環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理課件

PrincipleofLoop-mediatedisothermalamplification煙雨莫問(wèn)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理1ppt課件PrincipleofLoop-mediatediso主要內(nèi)容等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)簡(jiǎn)介等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用前景幾種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)比較環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增演示環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)2ppt課件主要內(nèi)容等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)簡(jiǎn)介2ppt課件等溫?cái)U(kuò)增的概念等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(IsothermalAmplificationTechnology)是核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)過(guò)程始終維持在恒定的溫度下，通過(guò)添加不同活性的酶和各自特異性引物（或不加）來(lái)達(dá)到快速核酸擴(kuò)增的目的。與PCR技術(shù)相比核酸等溫?cái)U(kuò)增對(duì)儀器的要求大大簡(jiǎn)化，反應(yīng)時(shí)間大大縮短，更能滿足快速簡(jiǎn)便的需求。3ppt課件等溫?cái)U(kuò)增的概念等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(IsothermalAmpli等溫?cái)U(kuò)增的優(yōu)勢(shì)應(yīng)用特異性高分析速度快成本低突變率低不需要升溫降溫過(guò)程，一臺(tái)的加熱器即可操作檢測(cè)核酸成分比檢測(cè)微生物本身危險(xiǎn)性小方便診斷4ppt課件等溫?cái)U(kuò)增的優(yōu)勢(shì)應(yīng)用特異性高4ppt課件等溫?cái)U(kuò)增的種類環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)RCA單引物等溫?cái)U(kuò)增SPIA依賴解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)HAD鏈替代擴(kuò)增SDA交叉引物擴(kuò)增技術(shù)CPA核酸依賴性擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)NASBAQβ復(fù)制酶反應(yīng)5ppt課件等溫?cái)U(kuò)增的種類環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）5ppt課件各類等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的比較6ppt課件各類等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的比較6ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸技術(shù)優(yōu)勢(shì)LAMP克服了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)需要通過(guò)反復(fù)熱變性獲得單鏈模板的缺點(diǎn)，避免了反復(fù)升降溫的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了恒溫條件下的連續(xù)快速擴(kuò)增，具有更高的靈敏度和擴(kuò)增效率。操作簡(jiǎn)單：只需一個(gè)水浴鍋快速高效：不需要預(yù)先的雙鏈DNA熱變性．避免了溫度循環(huán)而造成

的時(shí)間損失特異性強(qiáng)：針對(duì)靶序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的4種特異性引物。6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增。故其特異性極高。

高靈敏度，對(duì)于病毒擴(kuò)增模板可達(dá)幾個(gè)拷貝，比PCR高出數(shù)量級(jí)的差異。缺點(diǎn)：由于LAMP擴(kuò)增是鏈置換合成，靶序列長(zhǎng)度最好在300

bp以內(nèi)。>500

bp則較難擴(kuò)增。故不能進(jìn)行長(zhǎng)鏈DNA的擴(kuò)增。靈敏度高易造成假陽(yáng)性結(jié)果。7ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸技術(shù)優(yōu)勢(shì)LAMP克服了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)需要通環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermalamplification,簡(jiǎn)稱LAMP)是利用4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶,在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增DNA的新技術(shù)。LAMP技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)在核酸的科學(xué)研究、疾病的診斷和轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。8ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediat環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增原理60—65℃是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度，DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。利用引物合成的DNA鏈取代模板互補(bǔ)鏈。①擴(kuò)增目的片段時(shí)依賴的是一種具有鏈置換特性的BstDNA聚合酶②需四條能夠識(shí)別靶序列六個(gè)特異區(qū)域的引物③LAMP法并不需要對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行預(yù)變性及進(jìn)行溫度循環(huán)。

9ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增原理60—65℃是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫針對(duì)靶基因的六個(gè)不同的區(qū)域，基于靶基因3’端的F3c、F2c和Flc區(qū)以及5’端的Bl、B2和B3區(qū)等6個(gè)不同的位點(diǎn)設(shè)計(jì)4種引物。LAMP反應(yīng)的開(kāi)始階段四條引物都被使用，但在循環(huán)階段則只有內(nèi)引物被使用。FIP(ForwardInnerPrimer)：上游內(nèi)部引物，由F2區(qū)和F1C區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補(bǔ)，F(xiàn)1C區(qū)與靶基因5’端的Flc區(qū)域序列相同。F3引物：上游外部引物(ForwardOuterPrimer)，由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補(bǔ)。BIP引物：下游內(nèi)部引物(BackwardInnerPrimer)，由B1C和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3’端的B2c區(qū)域互補(bǔ)，B1C域與靶基因5’端的Blc區(qū)域序列相同。B3引物：下游外部引物(BackwardOuterPrimer)，由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補(bǔ)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)10ppt課件針對(duì)靶基因的六個(gè)不同的區(qū)域，基于靶基因3’端的F3c、F2環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)引物與對(duì)應(yīng)模板區(qū)域11ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)引物與對(duì)應(yīng)模板區(qū)域11pp環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理內(nèi)引物FIP的F2與其模板的互補(bǔ)序列F2c結(jié)合，在BstDNA聚合酶作用下，從F2的3’末端開(kāi)始啟動(dòng)DNA合成，合成一條以FIP為新的DNA單鏈并與模板鏈結(jié)合形成新的雙鏈DNA。12ppt課件環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理內(nèi)引物FIP的F2與其模板的互補(bǔ)序列

環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理以F3為起始合成的新鏈與模板鏈形成雙鏈。而原合成的以FIP為起始的DNA單鏈被置換而脫離產(chǎn)生一單鏈DNA，其在5’末端F1c和F1區(qū)發(fā)生自我堿基配對(duì)，形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

13ppt課件

環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理以F3為起始合成的新鏈與模板鏈形成環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理引物BIP的B2與模板鏈B2c區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，合成以BIP為起始的新鏈，并與模板鏈互補(bǔ)形成DNA雙鏈。同時(shí)，F(xiàn)端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)將被打開(kāi)，外引物B3與模板上B3c雜交后，以其3’末端為起點(diǎn)也開(kāi)始合成新鏈，并使以BIP為起始的DNA單鏈從模板鏈上脫離下來(lái)，形成以FIP和BIP為兩端的單鏈。因?yàn)锽1C與B1互補(bǔ)，F(xiàn)1C與F1互補(bǔ)，兩端自然發(fā)生堿基配對(duì)，這條游離于液體中的DNA單鏈分別在F和B末端形成兩個(gè)莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，于是整條鏈呈現(xiàn)啞鈴狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)即為L(zhǎng)AMP的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。形成LAMP基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)14ppt課件環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理引物BIP的B2與模板鏈B2c區(qū)互補(bǔ)環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理15ppt課件環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理15ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程演示16ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程演示16ppt課件反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP的影響喬巖梅.

炭疽芽孢桿菌特征基因恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的研究[D].

中國(guó)科學(xué)院研究生院（武漢病毒研究所）

2007EffectofreactiontimeontheLAMPreaetion.Lanes1,DNAmarker(DL2000)with2000,1000,750,500,250and100bP:lanes2一5,LAMPamPlificationProduetsfor15min,30min,45min,60min,respectively:lane6,withoutDNAtemplateinthereaction.17ppt課件反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP的影響喬巖梅.

炭疽芽孢桿菌特征基因恒溫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)常使用焦磷酸酶沉淀檢測(cè)（濁度檢測(cè)）、熒光檢測(cè)、凝膠電泳檢測(cè)等。

焦磷酸酶沉淀的檢測(cè)（濁度檢測(cè)）：在LAMP反應(yīng)過(guò)程中，dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸酶白色沉淀，研究者發(fā)現(xiàn)LAMP反應(yīng)中焦磷酸鎂沉淀的形成與所產(chǎn)生的DNA量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者生成量之間呈線性關(guān)系，并且焦磷酸鎂沉淀在400nm處有吸收峰，從而進(jìn)行LAMP的定量檢測(cè)。

熒光檢測(cè)：LAMP有極高的擴(kuò)增效率，可在一小時(shí)內(nèi)將靶序列擴(kuò)增至109～l010倍，所以當(dāng)反應(yīng)液中加入核酸染料SYBRGreenI后，在紫外燈或日光下通過(guò)肉眼即可進(jìn)行判定，如果含有擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)混合物變綠；反之，則保持SYBRGreenI的橙色不變。18ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)常使用焦磷酸酶沉檢測(cè)流程圖19ppt課件檢測(cè)流程圖19ppt課件20ppt課件20ppt課件PrincipleofLoop-mediatedisothermalamplification煙雨莫問(wèn)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理21ppt課件PrincipleofLoop-mediatediso主要內(nèi)容等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)簡(jiǎn)介等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用前景幾種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)比較環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增演示環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)22ppt課件主要內(nèi)容等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)簡(jiǎn)介2ppt課件等溫?cái)U(kuò)增的概念等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(IsothermalAmplificationTechnology)是核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)過(guò)程始終維持在恒定的溫度下，通過(guò)添加不同活性的酶和各自特異性引物（或不加）來(lái)達(dá)到快速核酸擴(kuò)增的目的。與PCR技術(shù)相比核酸等溫?cái)U(kuò)增對(duì)儀器的要求大大簡(jiǎn)化，反應(yīng)時(shí)間大大縮短，更能滿足快速簡(jiǎn)便的需求。23ppt課件等溫?cái)U(kuò)增的概念等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(IsothermalAmpli等溫?cái)U(kuò)增的優(yōu)勢(shì)應(yīng)用特異性高分析速度快成本低突變率低不需要升溫降溫過(guò)程，一臺(tái)的加熱器即可操作檢測(cè)核酸成分比檢測(cè)微生物本身危險(xiǎn)性小方便診斷24ppt課件等溫?cái)U(kuò)增的優(yōu)勢(shì)應(yīng)用特異性高4ppt課件等溫?cái)U(kuò)增的種類環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)RCA單引物等溫?cái)U(kuò)增SPIA依賴解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)HAD鏈替代擴(kuò)增SDA交叉引物擴(kuò)增技術(shù)CPA核酸依賴性擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)NASBAQβ復(fù)制酶反應(yīng)25ppt課件等溫?cái)U(kuò)增的種類環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）5ppt課件各類等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的比較26ppt課件各類等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的比較6ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸技術(shù)優(yōu)勢(shì)LAMP克服了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)需要通過(guò)反復(fù)熱變性獲得單鏈模板的缺點(diǎn)，避免了反復(fù)升降溫的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了恒溫條件下的連續(xù)快速擴(kuò)增，具有更高的靈敏度和擴(kuò)增效率。操作簡(jiǎn)單：只需一個(gè)水浴鍋快速高效：不需要預(yù)先的雙鏈DNA熱變性．避免了溫度循環(huán)而造成

的時(shí)間損失特異性強(qiáng)：針對(duì)靶序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的4種特異性引物。6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增。故其特異性極高。

高靈敏度，對(duì)于病毒擴(kuò)增模板可達(dá)幾個(gè)拷貝，比PCR高出數(shù)量級(jí)的差異。缺點(diǎn)：由于LAMP擴(kuò)增是鏈置換合成，靶序列長(zhǎng)度最好在300

bp以內(nèi)。>500

bp則較難擴(kuò)增。故不能進(jìn)行長(zhǎng)鏈DNA的擴(kuò)增。靈敏度高易造成假陽(yáng)性結(jié)果。27ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸技術(shù)優(yōu)勢(shì)LAMP克服了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)需要通環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermalamplification,簡(jiǎn)稱LAMP)是利用4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶,在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增DNA的新技術(shù)。LAMP技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)在核酸的科學(xué)研究、疾病的診斷和轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。28ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediat環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增原理60—65℃是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度，DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。利用引物合成的DNA鏈取代模板互補(bǔ)鏈。①擴(kuò)增目的片段時(shí)依賴的是一種具有鏈置換特性的BstDNA聚合酶②需四條能夠識(shí)別靶序列六個(gè)特異區(qū)域的引物③LAMP法并不需要對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行預(yù)變性及進(jìn)行溫度循環(huán)。

29ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增原理60—65℃是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫針對(duì)靶基因的六個(gè)不同的區(qū)域，基于靶基因3’端的F3c、F2c和Flc區(qū)以及5’端的Bl、B2和B3區(qū)等6個(gè)不同的位點(diǎn)設(shè)計(jì)4種引物。LAMP反應(yīng)的開(kāi)始階段四條引物都被使用，但在循環(huán)階段則只有內(nèi)引物被使用。FIP(ForwardInnerPrimer)：上游內(nèi)部引物，由F2區(qū)和F1C區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補(bǔ)，F(xiàn)1C區(qū)與靶基因5’端的Flc區(qū)域序列相同。F3引物：上游外部引物(ForwardOuterPrimer)，由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補(bǔ)。BIP引物：下游內(nèi)部引物(BackwardInnerPrimer)，由B1C和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3’端的B2c區(qū)域互補(bǔ)，B1C域與靶基因5’端的Blc區(qū)域序列相同。B3引物：下游外部引物(BackwardOuterPrimer)，由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補(bǔ)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)30ppt課件針對(duì)靶基因的六個(gè)不同的區(qū)域，基于靶基因3’端的F3c、F2環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)引物與對(duì)應(yīng)模板區(qū)域31ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)引物與對(duì)應(yīng)模板區(qū)域11pp環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理內(nèi)引物FIP的F2與其模板的互補(bǔ)序列F2c結(jié)合，在BstDNA聚合酶作用下，從F2的3’末端開(kāi)始啟動(dòng)DNA合成，合成一條以FIP為新的DNA單鏈并與模板鏈結(jié)合形成新的雙鏈DNA。32ppt課件環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理內(nèi)引物FIP的F2與其模板的互補(bǔ)序列

環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理以F3為起始合成的新鏈與模板鏈形成雙鏈。而原合成的以FIP為起始的DNA單鏈被置換而脫離產(chǎn)生一單鏈DNA，其在5’末端F1c和F1區(qū)發(fā)生自我堿基配對(duì)，形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

33ppt課件

環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理以F3為起始合成的新鏈與模板鏈形成環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理引物BIP的B2與模板鏈B2c區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，合成以BIP為起始的新鏈，并與模板鏈互補(bǔ)形成DNA雙鏈。同時(shí)，F(xiàn)端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)將被打開(kāi)，外引物B3與模板上B3c雜交后，以其3’末端為起點(diǎn)也開(kāi)始合成新鏈，并使以BIP為起始的DNA單鏈從模板鏈上脫離下來(lái)，形成以FIP和BIP為兩端的單鏈。因?yàn)锽1C與B1互補(bǔ)，F(xiàn)1C與F1互補(bǔ)，兩端自然發(fā)生堿基配對(duì)，這條游離于液體中的DNA單鏈分別在F和B末端形成兩個(gè)莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，于是整條鏈呈現(xiàn)啞鈴狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)即為L(zhǎng)AMP的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。形成LAMP基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)34ppt課件環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理引物BIP的B2與模板鏈B2c區(qū)互補(bǔ)環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理35ppt課件環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理15ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程演示36ppt課件環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程演示16ppt課件反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP的影響喬巖梅.

炭疽芽孢桿菌特征基因恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的研究[D].

中國(guó)科學(xué)院研究生院（