花青素提取方法總結(jié)課件

12/2/20221玉米籽粒花青素提取和分析方法12/2/20222花青素是植物中的主要呈色物質(zhì)，屬于類黃酮化合物自然狀態(tài)下很少以游離態(tài)存在，常與一個或多個多糖通過糖苷鍵形成糖苷已知有20多種花青素，植物中常見的有六種：天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ?、錦葵色素（其最大可見光吸收波長分別為494、506、508、506、508和510nm）12/2/20223花青素的生理功能消除自由基、抗氧化紫玉米花色苷具有很高的抗氧化活性和抗菌活性，甚至高于藍(lán)莓的抗氧化活性?？拐T變、腫瘤、過敏抑制食品誘變劑，對結(jié)腸癌細(xì)胞有抑制作用降血脂12/2/20224花青素的結(jié)構(gòu)特點現(xiàn)已查明,天然花色苷糖苷配基的基本結(jié)構(gòu)為3,5,7-三羥基-2-苯基苯并吡喃,結(jié)構(gòu)式為:12/2/20225花青素的穩(wěn)定性影響因素結(jié)構(gòu)①C3羥基可使分子變得不穩(wěn)定，C5上有羥基或C4發(fā)生取代都可使顏色趨于穩(wěn)定②糖苷的形成也影響花色苷的穩(wěn)定性③花色苷的?；@著增加其在微酸性至中性介質(zhì)中的穩(wěn)定性12/2/20226溫度PH醌型堿黃烊鹽陽離子假堿查爾酮12/2/20227溫度

當(dāng)花色苷溶液加熱時,平衡向著無色的查耳酮(C)的方向進(jìn)行,同時引起有色型化合物(AH++A)的降低。當(dāng)冷卻和酸化時,醌型堿(A)和假堿(B)迅速變成陽離子(AH+)。花色苷在溫度小于60℃的條件下較為穩(wěn)定，當(dāng)溫度大于80℃時，溫度對花色苷有較明顯的降解作用；光對花色苷的穩(wěn)定性影響很大12/2/20228輔色劑的影響花色苷同輔色劑聯(lián)合形成一種垂直層疊的復(fù)合物(Goto等1979),這種層疊過程產(chǎn)生一種疏水力,從而防止親水核的加合作用和失色。12/2/20229提取方法：

一、萃取溶劑法

常用的溶劑主要分為3類:水、親水性有機溶劑和親脂性有機溶劑。為防止花色苷的降解和提高花色苷的溶出率,常在溶劑中加少量的無機酸或有機酸，使提取液的pH控制在3.15以下。12/2/202210這是目前國內(nèi)外廣泛使用的提取方法，多數(shù)選擇甲醇、乙醇、丙酮或它們的混合溶劑對材料中的花青素進(jìn)行溶解過濾，通過酸或堿調(diào)節(jié)溶液酸堿度萃取濾液中的花青素。該方法原理簡單，對設(shè)備要求較低，不足之處是大多數(shù)有機溶劑毒副作用大且產(chǎn)物提取率低。有機溶劑萃取法12/2/202211水溶液提取法該方法一般在常壓或高壓下用熱水浸泡含花青素的原材料，然后用非極性大孔樹脂進(jìn)行吸附；或直接使用脫氧熱水提取，再采用超濾或反滲透經(jīng)濃縮得到粗提物陸國權(quán)等研究表明，提取腳板薯花青素的最佳方法是：以0．5％硫酸溶液作浸提劑，并使其pH44．0，在6O℃下加熱60min。設(shè)備簡單，無污染，產(chǎn)品無毒但純度低。12/2/202212超臨界流體萃取法利用壓力和溫度對超臨界流體溶解能力的影響進(jìn)行提取。最大的優(yōu)點是產(chǎn)品提取率高，可以低溫操作，避免了不飽和脂肪酸的氧化分解，溶劑無殘留，且作為超臨界流體的CO2易得，萃取能耗低。時海香等人研究了超臨界CO2萃取常山胡柚天然色素的工藝，色素提取率可達(dá)96.187%12/2/202213提取方法：

二、破除細(xì)胞壁

發(fā)酵提取法①原理是:通過微生物的作用使紫甘薯中的淀粉轉(zhuǎn)化為乙醇,將乙醇分離后,可得到紫甘薯花色苷,原料的利用率大大提高。②其利用微生物破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,促進(jìn)花色苷的溶出,提高提取率。通過發(fā)酵分解色素液中的糖、有機酸和其他雜質(zhì),大大降低了色素的純化難度。

12/2/202214酶法提取用于花色苷提取的酶主要有纖維素酶和果膠酶,通過酶解使植物細(xì)胞壁軟化、膨脹及崩潰,從而促進(jìn)了花色苷的溶出。王萍等人通過單因素和正交試驗,確定了黑加侖果渣花色苷酶法提取的的最佳工藝，黑加侖花色苷提取率的91.109%,此法可以大大縮短花色苷提取時間,提高得率。12/2/202215輔助方法超聲波輔助提?、僭诔暡晥鲋?振動負(fù)壓區(qū)由于周圍的液體來不及補充,形成無數(shù)的微小真空泡,而當(dāng)正壓來到時,微小氣泡在壓力下突然閉合,液體間猛烈碰撞產(chǎn)生極大的沖擊波,壓力可高達(dá)3000MPa,從而使植物細(xì)胞破裂,利于花色苷的溶出。②此法具有提取時間短,設(shè)備簡單,操作方便等優(yōu)點,并可有效防止熱敏性成分的高溫分解。12/2/202216微波輔助提取當(dāng)微波加熱時,細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì)尤其是水分子吸收微波能,產(chǎn)生大量的熱量使細(xì)胞內(nèi)溫度迅速上升,液態(tài)水汽化產(chǎn)生的巨大壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破,形成微小的孔洞,使胞外溶劑容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),溶解并釋放出胞內(nèi)物質(zhì)。與傳統(tǒng)方法相比,微波法具有提取率高、時間短、能耗小等優(yōu)點,因此微波用于天然素的提取工藝具有廣闊的應(yīng)用前景。12/2/202217其他輔助方法高壓脈沖電場輔助提取高壓脈沖電場輔助提取法是一種新型非熱技術(shù),它具有提取溫度低、速率快、時間短、提取率高、產(chǎn)品品質(zhì)好的特點。液態(tài)靜高壓法輔助提取Corrales等人用液態(tài)靜高壓輔助提取的方法從葡萄皮中提取花色苷,研究所得的最優(yōu)工藝參數(shù)是:100%乙醇,溫度50℃,壓力600MPa。此法與未使用HHP法相比,產(chǎn)率提高23%。HHP具有提取溫度低,時間短,不破壞色素結(jié)構(gòu)等優(yōu)點,但應(yīng)用于花色苷等活性成分提取的報道還不多見。12/2/202218提取條件比較12/2/20221912/2/202220純化經(jīng)過提取的花色苷粗品中往往含有很多有機酸、糖等雜質(zhì),產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差、純度不高。為了提高產(chǎn)品的色價和穩(wěn)定性,需要對提取物進(jìn)一步純化。12/2/202221柱層析法凝膠柱層析

聚酰胺層析硅膠層析離子交換層析12/2/202222大孔樹脂層析大孔樹脂是近代發(fā)展起來的一類有機高聚物吸附劑。分離工藝得到的提取物不吸潮，工藝簡單，成本相對較低，樹脂可反復(fù)使用適合工業(yè)化生產(chǎn)楊迎花等采用大孔樹脂吸附純化葡萄籽原花青素，結(jié)果表明大孔樹脂吸附純化工藝簡單、成本低、產(chǎn)率高、安全適用。12/2/202223膜分離法花色苷提取中常用的膜分離技術(shù)有超濾(UF)、反滲透(RO)、電滲析(ED)等。Patil用酸化的乙醇提取紅蘿卜花色苷,隨后用膜分離的方法有效的脫醇并濃縮了花色苷提取液,使花色苷含量從37216mg/L提高到62518mg/L膜分離純化的花色苷色價和透明度高,穩(wěn)定性好,容易實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn),生產(chǎn)過程勞動強度低,流程簡單,但對設(shè)備要求高,純化成本高,提取效率低。12/2/202224鑒定經(jīng)過加工或儲藏的材料會產(chǎn)生褐色降解物,這些降解物和花色苷具有相同的能量吸收范圍.這類花色苷總量的測定,通常有兩種方法①pH示差法②差減法12/2/202225鑒定方法柱層析薄層層析光譜分析法HPLC、MS、HPLC－MS核磁共振法毛細(xì)管區(qū)帶電泳法12/2/202226紫外－可見光譜法色素的紫外吸收光譜是色素的重要特征。吸收光譜是鑒定和測量混合物中主要色素的最簡單方法。其主要原理是依據(jù)花色苷的不同基團(tuán)的在不同的波長下有不同的吸收峰,進(jìn)而推斷出其結(jié)構(gòu)。①B環(huán)有鄰位羥基的確定。②糖基位置的確定。③?；欠翊嬖诘拇_定。④甲基化與羥基化12/2/202227HPLC高效液相色譜法(HPLC)以經(jīng)典的色譜法為基礎(chǔ),引入了氣相色譜法的理論和實驗方法,流動相改為高壓輸送,采用高效固定相及在線檢測手段發(fā)展而成的一種高效快速分離分析技術(shù)。HPLC可以在30min一個流程內(nèi)分離15種不同的花色苷,其分辨能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過紙層析和薄層層析。但是,由于缺乏花色苷的標(biāo)準(zhǔn)對照品,使得僅靠HPLC方法對花色苷進(jìn)行定性和定量分析還不夠充分。12/2/202228出峰順序9種花色素苷的出峰順序：花翠素3．O一葡萄糖苷、花青素3-0．葡萄糖苷、3’一甲花翠素3．O．葡萄糖苷、甲基花青素3．O．葡萄糖苷、二甲花翠素3．O．葡萄糖苷、甲基花青素3．O一(6一O一乙酰)葡萄糖苷、二甲花翠素3．O．(6．O．乙酰)葡萄糖苷、甲基花青素3．O．(6．o-對香豆酰)葡萄糖苷、二甲花翠素3．O．(6．0．對香豆酰)葡萄糖苷12/2/202229雙標(biāo)樣高效液相色譜法測定紫玉米花青素的含量設(shè)備

Agilent1100高效液相色譜儀和AgilentIonTrap—XCTMS：美國安捷倫公司；WatersXbridgeC18(250mmx4．6mm，5μm)柱：美國Waters公司色譜流動相：A(5％甲酸)，B(甲酸：水：乙腈=5：45：50，體積比)；流速：0.8mUmin;DAD檢測器；柱溫30℃；梯度洗脫。12/2/202230標(biāo)樣C3G和P3G（紫玉米花青素其主要以C3G和P3G及其衍生物為主要組成部分）結(jié)果

C3G的加標(biāo)回收率為93.7%（RSD為0.804%），可以確定以C3G為標(biāo)樣測定樣品C3G含量更加準(zhǔn)確。同理，樣品中P3G及其衍生物以P3G為標(biāo)樣獲得的結(jié)果更可靠。因此，使用雙標(biāo)樣高效液相色譜法獲得的紫玉米花青素含量（93.77mg/g）更加準(zhǔn)確。P3G：芍藥色素-3-葡萄糖C３G：矢車菊色素-3-葡萄糖苷12/2/20223112/2/202232紫玉米花青素種類近年來,采用溫和的提取分離方法和現(xiàn)代分析儀器手段如TLC、HPLC、MS、NMR等,Aoki等研究發(fā)現(xiàn)紫玉米籽粒中含有8種花青苷:矢車菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、兩個矢車菊素-3-丙二酸酰基葡萄糖苷同分異構(gòu)體、天竺葵素-3-丙二酸?；咸烟擒?、芍藥素-3-丙二酸?；咸烟擒铡⑹杠嚲账?3-二丙二酸?；咸烟擒铡hao等對中國紫玉米雜交品種的籽粒進(jìn)行了質(zhì)譜分析,初步發(fā)現(xiàn)9個花青苷單體物質(zhì),包括矢車菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、兩個矢車菊素-3-丙二酸?；咸烟擒胀之悩?gòu)體、天竺葵素-3-丙二酸?；咸烟擒?、兩個芍藥素-3-丙二酸?；咸烟擒胀之悩?gòu)體、天竺葵素-3-二丙二酸?；咸烟擒铡?2/2/202233含量每100g秘魯紫玉米中含色素物質(zhì)為1640mg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鮮藍(lán)莓花青苷的(73~430mg)。籽粒表皮含大部分的花青苷,通常為504~1473mg,而Moreno等

發(fā)現(xiàn),在一些南美紫玉米品種(Arrocillo,Conico,Peruano和Purepecha)的脫胚芽玉米籽粒中,含54~115mg的花青苷。Zhao等發(fā)現(xiàn)中國紫玉米雜交品種的籽粒中,花青苷高達(dá)305mg(以100g干質(zhì)量計,下同)。敬璞等研究發(fā)現(xiàn)秘魯紫玉米芯花青苷含量高達(dá)1333mg12/2/202234初步的提取方案提取(1):①酸醇提取液：體積分?jǐn)?shù)95%乙醇與質(zhì)量濃度0.1mg/LHCl的質(zhì)量比為85∶15。以酸醇為提取液：料液比1∶20，時間60min，提取溫度55℃。提取兩次（玉米葉，提取量27.6mg/g）②標(biāo)樣：矢車菊素-3-葡萄糖苷12/2/202235提?。?）：①選用1%HCl甲醇做浸提劑,在50℃浸提2次，每次1.5h②采用離心法在常溫下6000r/min,離心10min12/2/202236問題玉米中用到的方法提取流程ＵＰＬC:①色譜條件②標(biāo)樣：2個或多個③檢測波長11醉翁亭記

1．反復(fù)朗讀并背誦課文，培養(yǎng)文言語感。

2．結(jié)合注釋疏通文義，了解文本內(nèi)容，掌握文本寫作思路。

3．把握文章的藝術(shù)特色，理解虛詞在文中的作用。

4．體會作者的思想感情，理解作者的政治理想。一、導(dǎo)入新課范仲淹因參與改革被貶，于慶歷六年寫下《岳陽樓記》，寄托自己“先天下之憂而憂，后天下之樂而樂”的政治理想。實際上，這次改革，受到貶謫的除了范仲淹和滕子京之外，還有范仲淹改革的另一位支持者——北宋大文學(xué)家、史學(xué)家歐陽修。他于慶歷五年被貶謫到滁州，也就是今天的安徽省滁州市。也是在此期間，歐陽修在滁州留下了不遜于《岳陽樓記》的千古名篇——《醉翁亭記》。接下來就讓我們一起來學(xué)習(xí)這篇課文吧！【教學(xué)提示】結(jié)合前文教學(xué)，有利于學(xué)生把握本文寫作背景，進(jìn)而加深學(xué)生對作品含義的理解。二、教學(xué)新課目標(biāo)導(dǎo)學(xué)一：認(rèn)識作者，了解作品背景作者簡介：歐陽修(1007—1072)，字永叔，自號醉翁，晚年又號“六一居士”。吉州永豐(今屬江西)人，因吉州原屬廬陵郡，因此他又以“廬陵歐陽修”自居。謚號文忠，世稱歐陽文忠公。北宋政治家、文學(xué)家、史學(xué)家，與韓愈、柳宗元、王安石、蘇洵、蘇軾、蘇轍、曾鞏合稱“唐宋八大家”。后人又將其與韓愈、柳宗元和蘇軾合稱“千古文章四大家”。

關(guān)于“醉翁”與“六一居士”：初謫滁山，自號醉翁。既老而衰且病，將退休于潁水之上，則又更號六一居士?？陀袉栐唬骸傲缓沃^也？”居士曰：“吾家藏書一萬卷，集錄三代以來金石遺文一千卷，有琴一張，有棋一局，而常置酒一壺?！笨驮唬骸笆菫槲逡粻?，奈何？”居士曰：“以吾一翁，老于此五物之間，豈不為六一乎？”寫作背景：宋仁宗慶歷五年(1045年)，參知政事范仲淹等人遭讒離職，歐陽修上書替他們分辯，被貶到滁州做了兩年知州。到任以后，他內(nèi)心抑郁，但還能發(fā)揮“寬簡而不擾”的作風(fēng)，取得了某些政績?！蹲砦掏び洝肪褪窃谶@個時期寫就的。目標(biāo)導(dǎo)學(xué)二：朗讀文章，通文順字1．初讀文章，結(jié)合工具書梳理文章字詞。2．朗讀文章，劃分文章節(jié)奏，標(biāo)出節(jié)奏劃分有疑難的語句。節(jié)奏劃分示例

環(huán)滁/皆山也。其/西南諸峰，林壑/尤美，望之/蔚然而深秀者，瑯琊也。山行/六七里，漸聞/水聲潺潺，而瀉出于/兩峰之間者，釀泉也。峰回/路轉(zhuǎn)，有亭/翼然臨于泉上者，醉翁亭也。作亭者/誰？山之僧/曰/智仙也。名之者/誰？太守/自謂也。太守與客來飲/于此，飲少/輒醉，而/年又最高，故/自號曰/醉翁也。醉翁之意/不在酒，在乎/山水之間也。山水之樂，得之心/而寓之酒也。節(jié)奏劃分思考“山行/六七里”為什么不能劃分為“山/行六七里”？

明確：“山行”意指“沿著山路走”，“山行”是個狀中短語，不能將其割裂?！巴?蔚然而深秀者”為什么不能劃分為“望之蔚然/而深秀者”？明確：“蔚然而深秀”是兩個并列的詞，不宜割裂，“望之”是總起詞語，故應(yīng)從其后斷句?！窘虒W(xué)提示】引導(dǎo)學(xué)生在反復(fù)朗讀的過程中劃分朗讀節(jié)奏，在劃分節(jié)奏的過程中感知文意。對于部分結(jié)構(gòu)復(fù)雜的句子，教師可做適當(dāng)?shù)闹v解引導(dǎo)。目標(biāo)導(dǎo)學(xué)三：結(jié)合注釋，翻譯訓(xùn)練1．學(xué)生結(jié)合課下注釋和工具書自行疏通文義，并畫出不解之處?！窘虒W(xué)提示】節(jié)奏劃分與明確文意相輔相成，若能以節(jié)奏劃分引導(dǎo)學(xué)生明確文意最好；若學(xué)生理解有限，亦可在解讀文意后把握節(jié)奏劃分。2．以四人小組為單位，組內(nèi)互助解疑，并嘗試用“直譯”與“意譯”兩種方法譯讀文章。3．教師選擇疑難句或值得翻譯的句子，請學(xué)生用兩種翻譯方法進(jìn)行翻譯。翻譯示例：若夫日出而林霏開，云歸而巖穴暝，晦明變化者，山間之朝暮也。野芳發(fā)而幽香，佳木秀而繁陰，風(fēng)霜高潔，水落而石出者，山間之四時也。直譯法：那太陽一出來，樹林里的霧氣散開，云霧聚攏，山谷就顯得昏暗了，朝則自暗而明，暮則自明而暗，或暗或明，變化不一，這是山間早晚的景色。野花開放，有一股清幽的香味，好的樹木枝葉繁茂，形成濃郁的綠蔭。天高氣爽，霜色潔白，泉水淺了，石底露出水面，這是山中四季的景色。意譯法：太陽升起，山林里霧氣開始消散，煙云聚攏，山谷又開始顯得昏暗，清晨自暗而明，薄暮又自明而暗，如此暗明變化的，就是山中的朝暮。春天野花綻開并散發(fā)出陣陣幽香，夏日佳樹繁茂并形成一片濃蔭，秋天風(fēng)高氣爽，霜色潔白，冬日水枯而石底上露，如此，就是山中的四季?！窘虒W(xué)提示】翻譯有直譯與意譯兩種方式，直譯鍛煉學(xué)生用語的準(zhǔn)確性，但可能會降低譯文的美感；意譯可加強譯文的美感，培養(yǎng)學(xué)生的翻譯興趣，但可能會降低譯文的準(zhǔn)確性。因此，需兩種翻譯方式都做必要引導(dǎo)。全文直譯內(nèi)容見《我的積累本》。目標(biāo)導(dǎo)學(xué)四：解讀文段，把握文本內(nèi)容1．賞析第一段，說說本文是如何引出“醉翁亭”的位置的，作者在此運用了怎樣的藝術(shù)手法。

明確：首先以“環(huán)滁皆山也”五字領(lǐng)起，將滁州的地理環(huán)境一筆勾出，點出醉翁亭坐落在群山之中，并縱觀滁州全貌，鳥瞰群山環(huán)抱之景。接著作者將“鏡頭”全景移向局部，先寫“西南諸峰，林壑尤美”，醉翁亭坐落在有最美的林壑的西南諸峰之中，視野集中到最佳處。再寫瑯琊山“蔚然而深秀”，點山“秀”，照應(yīng)上文的“美”。又寫釀泉，其名字透出了泉與酒的關(guān)系，好泉釀好酒，好酒叫人醉?！白砦掏ぁ钡拿直惆抵型赋?，然后引出“醉翁亭”來。作者利用空間變幻的手法，移步換景，由遠(yuǎn)及近，為我們描繪了一幅幅山水特寫。2．第二段主要寫了什么？它和第一段有什么聯(lián)系？明確：第二段利用時間推移，抓住朝暮及四季特點，描繪了對比鮮明的晦明變化圖及四季風(fēng)光圖，寫出了其中的“樂亦無窮”。第二段是第一段“山水之樂”的具體化。3．第三段同樣是寫“樂”，但卻是寫的游人之樂，作者是如何寫游人之樂的？明確：“滁人游”，前呼后應(yīng)，扶老攜幼，自由自在，熱鬧非凡；“太守宴”，溪深魚肥，泉香酒洌，美味佳肴，應(yīng)有盡有；“眾賓歡”，投壺下棋，觥籌交錯，說說笑笑，無拘無束。如此勾畫了游人之樂。4．作者為什么要在第三段寫游人之樂？明確：寫滁人之游，描繪出一幅太平祥和的百姓游樂圖。游樂場景映在太守的眼里，便多了一層政治清明的意味。太守在游人之樂中酒酣而醉，此醉是為山水之樂而醉，更是為能與百姓同樂而醉。體現(xiàn)太守與百姓關(guān)系融洽，“政通人和”才能有這樣的樂。5．第四段主要寫了什么？明確：寫宴會散、眾人歸的情景。目標(biāo)導(dǎo)學(xué)五：深入解讀，把握作者思想感情思考探究：作者以一個“樂”字貫穿全篇，卻有兩個句子別出深意，不單單是在寫樂，而是另有所指，表達(dá)出另外一種情緒，請你找出這兩個句子，說說這種情緒是什么。明確：醉翁之意不在酒，在乎山水之間也。醉能同其樂，醒能述以文者，太守也。這種情緒是作者遭貶謫后的抑郁，作者并未在文中袒露胸懷，只含蓄地說：“醉能同其樂，醒能述以文者，太守也?！贝司渑c醉翁亭的名稱、“醉翁之意不在酒，在乎山水之間也”前后呼應(yīng)，并與“滁人游”“太守宴”“眾賓歡”“太守醉”連成一條抒情的線索，曲折地表達(dá)了作者內(nèi)心復(fù)雜的思想感情。目標(biāo)導(dǎo)學(xué)六：賞析文本，感受文本藝術(shù)特色1．在把握作者復(fù)雜感情的基礎(chǔ)上朗讀文本。2．反復(fù)朗讀，請同學(xué)說說本文讀來有哪些特點，為什么會有這些特點。(1)句法上大量運用駢偶句，并夾有散句，既整齊又富有變化