貧血癥的分子診斷、產(chǎn)前檢查多種遺傳病及常見病的檢測(P168)；局部地區(qū)人群的遺傳病分子檢測PCR-OLA的應(yīng)用（二）臨床應(yīng)用鐮狀細(xì)胞貧血癥的分子診斷、產(chǎn)前檢查PCR-OL19（三）方法學(xué)評價能可靠地鑒別基因型及純、雜合子；不容易產(chǎn)生假陰性和假陽性結(jié)果；利用耐熱連接酶循環(huán)進(jìn)行連接，使信號放大，更增強(qiáng)了該法的靈敏度優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：需要多相參與，增加實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜度；需要PCR擴(kuò)增與OLA相結(jié)合，PCR的非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致了該方法的重現(xiàn)性不夠PCR-OLA的方法學(xué)評價（三）方法學(xué)評價能可靠地鑒別基因型及純、雜合子；優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：20三、溫度梯度凝膠電泳和變性梯度凝膠電泳利用不同的分子在不同濃度的變性劑作用下，失活而改變分子構(gòu)象，進(jìn)而進(jìn)行分離的一種電泳技術(shù)。利用不同的分子在不同的溫度下，構(gòu)象改變的不同而進(jìn)行分離的一種電泳技術(shù)。溫度梯度凝膠電泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE）變性梯度凝膠電泳

(denaturing-gradientgelelectrophoresis,DGGE)46℃50℃

54℃

58℃

62℃－＋三、溫度梯度凝膠電泳和變性梯度凝膠電泳21（一）TGGE的基本原理普通的非變性凝膠電泳不能分離具有相似長度的DNA，所以也不能分離發(fā)生了單核苷酸突變的DNA序列。但是在溫度梯度凝膠電泳中，隨著溫度的逐漸升高，DNA分子會呈階梯式逐步發(fā)生解鏈。部分解鏈的雙鏈DNA分子表現(xiàn)出一種復(fù)雜的分枝構(gòu)象，使得其電泳遷移率大大下降。

TGGE（一）TGGE的基本原理普通的非變性凝膠22TGGE的基本原理TGGE5’3’3’5’

ATGGTTCCTG

TACCAAGGAC3’5’

ATGGCTCCTG

TACCGAGGAC5’3’正常等位基因突變等位基因Tm=54℃Tm=58℃46℃50℃

54℃

58℃

62℃－＋

正常基因突變基因TGGE的基本原理TGGE5’3’ATGGTTCCTG23（二）突變的檢測原理正常等位基因點(diǎn)突變突變雜合子穩(wěn)定遺傳突變純合子PCR擴(kuò)增wt/wtwt/wt,mt/mt,wt/mt,mt/wtmt/mtPCR產(chǎn)物基因型TGGE（二）突變的檢測原理正常等位基因點(diǎn)突變突變雜合子穩(wěn)定遺傳突變24123456

123456a異源b雙鏈帶c同源d雙鏈帶1，5，6為點(diǎn)突變的雜合子；2為突變的純合子；3，4為野生的純合子.TGGE1225（三）變性梯度凝膠電泳（DGGE）實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理與TGGE一致，只不過在DGGE中，變性條件取代了TGGE的溫度。在DGGE試驗(yàn)中，有2個變性條件：熱：一般采用60℃的恒定溫度；變性劑：固定比率的甲酰胺、尿素TGGE/DGGE如果想要獲得很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還有耐于利用相關(guān)軟件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件：電泳時間、凝膠的濃度、變性的梯度等。（三）變性梯度凝膠電泳（DGGE）實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理26（四）臨床應(yīng)用廣泛應(yīng)用于疾病基因的突變檢測，尤其是一個等位基因發(fā)生突變就會引起的疾病檢測；篩選人類基因的多態(tài)性；人類基因的突變檢測，如P53、FBN1等基因；線粒體DNA中的基因突變及多態(tài)性檢測；糞便及腸內(nèi)微生物多態(tài)性的鑒定；病毒基因組的突變鑒定及不同病毒株之間的基因組差異鑒定。TGGE/DGGE（四）臨床應(yīng)用廣泛應(yīng)用于疾病基因的突變檢測，尤其是一個等位基27（五）方法學(xué)評價高分辨率，能100%檢出對單個堿基突變的基因；結(jié)合GC夾、補(bǔ)骨脂素夾或雙邊夾，可提高其靈敏度，獲得更高的檢出率。TGGE/DGGE優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)合成帶GC夾的引物需要特定的儀器，成本較高。（五）方法學(xué)評價高分辨率，能100%檢出對單個堿基突變的基因28色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術(shù)，其原理是利用待分離的各種物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同來進(jìn)行分離的。將它用于分析化學(xué)并配合適當(dāng)?shù)臋z測手段，就成為色譜分析法。高效液相色譜：以液體為流動性，高速、高效率地分離混合物的一種色譜技術(shù)。變性高效液相色譜：改進(jìn)傳統(tǒng)高效液相色譜的分離系統(tǒng)，并運(yùn)用變溫分析方式，高效分離各種生物大分子（包括DNA）的一種方法。四、變性高效液相色譜法

（denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)DHPLC色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術(shù)，其原理是利用29排阻色譜親和色譜排阻色譜親和色譜30（一）DHPLC的基本原理DHPLC的分離系統(tǒng)DHPLC分離DNA的原理DHPLC檢測突變的原理DHPLC（一）DHPLC的基本原理DHPLC的分離系統(tǒng)DHPLC311.DHPLC的分離系統(tǒng)DHPLC1.色譜柱的填料

特性：電中性，疏水性固定相:C18基質(zhì)：聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB)2.離子對試劑：三乙基銨醋酸鹽（TEAA）

特性：帶正電荷，疏水性3.流動相：乙腈

特性：通過改變濃度，將DNA分子按結(jié)合程度的不同，逐步洗脫下來。1.DHPLC的分離系統(tǒng)DHPLC1.色譜柱的填料固定相32PO3-TEAAC182.DHPLC分離DNA的原理DHPLCPO3-2.DHPLC分離DNA的原理DHPLC33DHPLC3.DHPLC檢測突變的原理變性后，緩慢退火分離手段：非變性分離部分變性分離完全變性分離DHPLC3.DHPLC檢測突變的原理變性后，緩慢退火分離34（二）臨床應(yīng)用乳腺癌相關(guān)基因BRCA1、BRCA2及ATM等疾病相關(guān)基因的分子檢測；短的串聯(lián)重復(fù)序列的基因分型；腫瘤樣本中雜合性缺失的檢測；Y染色體和常染色體DNA序列的篩查酵母、擬南芥、果蠅及小鼠的基因組作圖及基因克隆。DHPLC（二）臨床應(yīng)用乳腺癌相關(guān)基因BRCA1、BRCA2及ATM等35（三）方法學(xué)評價優(yōu)點(diǎn)：具有更高的準(zhǔn)確性和敏感度。DHPLC檢測特性SSCPTGGE/DGGEDHPLCDNA測序檢出范圍<300bp100-500bp150-600bp>0.5%的變異>20%的變異檢出率50%-95%40%-100%100%80%工作度需要特殊的GC夾輔助，增加了工作量快速，2-3min費(fèi)時費(fèi)力（三）方法學(xué)評價優(yōu)點(diǎn)：具有更高的準(zhǔn)確性和敏感度。DHPLC檢36錯配接合蛋白質(zhì)截短測試法（PTT）：又稱為體外蛋白質(zhì)合成檢測技術(shù)(IVPS),只檢測與疾病相關(guān)的突變，即檢測使蛋白不能全長翻譯的突變。五、錯配接合蛋白質(zhì)截短測試法

（proteintruncationtest,PTT)錯配接合蛋白質(zhì)截短測試法（PTT）：又37（一）PTT的原理PTT檢測基因缺失、異常的復(fù)制或剪接檢測翻譯終止突變（一）PTT的原理PTT檢測基因缺失、檢測翻譯終止突變38（二）臨床應(yīng)用最早被用于杜氏肌營養(yǎng)不良的檢測；家族性腺瘤樣息肉??；遺傳性硬纖維瘤??；共濟(jì)失調(diào)—毛細(xì)血管擴(kuò)張癥；遺傳性乳腺癌；卵巢癌等。PTT（二）臨床應(yīng)用最早被用于杜氏肌營養(yǎng)不良的檢測；PTT39（三）方法學(xué)評價優(yōu)點(diǎn)：PTT不僅可檢測出只與疾病相關(guān)的蛋白截短突變，還能檢測出在RNA形成過程中發(fā)生的突變。可以直接采用mRNA進(jìn)行檢測，減少了操作步驟，加快了分析進(jìn)程；只鑒定引起疾病的截短突變，不會受到基因沉默的影響；截短蛋白質(zhì)分子的長度指明了突變的位置，可以更方便地進(jìn)行DNA測序分析以確定突變。（三）方法學(xué)評價優(yōu)點(diǎn)：PTT不僅可檢測出只與疾病相關(guān)的蛋白截40DHPLC缺點(diǎn)：最佳檢測范圍為<2kb的基因組或1.3-1.6kb的cDNA，因此對于序列較長、包含多個外顯子的疾病基因，需要分幾次進(jìn)行檢測；PTT因?yàn)槟z的分辨率，而檢測不出編碼序列中小的插入或錯義突變；引起RNA產(chǎn)量改變或使mRNA不穩(wěn)定的突變可能被漏檢。DHPLC缺點(diǎn)：最佳檢測范圍為<2kb的基因組或1.3-1.41謝謝！謝謝！42第二節(jié)脈沖電場凝膠電泳交替采用兩個方向的不均勻電場，使DNA分子在連續(xù)間隔交替的電場中，不斷改變方向運(yùn)動，從而將DNA按分子大小分開的電泳技術(shù)。脈沖電場凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)特點(diǎn)：能分離50kb-10Mb的DNA片段。第二節(jié)脈沖電場凝膠電泳交替采用43在PFGE中，電場的方向、脈沖時間和電壓大小可交替改變。在每次電場方向改變時，DNA分子都需要時間來改變其分子構(gòu)型和遷移方向。DNA分子越大，分子構(gòu)型轉(zhuǎn)換所需的時間越長，轉(zhuǎn)變遷移方向的時間也越長。不同大小的DNA分子，因?yàn)槠涓淖冇緞臃较虻臅r間不同，遷移速度也就不同，從而可以在脈沖電場中很好地分開。一、PFGE的原理在PFGE中，電場的方向、脈沖時間和電壓大小可交替改變。一44二、PFGE的一般步驟真核或原核細(xì)胞包埋原位裂解限制性酶切脈沖電泳結(jié)果分析原位裂解獲得完整的染色體DNA與瓊脂糖混合制備包埋塊（含有染色體）限制性酶切后電泳二、PFGE的一般步驟真核或原核細(xì)胞包埋原位裂解獲得完整的染45三、PFGE的種類倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（field-inversiongelelectrophoresis,FIGE）交流電場凝膠電泳（transverse-alternatingfieldgelelectrophoresis,TAFE）鉗位均勻電場凝膠電泳（contour-clampedhomogeneouselectricfields,CHEF）旋轉(zhuǎn)凝膠電泳（rotatinggelelectrophoresis,RGE）三、PFGE的種類倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（field-invers46兩個電場方向?yàn)?80°脈沖間隔時間為：向前﹕向后=3﹕1裝置簡單：電泳槽和脈沖電極控制器分離片段范圍：10kb-800kb特點(diǎn)：1.倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（FIGE）兩個電場方向?yàn)?80°特點(diǎn)：1.倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（FIGE47兩個電場方向?yàn)?15°~165°樣品在凝膠中呈“之”字形泳動分離片段可大至1600kb在病原生物的基因分析中有特殊的用途特點(diǎn)：2.交流電場凝膠電泳（TAFE）兩個電場方向?yàn)?15°~165°特點(diǎn)：2.交流電場凝膠48目前應(yīng)用最廣泛的一類脈沖電泳沒有所謂的“負(fù)極”,兩個主要的電場方向呈120°DNA分子在凝膠中能很好地聚焦分離片段可大至7000kb特點(diǎn)：3.鉗位均勻電場凝膠電泳（CHEF）目前應(yīng)用最廣泛的一類脈沖電泳特點(diǎn)：3.鉗位均勻電場凝膠電泳（49只有一個均一的電場凝膠可以周期性旋轉(zhuǎn)用于不同電場角度時，脈沖時間、電壓等參數(shù)對DNA分離效果的影響分離片段范圍：50kb-6000kb特點(diǎn)：4.旋轉(zhuǎn)凝膠電泳（RGE）只有一個均一的電場特點(diǎn)：4.旋轉(zhuǎn)凝膠電泳（RGE）50（二）PFGE的應(yīng)用菌株的基因分型；制備某個菌株的染色體圖譜；大質(zhì)粒的分離和大小測定。PFGE（二）PFGE的應(yīng)用菌株的基因分型；PFGE51菌株的基因分型；傳統(tǒng)的細(xì)菌分型方法：生物學(xué)分型；血清學(xué)分型；噬菌體分型；細(xì)菌素分型；優(yōu)點(diǎn)：分辨率高；準(zhǔn)確度高；對流行病學(xué)的研究貢獻(xiàn)大PFGE菌株的基因分型；傳統(tǒng)的細(xì)菌分型方法：生物學(xué)分型；優(yōu)點(diǎn)：分辨522.制備某個菌株的染色體圖譜作用：鑒定基因大??；構(gòu)建菌株的基因組物理圖譜ABPFGE2.制備某個菌株的染色體圖譜作用：鑒定基因大?。籄533.大質(zhì)粒的分離和大小測定操作方法：將細(xì)菌包埋在瓊脂糖塊中；裂解細(xì)胞壁；S1核酸酶酶切；PFGE電泳PFGE3.大質(zhì)粒的分離和大小測定操作方法：將細(xì)菌包埋在瓊脂糖塊中54第三節(jié)分子影像

1999年由Weissleder等人提出，也被稱為分子成像或分子顯像，它是指在活體狀態(tài)下從細(xì)胞、基因和分子水平，通過無創(chuàng)傷的影像技術(shù)，對其生物學(xué)行為進(jìn)行定性和定量研究。分子影像(molecularimaging)第三節(jié)分子影像1999年由Weissl55

分子探針是分子影像中的關(guān)鍵組成部分，高特異性的分子探針是進(jìn)行分子影像學(xué)研究的先決條件。一、分子影像探針分子探針示蹤劑:放射性核素、順磁性物質(zhì)或熒光素等能參與體內(nèi)自然的生理生化活動的特殊分子:受體、生物酶及單克隆抗體分子影像探針：一類帶有示蹤劑，能參與體內(nèi)自然的生理生化活動的特殊分子。分子探針是分子影像中的關(guān)鍵組成部分，高特異性的分子探針56分子探針需要具備的特點(diǎn)：相對分子質(zhì)量小、純度高、安全，不影響所研究的疾病過程；具有良好的生物學(xué)功能，能參與人體正常的生理生化活動；能夠克服人體內(nèi)部的“生理屏障”（如腦屏障、血管壁、細(xì)胞膜等），順利到達(dá)靶分子所在的器官，同時不會積聚于其他組織；示蹤劑、分子探針和靶分子應(yīng)該緊密結(jié)合，不能脫落，且有足夠長的半衰期以便于檢測。分子探針需要具備的特點(diǎn)：相對分子質(zhì)量小、純度高、安全，不影57根據(jù)分子探針的不同，分子影像有2種基本的檢測策略：1.直接成像2.間接成像：

采用一個特異性探針(細(xì)胞表面報告分子、細(xì)胞內(nèi)分子或基因表達(dá)產(chǎn)物），它與靶分子作用可直接提供一個與靶分子濃度相關(guān)的信號而成像。一般需要一個報告基因和一個報告探針，它們在特定的靶細(xì)胞中相互作用產(chǎn)生一個代謝物截留于細(xì)胞中發(fā)出信號，通過成像設(shè)備探測到而成像。根據(jù)分子探針的不同，分子影像有2種基本的檢測策略：1.直58二、分子影像學(xué)技術(shù)（一）放射性核素成像（radionuclideimaging）（二）磁共振成像（magneticresonanceimaging,MRI）（三）光學(xué)成像（opticalimaging）二、分子影像學(xué)技術(shù)（一）放射性核素成像（radionucl59正電子發(fā)射計算機(jī)斷層成像技術(shù)（positronemissiontomography,PET）單光子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描技術(shù)（singlephotonemissioncomputedtomography,SPECT）2.常用的放射性核素成像技術(shù)：（一）放射性核素成像1.概念將有明確生物學(xué)效應(yīng)的放射性探針導(dǎo)入人體內(nèi)，使它參與體內(nèi)的生物學(xué)活動，利用相關(guān)成像技術(shù)進(jìn)行探測和顯像，以反映體內(nèi)特定的生物學(xué)活動過程，從而了解體內(nèi)的生理、生化狀態(tài)。正電子發(fā)射計算機(jī)斷層成像技術(shù)（positronemiss60又被稱為生化顯像或功能分子顯像技術(shù)，集中了核物理、放射化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)影像新技術(shù)的優(yōu)勢，從分子水平上觀察細(xì)胞代謝的活動，可提供獨(dú)特的生理性示蹤研究和活體生化顯像。特點(diǎn)：正電子發(fā)射計算機(jī)斷層成像技術(shù)（positronemissiontomography,PET）又被稱為生化顯像或功能分子顯像技術(shù)，集中了核物61檢測策略

將人體代謝所需要的物質(zhì)（如葡萄糖、蛋白質(zhì)等）標(biāo)記上短壽命的放射性核素（如14C、13N）制成探針注入人體內(nèi)。因?yàn)椴∽兘M織和正常組織的代謝狀態(tài)不同，它們富集的示蹤劑的量不同。示蹤劑中的放射性核素的正電子與人體內(nèi)的一個負(fù)電子湮滅能產(chǎn)生兩個互呈180°發(fā)射的γ光子，而被PET設(shè)備捕獲。通過對放射性核素的檢測成像，PET可顯示出示蹤劑的分布情況和聚集的部位、組織或器官以及量的多少，從而對疾病進(jìn)行定位、定量、定性及定期分析。（1）直接成像：檢測策略將人體代謝所需要的物質(zhì)（如葡萄糖、蛋白質(zhì)62

常用的報告基因：單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）等（2）間接成像：原理：胸苷類似物經(jīng)放射性核素標(biāo)記后稱為探針，可以通過主動轉(zhuǎn)運(yùn)自由通過細(xì)胞膜。但該物質(zhì)可被細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出的HSV-TK酶磷酸化，而不能再自由穿過細(xì)胞膜而滯留于細(xì)胞內(nèi)，其放射性的信號指示HSV-TK的存在，證明外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。常用的報告基因：單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）等（63某個特定的器官或組織細(xì)胞表達(dá)HSV-TKHSV-TK與胸苷類似物特異性結(jié)合，并發(fā)生磷酸化成像發(fā)出信號HSV-TK基因攜帶報告基因的細(xì)胞帶標(biāo)記的探針檢測信號間接成像示意圖某個特定的器官或組織細(xì)胞表達(dá)HSV-TKHSV-TK與胸苷類642.SPECT技術(shù)原理：通過探測和處理體內(nèi)的放射性核素自行發(fā)射的單個的γ光子構(gòu)成斷層圖像，它可以反映器官結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)，現(xiàn)已用于臨床檢測。與PET技術(shù)的方法學(xué)比較：PET技術(shù)：一次檢查，全身顯像；但設(shè)備昂貴，且核素半衰期短，不能同時檢測多個探針SPECT技術(shù)：價格便宜，可同時進(jìn)行多探針成像；但只能進(jìn)行半定量分析。2.SPECT技術(shù)原理：與PET技術(shù)的方法學(xué)比較：65（二）磁共振成像基本原理在外加磁場的作用下，氫原子核（H）即質(zhì)子以一種特定方式繞磁場方向旋轉(zhuǎn)。用一個適當(dāng)頻率的射頻脈沖從與主磁場相垂直的方向上對質(zhì)子進(jìn)行激發(fā)后，會引起質(zhì)子共振，成為激發(fā)態(tài)，即所謂磁共振。在射頻脈沖停止后，質(zhì)子在由激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵紤B(tài)時，會發(fā)射出與激發(fā)脈沖頻率相同的信號。通過身體附近的接受器接收，并經(jīng)計算機(jī)處理，就可獲得MRI圖像。人體2/3的重量為水分，如此高的比例正是磁共振成像技術(shù)能被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷的基礎(chǔ)。人體內(nèi)器官和組織中的水分并不相同，很多疾病的病理過程會導(dǎo)致水分形態(tài)的變化，即可由磁共振圖像反應(yīng)出來。（二）磁共振成像基本原理在外加磁場的作用66MRI顯示左腎囊腫MRI顯示左腎囊腫67磁共振成像的策略——間接成像為了增強(qiáng)磁共振在病變組織的信號，通常采用標(biāo)記報告基因，并將其轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞并在靶細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增來放大MR信號成像。常用的報告基因：酪氨酸激酶β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)鐵蛋白受體磁共振成像的策略——間接成像為了增強(qiáng)磁共振68酪氨酸激酶胞內(nèi)受體；它是黑色素合成的限速酶，而黑色素有高度結(jié)合鐵的能力；酪氨酸激酶的過量表達(dá)會導(dǎo)致黑色素合成增加，從而使其結(jié)合鐵的量也相應(yīng)增加，而增強(qiáng)MR信號。酪氨酸激酶胞內(nèi)受體；692.β-半乳糖苷酶胞內(nèi)受體；該系統(tǒng)采用的分子探針：由釓（ga）的不配對電子組成，探針周圍由一個化學(xué)箍環(huán)封閉，不能與水分子反應(yīng)，箍環(huán)上有一個糖分子作“門”。當(dāng)β-半乳糖苷酶存在時，糖分子被降解，“門”開放，釓就暴露在水分子中，其不配對電子與氫質(zhì)子作用，增強(qiáng)了MR信號。2.β-半乳糖苷酶胞內(nèi)受體；703.轉(zhuǎn)鐵蛋白受體細(xì)胞表面蛋白受體；分子探針：超順磁性的單晶氧化鐵微粒和轉(zhuǎn)鐵蛋白的復(fù)合物；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白-鐵結(jié)合形成復(fù)合體，將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，而增強(qiáng)MR信號。3.轉(zhuǎn)鐵蛋白受體細(xì)胞表面蛋白受體；71MRI的方法學(xué)評價空間分辨率高（達(dá)到μm）；能同時獲得生理及解剖信息；在觀察基因表達(dá)變化、腫瘤血管生成及細(xì)胞分子水平的功能成像中具有獨(dú)特的作用。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：需要大量的探針；敏感度較低；掃描和后加工時間長；價格昂貴MRI的方法學(xué)評價空間分辨率高（達(dá)到μm）；優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：需72（三）光學(xué)成像分類熒光成像技術(shù)生物發(fā)光成像技術(shù)（三）光學(xué)成像分類熒光成像技術(shù)731.熒光成像技術(shù)報告基因：綠色熒光蛋白（greenfluorescenceprotein,GFP）基因紅色熒光蛋白（RFP）基因近紅外（NIR）熒光素通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。紅光的穿透性在小動物體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性要好得多。近紅外熒光素的波長為650~900nm，其光子穿透組織能力較可見光強(qiáng)；而且在此波長范圍內(nèi)，血紅蛋白、水、脂質(zhì)對光子的吸收率最低，背景噪音的干擾最小。因此近紅外熒光為觀測生理指標(biāo)的最佳選擇。成像原理：1.熒光成像技術(shù)報告基因：綠色熒光蛋白（greenflu742.生物發(fā)光成像技術(shù)通過分子克隆技術(shù)將熒光素酶基因插入靶基因，即可將所需研究的基因或細(xì)胞標(biāo)記上熒光素酶。將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)；觀測前通過腹腔或靜脈注射導(dǎo)入熒光素酶的底物——熒光素，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象?；铙w觀察一般采用Fluc基因，這種酶催化熒光素的氧化發(fā)光反應(yīng)需要ATP和氧氣的存在，因此只在活細(xì)胞內(nèi)才產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，而且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目呈線性關(guān)系。成像原理：2.生物發(fā)光成像技術(shù)通過分子克隆技術(shù)將熒光素酶基因插入靶基753.光學(xué)成像的方法學(xué)評價優(yōu)點(diǎn)：可動態(tài)觀測活體動物細(xì)胞體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病的發(fā)展、基因的表達(dá)等生物學(xué)過程。操作簡單、安全無放射性、所得結(jié)果直觀、靈敏度高，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及醫(yī)藥研究。缺點(diǎn)：穿透力有限，只能用于皮膚淺表成像，因此目前主要用于小動物模型的研究。即使是穿透力最強(qiáng)的NIR熒光成像，其在乳腺中的穿透深度僅為10cm,而在成人腦組織的穿透深度僅4cm,目前難以用于臨床研究。3.光學(xué)成像的方法學(xué)評價優(yōu)點(diǎn)：可動態(tài)觀測活體動物細(xì)胞體內(nèi)腫76不同成像方法的比較成像方法探測光譜空間分辨力檢測深度時間分辨率靈敏度（mol/L）探針濃度PET高能γ射線1~2mmNolimit10s-min10-11~10-12ngSPECT低能γ射線0.5~1mmNolimitmin10-10~10-11ng生物發(fā)光成像可見光3-5mm2-3cmsec-min10-15~10-17g-mg熒光成像可見光或近紅外光2-3mm0-15cmsec-min10-9~10-12g-mgMRI電磁波25~100μmNolimitmin-hrs10-3~10-5g-mg不同成像方法的比較成像探測光譜空間檢測深度時間靈敏度（mol77三、分子影像的應(yīng)用1.在科研方面的應(yīng)用2.臨床應(yīng)用基因治療中靶基因傳送和表達(dá)成像標(biāo)記細(xì)胞、微生物的成像小動物成像研究對腫瘤的臨床檢查（早期診斷、分期、分型）；心血管系統(tǒng)疾病診斷（心肌存活性對于心臟功能判斷、臨床治療方案選擇及心功能預(yù)后分析）神經(jīng)系統(tǒng)疾?。榕R床提供定量的檢測數(shù)據(jù)）三、分子影像的應(yīng)用1.在科研方面的應(yīng)用2.臨床應(yīng)用基因治78課后作業(yè)請比較5種常見基因變異檢測方法？要求：用500字以上的文字或表格闡述5種常見基因變異檢測方法在原理、檢測內(nèi)容、檢測范圍、靈敏度、準(zhǔn)確度等方面的相同及不同點(diǎn)。課后作業(yè)請比較5種常見基因變異檢測方法？79第十二章

其他分子診斷檢測技術(shù)第十二章

其他分子診斷檢測技術(shù)80目錄第一節(jié)基因變異檢測技術(shù)第二節(jié)脈沖電場凝膠電泳第三節(jié)分子影像目錄第一節(jié)基因變異檢測技術(shù)81第一節(jié)基因變異檢測技術(shù)檢測已知的基因突變檢測未知的基因突變分子診斷檢測基因突變的目的：第一節(jié)基因變異檢測技術(shù)檢測已知的基因突變分子診斷檢測基因82幾種常見的基因變異檢測方法PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)溫度梯度凝膠電泳和變性梯度凝膠電泳變性高效液相色譜法錯配接合蛋白質(zhì)截短測試法幾種常見的基因變異檢測方法PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)83一、PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)

(PCRamplificationregractorymytationsystem,PCR-ARMS)以PCR方法為基礎(chǔ)，檢測已知點(diǎn)突變的一種方法。又叫做PCR等位基因特異性擴(kuò)增法（PCRamplificationofspecificalleles,PASA）或等位基因特異性PCR

(alleles-specificPCR,ASPCR)一、PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)

(PCRamplificati84（一）基本原理PCR的引物3’末端的核苷酸與模板之間存在錯配時，PCR擴(kuò)增效果差，或者不能擴(kuò)增。模板3’5’引物5’3’×ATGTTATACAACPCR-ARMS（一）基本原理PCR的引物3’末端的85設(shè)計2對引物，一對引物（P1）與正?；蛲耆ヅ?，一對引物(P2)與突變基因完全匹配。用這兩對引物分別擴(kuò)增模板。如果模板基因?yàn)檎；颍敲碢1擴(kuò)增可以得到大量產(chǎn)物，而P2無產(chǎn)物。如果模板已經(jīng)突變，那么P2擴(kuò)增可以獲得大量產(chǎn)物，而P1無產(chǎn)物。PCR-ARMS基本原理PCR-ARMS設(shè)計2對引物，一對引物（P1）與正常基因完全匹配，一對引物(865’3’3’5’

ATGGTTCCTG

TACCAAGGAC5’3’3’5’ATGGTACCTGTACCATGGAC突變等位基因正常等位基因順利延長不能延長5’3’ATCGTT5’3’ATCGTT×突變基因的引物P2的擴(kuò)增PCR-ARMS5’87（二）應(yīng)用檢測單一點(diǎn)突變基因分型檢測多位點(diǎn)突變PCR-ARMS的應(yīng)用（二）應(yīng)用檢測單一點(diǎn)突變PCR-ARMS的應(yīng)用881.檢測單一點(diǎn)突變設(shè)計一對引物，可以擴(kuò)增突變基因而對正?；虺蕯U(kuò)增阻遏；附加一對引物，可以擴(kuò)增標(biāo)志性基因作為陽性對照；PCR擴(kuò)增完成，進(jìn)行電泳，即可得知點(diǎn)突變是否發(fā)生。MMGNG異常陽性對照突變基因PCR-ARMS的應(yīng)用1.檢測單一點(diǎn)突變設(shè)計一對引物，可以擴(kuò)增突變基因而對正?；?92.基因分型可用于單個突變的基因分型（鑒別雜合子和純合子）或多態(tài)性分析PCR-ARMS的應(yīng)用1:正?；虻囊飻U(kuò)增結(jié)果；2：突變基因的引物擴(kuò)增結(jié)果MWt1Wt2Ht1Ht2Hm1Hm2野生純合子雜合子突變純合子方法一：正常等位基因野生純合子點(diǎn)突變突變雜合子穩(wěn)定遺傳突變純合子2.基因分型可用于單個突變的基因分型（鑒別雜合子和純合子）90方法二：野生純合子雜合子突變純合子MWtHtHm5’3’3’5’496bp371bp野生型基因引物突變型基因引物突變點(diǎn)PCR-ARMS的應(yīng)用方法二：野生突變MWt913.檢測多位點(diǎn)突變突變點(diǎn)1突變點(diǎn)2片段1片段2PCR-ARMS的應(yīng)用PCR-ARMS可同時檢測多個點(diǎn)突變。3.檢測多位點(diǎn)突變突變點(diǎn)1突變點(diǎn)2片段1片段2PCR-A92（三）方法學(xué)評價適用于較少點(diǎn)突變的檢測；具有低-中等批量處理能力；可借助多重PCR檢測多個點(diǎn)突變；無需放射性標(biāo)記；無需昂貴的試劑；無需復(fù)雜的檢測系統(tǒng)PCR-ARMS優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)只能檢測已知的基因突變及多態(tài)性（三）方法學(xué)評價適用于較少點(diǎn)突變的檢測；PCR-ARMS優(yōu)點(diǎn)93二、寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)

(oligonucleotideligationassay,OLA)利用DNA連接酶，將2段寡核苷酸探針順向連接，從而檢測靶基因型的一種方法。該方法因?yàn)榭煽?、精確、重現(xiàn)性好，已成為臨床遺傳病分子診斷的一種基本方法。二、寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)

(oligonucleotideli94（一）基本原理嗜溫性或耐熱的連接酶具有高特異性和高保真性，它能連接與模板序列完全互補(bǔ)的兩段核苷酸片段。OLA的基本原理DNA連接酶5’3’

TACCAAGGACGATTCCTGATC

ATGGTTCCTG

CTAAGGACTAG3’5’5’3’

TACCAAGGACGATTCCTGATC

ATGGTTCCTA

CTAAGGACTAG3’5’×（一）基本原理嗜溫性或耐熱的連接酶具有高特異性和高保真性，它95雙等位基因變異的檢測OLA的基本原理探針15’

等位基因A

3’

TACCAAGGACGATTCCTGATC

ATGGTTCCTG

CTAAGGACTAG3’5’

TACCAAGGAGGATTCCTGATC

ATGGTTCCTC

CTAAGGACTAG3’5’探針25’等位基因a3’通用探針雙等位基因變異的檢測OLA的基本原理探針15’96OLA實(shí)驗(yàn)的操作耐熱連接酶，可使變性和連接連續(xù)進(jìn)行，產(chǎn)物呈線性增長，大大增加了檢測的靈敏度；若PCR擴(kuò)增引物的Tm值大于探針的Tm值，可在同一管內(nèi)先進(jìn)行PCR，再進(jìn)行OLA實(shí)驗(yàn)，大大減少了污染，提高檢測效率。2.條件：1.反應(yīng)體系：3.方法的發(fā)展：2個探針、DNA連接酶、模板探針與靶序列的雜交區(qū)域足夠長（>20bp）溫度：能使探針和靶序列雜交OLA的基本原理OLA實(shí)驗(yàn)的操作耐熱連接酶，可使變性和連接連續(xù)進(jìn)行，產(chǎn)物呈線97（二）臨床應(yīng)用鐮狀細(xì)胞貧血癥的分子診斷、產(chǎn)前檢查多種遺傳病及常見病的檢測(P168)；局部地區(qū)人群的遺傳病分子檢測PCR-OLA的應(yīng)用（二）臨床應(yīng)用鐮狀細(xì)胞貧血癥的分子診斷、產(chǎn)前檢查PCR-OL98（三）方法學(xué)評價能可靠地鑒別基因型及純、雜合子；不容易產(chǎn)生假陰性和假陽性結(jié)果；利用耐熱連接酶循環(huán)進(jìn)行連接，使信號放大，更增強(qiáng)了該法的靈敏度優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：需要多相參與，增加實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜度；需要PCR擴(kuò)增與OLA相結(jié)合，PCR的非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致了該方法的重現(xiàn)性不夠PCR-OLA的方法學(xué)評價（三）方法學(xué)評價能可靠地鑒別基因型及純、雜合子；優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：99三、溫度梯度凝膠電泳和變性梯度凝膠電泳利用不同的分子在不同濃度的變性劑作用下，失活而改變分子構(gòu)象，進(jìn)而進(jìn)行分離的一種電泳技術(shù)。利用不同的分子在不同的溫度下，構(gòu)象改變的不同而進(jìn)行分離的一種電泳技術(shù)。溫度梯度凝膠電泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE）變性梯度凝膠電泳

(denaturing-gradientgelelectrophoresis,DGGE)46℃50℃

54℃

58℃

62℃－＋三、溫度梯度凝膠電泳和變性梯度凝膠電泳100（一）TGGE的基本原理普通的非變性凝膠電泳不能分離具有相似長度的DNA，所以也不能分離發(fā)生了單核苷酸突變的DNA序列。但是在溫度梯度凝膠電泳中，隨著溫度的逐漸升高，DNA分子會呈階梯式逐步發(fā)生解鏈。部分解鏈的雙鏈DNA分子表現(xiàn)出一種復(fù)雜的分枝構(gòu)象，使得其電泳遷移率大大下降。

TGGE（一）TGGE的基本原理普通的非變性凝膠101TGGE的基本原理TGGE5’3’3’5’

ATGGTTCCTG

TACCAAGGAC3’5’

ATGGCTCCTG

TACCGAGGAC5’3’正常等位基因突變等位基因Tm=54℃Tm=58℃46℃50℃

54℃

58℃

62℃－＋

正?；蛲蛔兓騎GGE的基本原理TGGE5’3’ATGGTTCCTG102（二）突變的檢測原理正常等位基因點(diǎn)突變突變雜合子穩(wěn)定遺傳突變純合子PCR擴(kuò)增wt/wtwt/wt,mt/mt,wt/mt,mt/wtmt/mtPCR產(chǎn)物基因型TGGE（二）突變的檢測原理正常等位基因點(diǎn)突變突變雜合子穩(wěn)定遺傳突變103123456

123456a異源b雙鏈帶c同源d雙鏈帶1，5，6為點(diǎn)突變的雜合子；2為突變的純合子；3，4為野生的純合子.TGGE12104（三）變性梯度凝膠電泳（DGGE）實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理與TGGE一致，只不過在DGGE中，變性條件取代了TGGE的溫度。在DGGE試驗(yàn)中，有2個變性條件：熱：一般采用60℃的恒定溫度；變性劑：固定比率的甲酰胺、尿素TGGE/DGGE如果想要獲得很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還有耐于利用相關(guān)軟件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件：電泳時間、凝膠的濃度、變性的梯度等。（三）變性梯度凝膠電泳（DGGE）實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理105（四）臨床應(yīng)用廣泛應(yīng)用于疾病基因的突變檢測，尤其是一個等位基因發(fā)生突變就會引起的疾病檢測；篩選人類基因的多態(tài)性；人類基因的突變檢測，如P53、FBN1等基因；線粒體DNA中的基因突變及多態(tài)性檢測；糞便及腸內(nèi)微生物多態(tài)性的鑒定；病毒基因組的突變鑒定及不同病毒株之間的基因組差異鑒定。TGGE/DGGE（四）臨床應(yīng)用廣泛應(yīng)用于疾病基因的突變檢測，尤其是一個等位基106（五）方法學(xué)評價高分辨率，能100%檢出對單個堿基突變的基因；結(jié)合GC夾、補(bǔ)骨脂素夾或雙邊夾，可提高其靈敏度，獲得更高的檢出率。TGGE/DGGE優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)合成帶GC夾的引物需要特定的儀器，成本較高。（五）方法學(xué)評價高分辨率，能100%檢出對單個堿基突變的基因107色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術(shù)，其原理是利用待分離的各種物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同來進(jìn)行分離的。將它用于分析化學(xué)并配合適當(dāng)?shù)臋z測手段，就成為色譜分析法。高效液相色譜：以液體為流動性，高速、高效率地分離混合物的一種色譜技術(shù)。變性高效液相色譜：改進(jìn)傳統(tǒng)高效液相色譜的分離系統(tǒng)，并運(yùn)用變溫分析方式，高效分離各種生物大分子（包括DNA）的一種方法。四、變性高效液相色譜法

（denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)DHPLC色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術(shù)，其原理是利用108排阻色譜親和色譜排阻色譜親和色譜109（一）DHPLC的基本原理DHPLC的分離系統(tǒng)DHPLC分離DNA的原理DHPLC檢測突變的原理DHPLC（一）DHPLC的基本原理DHPLC的分離系統(tǒng)DHPLC1101.DHPLC的分離系統(tǒng)DHPLC1.色譜柱的填料

特性：電中性，疏水性固定相:C18基質(zhì)：聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB)2.離子對試劑：三乙基銨醋酸鹽（TEAA）

特性：帶正電荷，疏水性3.流動相：乙腈

特性：通過改變濃度，將DNA分子按結(jié)合程度的不同，逐步洗脫下來。1.DHPLC的分離系統(tǒng)DHPLC1.色譜柱的填料固定相111PO3-TEAAC182.DHPLC分離DNA的原理DHPLCPO3-2.DHPLC分離DNA的原理DHPLC112DHPLC3.DHPLC檢測突變的原理變性后，緩慢退火分離手段：非變性分離部分變性分離完全變性分離DHPLC3.DHPLC檢測突變的原理變性后，緩慢退火分離113（二）臨床應(yīng)用乳腺癌相關(guān)基因BRCA1、BRCA2及ATM等疾病相關(guān)基因的分子檢測；短的串聯(lián)重復(fù)序列的基因分型；腫瘤樣本中雜合性缺失的檢測；Y染色體和常染色體DNA序列的篩查酵母、擬南芥、果蠅及小鼠的基因組作圖及基因克隆。DHPLC（二）臨床應(yīng)用乳腺癌相關(guān)基因BRCA1、BRCA2及ATM等114（三）方法學(xué)評價優(yōu)點(diǎn)：具有更高的準(zhǔn)確性和敏感度。DHPLC檢測特性SSCPTGGE/DGGEDHPLCDNA測序檢出范圍<300bp100-500bp150-600bp>0.5%的變異>20%的變異檢出率50%-95%40%-100%100%80%工作度需要特殊的GC夾輔助，增加了工作量快速，2-3min費(fèi)時費(fèi)力（三）方法學(xué)評價優(yōu)點(diǎn)：具有更高的準(zhǔn)確性和敏感度。DHPLC檢115錯配接合蛋白質(zhì)截短測試法（PTT）：又稱為體外蛋白質(zhì)合成檢測技術(shù)(IVPS),只檢測與疾病相關(guān)的突變，即檢測使蛋白不能全長翻譯的突變。五、錯配接合蛋白質(zhì)截短測試法

（proteintruncationtest,PTT)錯配接合蛋白質(zhì)截短測試法（PTT）：又116（一）PTT的原理PTT檢測基因缺失、異常的復(fù)制或剪接檢測翻譯終止突變（一）PTT的原理PTT檢測基因缺失、檢測翻譯終止突變117（二）臨床應(yīng)用最早被用于杜氏肌營養(yǎng)不良的檢測；家族性腺瘤樣息肉?。贿z傳性硬纖維瘤??；共濟(jì)失調(diào)—毛細(xì)血管擴(kuò)張癥；遺傳性乳腺癌；卵巢癌等。PTT（二）臨床應(yīng)用最早被用于杜氏肌營養(yǎng)不良的檢測；PTT118（三）方法學(xué)評價優(yōu)點(diǎn)：PTT不僅可檢測出只與疾病相關(guān)的蛋白截短突變，還能檢測出在RNA形成過程中發(fā)生的突變?？梢灾苯硬捎胢RNA進(jìn)行檢測，減少了操作步驟，加快了分析進(jìn)程；只鑒定引起疾病的截短突變，不會受到基因沉默的影響；截短蛋白質(zhì)分子的長度指明了突變的位置，可以更方便地進(jìn)行DNA測序分析以確定突變。（三）方法學(xué)評價優(yōu)點(diǎn)：PTT不僅可檢測出只與疾病相關(guān)的蛋白截119DHPLC缺點(diǎn)：最佳檢測范圍為<2kb的基因組或1.3-1.6kb的cDNA，因此對于序列較長、包含多個外顯子的疾病基因，需要分幾次進(jìn)行檢測；PTT因?yàn)槟z的分辨率，而檢測不出編碼序列中小的插入或錯義突變；引起RNA產(chǎn)量改變或使mRNA不穩(wěn)定的突變可能被漏檢。DHPLC缺點(diǎn)：最佳檢測范圍為<2kb的基因組或1.3-1.120謝謝！謝謝！121第二節(jié)脈沖電場凝膠電泳交替采用兩個方向的不均勻電場，使DNA分子在連續(xù)間隔交替的電場中，不斷改變方向運(yùn)動，從而將DNA按分子大小分開的電泳技術(shù)。脈沖電場凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)特點(diǎn)：能分離50kb-10Mb的DNA片段。第二節(jié)脈沖電場凝膠電泳交替采用122在PFGE中，電場的方向、脈沖時間和電壓大小可交替改變。在每次電場方向改變時，DNA分子都需要時間來改變其分子構(gòu)型和遷移方向。DNA分子越大，分子構(gòu)型轉(zhuǎn)換所需的時間越長，轉(zhuǎn)變遷移方向的時間也越長。不同大小的DNA分子，因?yàn)槠涓淖冇緞臃较虻臅r間不同，遷移速度也就不同，從而可以在脈沖電場中很好地分開。一、PFGE的原理在PFGE中，電場的方向、脈沖時間和電壓大小可交替改變。一123二、PFGE的一般步驟真核或原核細(xì)胞包埋原位裂解限制性酶切脈沖電泳結(jié)果分析原位裂解獲得完整的染色體DNA與瓊脂糖混合制備包埋塊（含有染色體）限制性酶切后電泳二、PFGE的一般步驟真核或原核細(xì)胞包埋原位裂解獲得完整的染124三、PFGE的種類倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（field-inversiongelelectrophoresis,FIGE）交流電場凝膠電泳（transverse-alternatingfieldgelelectrophoresis,TAFE）鉗位均勻電場凝膠電泳（contour-clampedhomogeneouselectricfields,CHEF）旋轉(zhuǎn)凝膠電泳（rotatinggelelectrophoresis,RGE）三、PFGE的種類倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（field-invers125兩個電場方向?yàn)?80°脈沖間隔時間為：向前﹕向后=3﹕1裝置簡單：電泳槽和脈沖電極控制器分離片段范圍：10kb-800kb特點(diǎn)：1.倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（FIGE）兩個電場方向?yàn)?80°特點(diǎn)：1.倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（FIGE126兩個電場方向?yàn)?15°~165°樣品在凝膠中呈“之”字形泳動分離片段可大至1600kb在病原生物的基因分析中有特殊的用途特點(diǎn)：2.交流電場凝膠電泳（TAFE）兩個電場方向?yàn)?15°~165°特點(diǎn)：2.交流電場凝膠127目前應(yīng)用最廣泛的一類脈沖電泳沒有所謂的“負(fù)極”,兩個主要的電場方向呈120°DNA分子在凝膠中能很好地聚焦分離片段可大至7000kb特點(diǎn)：3.鉗位均勻電場凝膠電泳（CHEF）目前應(yīng)用最廣泛的一類脈沖電泳特點(diǎn)：3.鉗位均勻電場凝膠電泳（128只有一個均一的電場凝膠可以周期性旋轉(zhuǎn)用于不同電場角度時，脈沖時間、電壓等參數(shù)對DNA分離效果的影響分離片段范圍：50kb-6000kb特點(diǎn)：4.旋轉(zhuǎn)凝膠電泳（RGE）只有一個均一的電場特點(diǎn)：4.旋轉(zhuǎn)凝膠電泳（RGE）129（二）PFGE的應(yīng)用菌株的基因分型；制備某個菌株的染色體圖譜；大質(zhì)粒的分離和大小測定。PFGE（二）PFGE的應(yīng)用菌株的基因分型；PFGE130菌株的基因分型；傳統(tǒng)的細(xì)菌分型方法：生物學(xué)分型；血清學(xué)分型；噬菌體分型；細(xì)菌素分型；優(yōu)點(diǎn)：分辨率高；準(zhǔn)確度高；對流行病學(xué)的研究貢獻(xiàn)大PFGE菌株的基因分型；傳統(tǒng)的細(xì)菌分型方法：生物學(xué)分型；優(yōu)點(diǎn)：分辨1312.制備某個菌株的染色體圖譜作用：鑒定基因大?。粯?gòu)建菌株的基因組物理圖譜ABPFGE2.制備某個菌株的染色體圖譜作用：鑒定基因大?。籄1323.大質(zhì)粒的分離和大小測定操作方法：將細(xì)菌包埋在瓊脂糖塊中；裂解細(xì)胞壁；S1核酸酶酶切；PFGE電泳PFGE3.大質(zhì)粒的分離和大小測定操作方法：將細(xì)菌包埋在瓊脂糖塊中133第三節(jié)分子影像

1999年由Weissleder等人提出，也被稱為分子成像或分子顯像，它是指在活體狀態(tài)下從細(xì)胞、基因和分子水平，通過無創(chuàng)傷的影像技術(shù)，對其生物學(xué)行為進(jìn)行定性和定量研究。分子影像(molecularimaging)第三節(jié)分子影像1999年由Weissl134

分子探針是分子影像中的關(guān)鍵組成部分，高特異性的分子探針是進(jìn)行分子影像學(xué)研究的先決條件。一、分子影像探針分子探針示蹤劑:放射性核素、順磁性物質(zhì)或熒光素等能參與體內(nèi)自然的生理生化活動的特殊分子:受體、生物酶及單克隆抗體分子影像探針：一類帶有示蹤劑，能參與體內(nèi)自然的生理生化活動的特殊分子。分子探針是分子影像中的關(guān)鍵組成部分，高特異性的分子探針135分子探針需要具備的特點(diǎn)：相對分子質(zhì)量小、純度高、安全，不影響所研究的疾病過程；具有良好的生物學(xué)功能，能參與人體正常的生理生化活動；能夠克服人體內(nèi)部的“生理屏障”（如腦屏障、血管壁、細(xì)胞膜等），順利到達(dá)靶分子所在的器官，同時不會積聚于其他組織；示蹤劑、分子探針和靶分子應(yīng)該緊密結(jié)合，不能脫落，且有足夠長的半衰期以便于檢測。分子探針需要具備的特點(diǎn)：相對分子質(zhì)量小、純度高、安全，不影136根據(jù)分子探針的不同，分子影像有2種基本的檢測策略：1.直接成像2.間接成像：

采用一個特異性探針(細(xì)胞表面報告分子、細(xì)胞內(nèi)分子或基因表達(dá)產(chǎn)物），它與靶分子作用可直接提供一個與靶分子濃度相關(guān)的信號而成像。一般需要一個報告基因和一個報告探針，它們在特定的靶細(xì)胞中相互作用產(chǎn)生一個代謝物截留于細(xì)胞中發(fā)出信號，通過成像設(shè)備探測到而成像。根據(jù)分子探針的不同，分子影像有2種基本的檢測策略：1.直137二、分子影像學(xué)技術(shù)（一）放射性核素成像（radionuclideimaging）（二）磁共振成像（magneticresonanceimaging,MRI）（三）光學(xué)成像（opticalimaging）二、分子影像學(xué)技術(shù)（一）放射性核素成像（radionucl138正電子發(fā)射計算機(jī)斷層成像技術(shù)（positronemissiontomography,PET）單光子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描技術(shù)（singlephotonemissioncomputedtomography,SPECT）2.常用的放射性核素成像技術(shù)：（一）放射性核素成像1.概念將有明確生物學(xué)效應(yīng)的放射性探針導(dǎo)入人體內(nèi)，使它參與體內(nèi)的生物學(xué)活動，利用相關(guān)成像技術(shù)進(jìn)行探測和顯像，以反映體內(nèi)特定的生物學(xué)活動過程，從而了解體內(nèi)的生理、生化狀態(tài)。正電子發(fā)射計算機(jī)斷層成像技術(shù)（positronemiss139又被稱為生化顯像或功能分子顯像技術(shù)，集中了核物理、放射化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)影像新技術(shù)的優(yōu)勢，從分子水平上觀察細(xì)胞代謝的活動，可提供獨(dú)特的生理性示蹤研究和活體生化顯像。特點(diǎn)：正電子發(fā)射計算機(jī)斷層成像技術(shù)（positronemissiontomography,PET）又被稱為生化顯像或功能分子顯像技術(shù)，集中了核物140檢測策略

將人體代謝所需要的物質(zhì)（如葡萄糖、蛋白質(zhì)等）標(biāo)記上短壽命的放射性核素（如14C、13N）制成探針注入人體內(nèi)。因?yàn)椴∽兘M織和正常組織的代謝狀態(tài)不同，它們富集的示蹤劑的量不同。示蹤劑中的放射性核素的正電子與人體內(nèi)的一個負(fù)電子湮滅能產(chǎn)生兩個互呈180°發(fā)射的γ光子，而被PET設(shè)備捕獲。通過對放射性核素的檢測成像，PET可顯示出示蹤劑的分布情況和聚集的部位、組織或器官以及量的多少，從而對疾病進(jìn)行定位、定量、定性及定期分析。（1）直接成像：檢測策略將人體代謝所需要的物質(zhì)（如葡萄糖、蛋白質(zhì)141

常用的報告基因：單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）等（2）間接成像：原理：胸苷類似物經(jīng)放射性核素標(biāo)記后稱為探針，可以通過主動轉(zhuǎn)運(yùn)自由通過細(xì)胞膜。但該物質(zhì)可被細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出的HSV-TK酶磷酸化，而不能再自由穿過細(xì)胞膜而滯留于細(xì)胞內(nèi)，其放射性的信號指示HSV-TK的存在，證明外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。常用的報告基因：單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）等（142某個特定的器官或組織細(xì)胞表達(dá)HSV-TKHSV-TK與胸苷類似物特異性結(jié)合，并發(fā)生磷酸化成像發(fā)出信號HSV-TK基因攜帶報告基因的細(xì)胞帶標(biāo)記的探針檢測信號間接成像示意圖某個特定的器官或組織細(xì)胞表達(dá)HSV-TKHSV-TK與胸苷類1432.SPECT技術(shù)原理：通過探測和處理體內(nèi)的放射性核素自行發(fā)射的單個的γ光子構(gòu)成斷層圖像，它可以反映器官結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)，