實(shí)驗(yàn)RNA提取方法及原理(“樣品”文檔)共28張

實(shí)驗(yàn)一、RNA提取方法及原理一、研討背景二、方法及原理一、研討背景1.RNA研討的重要性DNA，RNA和蛋白質(zhì)是三種重要的生物大分子，是生命景象的分子根底。DNA的遺傳信息決議生命的主要性狀，而mRNA在信息傳送中起很重要的作用。其它兩大類RNA，rRNA和tRNA，同樣在蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揚(yáng)不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳送到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質(zhì)的過程中舉足輕重。2RNA分布不同豐度組織稱號(hào)樣品量總RNA含量高豐度肝臟1mg2-4μg脾臟1mg心臟1mg中豐度大腦1mg0.05-2μg胚胎1mg腎臟1mg肺1mg低豐度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高豐度成纖細(xì)胞1050.5-1μg人白細(xì)胞105中豐度酵母1050.5-1.5μg擬南芥葉片1mg0.2-0.5μg低豐度煙草葉片1mg0.05-0.1μg玉米葉片1mg二、方法及原理1、RNA的提取流程

〔1〕樣本前處置〔2〕細(xì)胞裂解〔3〕RNA的純化及獲得RNA提取流程－－樣品前處置留意點(diǎn)選擇新穎血液，不得超越4小時(shí)選擇新穎的幼嫩組織選擇處于生長(zhǎng)旺盛的時(shí)期搜集細(xì)胞選擇新穎組織，生長(zhǎng)旺盛的組織可將新穎血液先進(jìn)展紅細(xì)胞裂解，得到的白細(xì)胞然后參與一定量的TRNzol，-70℃保管較長(zhǎng)時(shí)間去掉培育基，參與一定量TRNzol-70℃保管較長(zhǎng)時(shí)間引薦運(yùn)用專門的RNA樣品儲(chǔ)存液進(jìn)展儲(chǔ)存液氮或參與RNase抑制劑中保管，防止反復(fù)凍融RNA提取流程－－樣品前處置中如何保管樣本值得留意的是，許多實(shí)驗(yàn)室配制EDTA后常運(yùn)用很長(zhǎng)時(shí)間甚至數(shù)年，這種長(zhǎng)期運(yùn)用的EDTA溶液常有微生物存在，反而會(huì)呵斥RNA酶的污染。測(cè)定OD260及OD280數(shù)值時(shí)，要使OD260讀數(shù)在0.RNA提取流程－－樣品前處置中如何保管樣本細(xì)胞破碎→勻漿等體積90％苯酚水溶液振蕩→RNA、Pro分開→RNA、多糖〔水層〕；因此mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳送到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質(zhì)的過程中舉足輕重。晾干，參與適量的H2O溶解〔100ul〕〔65℃促溶10-15min〕?！?〕RNA的純化及獲得選擇新穎組織，生長(zhǎng)旺盛的組織測(cè)定OD260及OD280數(shù)值時(shí)，要使OD260讀數(shù)在0.乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中參與異丙醇能沉淀出蛋白。4排除DNA分子的污染4℃離心，13000g×10min，棄上清。長(zhǎng)期保管：保管RNA最為穩(wěn)定的方法是經(jīng)乙醇沉淀后，直接保管于一80℃(在純化RNA的清洗步驟中，離心后不要棄上清，將RNA保管于乙酸銨／乙醇溶液中)。〔2〕細(xì)胞裂解不要吸入中間層及有機(jī)相，參與氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。1mmol／LEDTA)中，保管于一20℃。RNA提取流程－－細(xì)胞裂解，以釋放RNA異硫氰酸胍/酚－TRNzol總RNA提取試劑獨(dú)特配方--RNAplant植物RNA提取試劑胍鹽/β-巰基乙醇—RNAprep系列RNA提取試劑盒樣品與裂解液充分接觸前防止融化，研磨器具必需預(yù)冷，碾磨過程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。確保洗滌時(shí)要徹底懸浮RNA，并且徹底去掉75%乙醇。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式復(fù)原。先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；測(cè)OD時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)運(yùn)用10mMTris，pH7.RNA提取流程－－細(xì)胞裂解，以釋放RNAOD260/OD280比值偏低處理方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。4排除DNA分子的污染1mmol／LEDTA)中，保管于一20℃。2排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染TRIzol法提取流程引薦運(yùn)用專門的RNA樣品RNA提取流程－－RNA的純化及獲得RNA純化要求1純化后不應(yīng)存在對(duì)酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)有抑制造用物質(zhì)2排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染3蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子等的污染降低到最低程度4排除DNA分子的污染2.RNA提取的本卷須知杜絕外源酶的污染a.嚴(yán)厲戴好口罩，手套。b.實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，Tip頭，移液器桿，電泳槽，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要徹底處置。c.實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必需確保RNase-Free。阻止內(nèi)源酶的活性a.選擇適宜的勻漿方法。b.選擇適宜的裂解液。c.控制好樣品的起始量。明確本人的抽提目的a.任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時(shí)，抽提勝利率急劇下降。b.RNA抽提勝利的獨(dú)一經(jīng)濟(jì)的規(guī)范是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一次勝利，而不是得率。

Rnase污染的10大來源1：手指頭2：槍頭3：水/緩沖液4：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面5：內(nèi)源Rnase6：RNA樣品7：質(zhì)粒抽提8：RNA保管9：陽離子(Ca,Mg)10：后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的酶復(fù)習(xí)核酸的提取方法RNA的提取苯酚水溶液提取細(xì)胞破碎→勻漿等體積90％苯酚水溶液振蕩→RNA、Pro分開→RNA、多糖〔水層〕；DNA、Pro〔苯酚層〕冷酚法、熱酚法，留意苯酚除雜復(fù)習(xí)核酸的提取方法DNA提取濃鹽法：1mol/L氯化鈉溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一同振蕩除去蛋白質(zhì)或：先用稀鹽除去RNA－Pro，再用濃鹽提取也可用苯酚法，苯酚層得到DNA、Pro復(fù)習(xí)核酸的提取方法核酸的沉淀DNA的等電點(diǎn)4-4.5，RNA的等電點(diǎn)2-2.5.搜集上面的的水樣層后，RNA可以經(jīng)過異丙醇沉淀。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式復(fù)原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中參與異丙醇能沉淀出蛋白。Trizol

試劑提RNA的原理Trizol

試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑。Trizol中含苯酚和異硫氰酸胍，可維護(hù)RNA免受RNase的污染。Trizol試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能堅(jiān)持RNA的完好性，裂解細(xì)胞并釋放出RNA,酸性條件使RNA與DNA分別,參與氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。搜集上面的的水樣層后，RNA可以經(jīng)過異丙醇沉淀來復(fù)原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式復(fù)原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中參與異丙醇能沉淀出蛋白。TRIzol法提取流程1.樣品處置：

組織：取100mg組織〔新穎或-70℃及液氮中保管的組織均可〕置勻漿器中，參與1mlTrizol充分勻漿，勻漿液轉(zhuǎn)1.5ml離心管中,室溫靜置５min。2.參與0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。3.4℃離心，13000g×15min，取上清。4.參與與上清1:1的異丙醇(約0.5ml)，將管中液體悄然混勻，室溫靜置20min(-20℃，時(shí)間長(zhǎng)效果更好)。取200-300ul從5步往下做。TRIzol法提取流程5.4℃離心，13000g×10min，棄上清。6.參與1ml75%乙醇，洗滌沉淀,將沉淀打碎。4℃，13000g×5min，棄上清。7.100%乙醇,悄然洗滌沉淀.(不用將沉淀打碎)8.晾干，參與適量的H2O溶解〔100ul〕〔65℃促溶10-15min〕。9.定量。細(xì)胞基因組DNA水相有機(jī)相RNA氯仿純化pH5.7離心參與裂解液(TRNzol-A+)實(shí)驗(yàn)流程圖細(xì)胞選擇貼壁細(xì)胞懸浮細(xì)胞RNA提取常見問題RNA的降解OD260/OD280比值偏低電泳帶型異常下游實(shí)驗(yàn)效果不佳RNA降解新穎細(xì)胞或組織：裂解液的質(zhì)量外源RNase的污染裂解液的用量缺乏組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟，胸腺等)，很難防止RNA的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)運(yùn)用更多裂解液。RNA降解冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立刻置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃冰箱保管。樣品要相對(duì)小一點(diǎn)；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前防止融化，研磨器具必需預(yù)冷，碾磨過程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。OD260/OD280比值偏低蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機(jī)相，參與氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底處理方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚殘留：不要吸入中間層及有機(jī)相，參與氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。處理方法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260/OD280比值偏低抽提試劑殘留：確保洗滌時(shí)要徹底懸浮RNA，并且徹底去掉75%乙醇。處理方法:再沉淀一次后，溶解。設(shè)備限制：測(cè)定OD260及OD280數(shù)值時(shí)，要使OD260讀數(shù)在0.10-0.50之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測(cè)OD時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)運(yùn)用10mMTris，pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。電泳帶型異常非變性電泳：上樣量超越3ug，電壓超越6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均能夠?qū)е?8S和18S條帶分不開。變性電泳條帶變淡：EB與單鏈的結(jié)合才干要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；甲醛的質(zhì)量不高。下游實(shí)驗(yàn)效果不佳RNA降解抽提試劑的殘留75%乙醇洗滌樣品中雜質(zhì)的殘留多糖等雜質(zhì)，再次沉淀DNA污染運(yùn)用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNARNA的保管短期保管：可將RNA溶解于TE緩沖液(10mmol／LTris，1mmol／LEDTA)或無：RNA酶水(0.1mmol／LEDTA)中，保管于一20℃。在保管RNA樣品時(shí)，通常運(yùn)用EDTA來螯合RNA酶以防止其降解RNA。值得留意的是，許多實(shí)驗(yàn)室配制EDTA后常運(yùn)用很長(zhǎng)時(shí)間甚至數(shù)年，這種長(zhǎng)期運(yùn)用的EDTA溶液常有微生物存在，反而會(huì)呵斥RNA酶的污染。中長(zhǎng)期保