體外核酸診斷試劑盒引物探針研發(fā)的基本流程

體外核酸診斷試劑盒引物探針研發(fā)的基本流程體外核酸診斷試劑盒研發(fā)引物和探針的設計檢測病原體流行病學調查病原體代表株系的全基因組序列比較檢測靶序列的確定基于靶序列設計引物和探針引物探針整體評分靶序列數(shù)據(jù)庫內(nèi)特異性驗證（NCBI&clustal）PrimerPremier5評分（發(fā)夾，二聚體）Oligo6評價(基因組錯配，二聚體驗證)靶序列空間結構預測（DNAfold）引物探針是否合格引物探針是否特異PickPrimer評價種間交叉反應評價種內(nèi)保守性評價引物探針序列的確定檢測范圍的確定第1頁，共24頁。在我國內(nèi)地主要流行A、B、C、D4種HBV基因型,所占比例分別為1.2%、39.3%、50.2%、8.1%,并且各地區(qū)流行的基因型也存在較大差異,北方地區(qū)以C型為主,約占81.6%;南方地區(qū)則以B型為主,C型也占相當比例（馮琴,楊桂英,朱善軍等.乙型肝炎病毒基因分型的研究進展[J].醫(yī)學檢驗與臨床,2011,22(2):77,56.HBV流行病學調查：確定需要檢測的分型以及靶序列地區(qū)分型特點分子生物學特征GenesS,C,andP,regionX,theprecoreregion,andthepre-S2/pre-Slregionswererankedinorderofincreasingvariability.（LauderIJ,LinHJ,LauJY,etal.ThevariabilityofthehepatitisBvirusgenome:statisticalanalysisandbiologicalimplications[J].Molecularbiologyandevolution,1993,10(2):457-470..臨床病理學B基因型的治療反應、耐藥發(fā)生率均優(yōu)于C型,HBVYMDD突變株(YIDD/YVDD)多發(fā)生于基因型C和D（謝南,朱小誠.90例HBV基因型與拉米夫定療效的研究[J].實用臨床醫(yī)學,2003,4(4):5-8.）第2頁，共24頁。地區(qū)分型特點文獻資料的檢索第3頁，共24頁。第4頁，共24頁。分子生物學特征文獻資料的檢索第5頁，共24頁。第6頁，共24頁。臨床病理學文獻檢索第7頁，共24頁。病原體代表株系的全基因組序列比較第8頁，共24頁。第9頁，共24頁。第10頁，共24頁。第11頁，共24頁。HBV（A,B,C,D）分型代表株系的全基因組序列比較FPR第12頁，共24頁。PrimerPremier5評分（發(fā)夾，二聚體）Oligo6評價上游引物vs下游引物探針VS下游引物第13頁，共24頁。HBV基因組錯配評價第14頁，共24頁?？臻g結構DNAfoldingform|http://=mfold/dna-folding-form第15頁，共24頁。第16頁，共24頁。HBV引物在種內(nèi)中間（針對中國地區(qū)以及其他地區(qū)ABCD代表分型）特異性評價

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第17頁，共24頁。第18頁，共24頁。NCBIPickprimer程序對引物2在種內(nèi)交叉反應評價第19頁，共24頁?！?.HepatitisBvirus第20頁，共24頁。NCBIPickprimer程序對引物以及探針在種間特異性的評價第21頁，共24頁。HBV-E,F,G,H基因組檢測特異性評價

FPR第22頁，共24頁。引物整體評價優(yōu)點：1序列上特異較高

2探針引物總體評分較高

3在自身基因組中不存在錯配，在臨床類似病原體中不存在顯著的交叉反應缺點：1探針自身二聚體較嚴重

2對于C型耐藥突變株，重組型HBV樣本的檢測能力差

3不具有檢測HBVABCD外基因型（F,G,H）的潛力

4PCR產(chǎn)物長度可能不適合（86bp）第23頁，共24頁。內(nèi)容梗概體外核酸診斷試劑盒引物探針研發(fā)的基本流程。PrimerPremier5評分（發(fā)夾，二聚體）。南方地區(qū)則以B型為主,C型也占相當比例（馮琴,楊桂英,朱善軍等.乙型肝炎病毒基因分型的研究進展[J].醫(yī)學檢驗與臨床,2011,22(2):77,56.。HBV（A,B,C,D）分型代表株系的全基因組序列比較。DNAfoldingform|。http://=mfold/dna-folding-form。HBV引物在種內(nèi)中間（針對中國地區(qū)以及其他地區(qū)ABCD代表分型）特異性評價。NCBIPickprimer程序對引物2在種內(nèi)交叉反應評價。HepatitisBvirus。NCBIPickprimer程