植物病害診斷匯總課件

第四章、植物病害診斷第四章、植物病害診斷一、病害的診斷步驟

二、田間辨認(rèn)傳染性病害

及非傳染性病害的簡(jiǎn)

易診斷原則

三、營(yíng)養(yǎng)障礙的診斷方法

四、傳染性病害的診斷一、病害的診斷步驟

二、田間辨認(rèn)傳染性病害

及非傳染一、病害的診斷步驟(一)田間觀察(二)病徵鑑別(三)解剖檢查(四)環(huán)境條件(五)病原鑑定一、病害的診斷步驟(一)田間觀察(一)田間觀察

各種病害之發(fā)生和發(fā)展都有一定的規(guī)律，所以到發(fā)病田間現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行觀察:(1)病害發(fā)生的普遍性和嚴(yán)重性。(2)發(fā)展的快慢，以及在田間的分布狀況。(一)田間觀察各種病害之發(fā)生和發(fā)展都(3)病害發(fā)生時(shí)期。

(4)寄主品種，受害部位、病徵

及發(fā)病田之土壤理化性；地勢(shì)

、昆蟲、雜草等環(huán)境條件，初

步判定病害的類別。(3)病害發(fā)生時(shí)期。

(4)寄主品種，受害部位、病徵

及發(fā)(二)病徵鑑別

各種植物病害一般具有特殊的病徵，這些病徵的表現(xiàn)是病原與寄主植物相互作用的反應(yīng)，所以病徵就各有其特定的表現(xiàn)。(二)病徵鑑別各種植物病害一般具有特

舉凡病株上發(fā)病部位，病部形狀、大小、顏色、氣味、質(zhì)地(軟、乾腐)、有無癥兆或癥兆類型等外部癥狀可用肉眼及擴(kuò)大鏡觀察，而罹病組織內(nèi)部之變化及病部產(chǎn)生的病原形態(tài)、構(gòu)造，只有以顯微鏡才能觀察。舉凡病株上發(fā)病部位，病部形狀、大小、顏色、氣味(三)解剖檢查

用新鮮幼嫩的病組織等製作切片，並應(yīng)用染色法處理，再鏡檢有無病原及內(nèi)部組織有無病理或形態(tài)上的變化。如在鏡檢下未見有病原或病毒所誘致的組織病變(包含內(nèi)含體)，即可結(jié)合上述田間觀察情況，提出非傳染性病害的可能原因。(三)解剖檢查用新鮮幼(四)環(huán)境條件

田間植物表現(xiàn)之病徵，有時(shí)不能單憑病徵及田間發(fā)病情況來診斷，必須對(duì)病害植物所在的環(huán)境條件等，進(jìn)行調(diào)查和綜合分析，以便確定致病原因。(四)環(huán)境條件田間植物表現(xiàn)之病徵，有時(shí)不(五)病原鑑定

有些病害經(jīng)由上述之田間觀察和病徵鑑別後，倘尚不能作出結(jié)論時(shí)，就必須進(jìn)一步作病原鑑定，但不同的病原其特性亦不同，因此在進(jìn)行病原鑑定時(shí)，除顯微鏡的使用外，仍需應(yīng)用某些特殊的診斷方法。(五)病原鑑定有些病害經(jīng)由上述之田間二、田間辨識(shí)傳染性病害

及非傳染性病害的簡(jiǎn)

易診斷原則二、田間辨識(shí)傳染性病害

及非傳染性病害的簡(jiǎn)

(一)傳染性病害通常有發(fā)病中心

；首先只發(fā)生在少數(shù)植株再漸

次擴(kuò)散，病斑不侷限於植株特

定部位，而營(yíng)養(yǎng)障礙的發(fā)生一

般呈全面性，其異常癥狀出現(xiàn)

在植株的特定部位。

(一)傳染性病害通常有發(fā)病中心

；首先只發(fā)生在少數(shù)植株再漸(二)傳染性病害之病徵，通常侷

限於葉片上的某部分區(qū)域且

分佈極不均勻，但是營(yíng)養(yǎng)障

礙在葉片上所造成之黃化(脫

綠)或壞疽區(qū)域有規(guī)則可依循

，且整片葉子都呈現(xiàn)較均勻的

癥狀。

(二)傳染性病害之病徵，通常侷

限於葉片上的某部分(三)傳染性病害之癥狀會(huì)因時(shí)間

之增加，病癥會(huì)日趨嚴(yán)重；

但是有些營(yíng)養(yǎng)缺乏之癥狀會(huì)

出現(xiàn)於作物生長(zhǎng)之早期，但

隨生長(zhǎng)而漸成熟或施加該缺

乏之養(yǎng)分後，癥狀會(huì)逐漸消

失。

(三)傳染性病害之癥狀會(huì)因時(shí)間

之增加，病癥會(huì)日趨嚴(yán)(四)傳染性病害與土壤肥力有關(guān)，

土壤類型及土壤特性較無特殊

相關(guān)，土壤肥沃時(shí)，有較易發(fā)

病的傾向。營(yíng)養(yǎng)障礙與土壤類

型、土壤特性有明顯的關(guān)係，

土壤類型不同所發(fā)生營(yíng)養(yǎng)障礙

可能完全不同，且在不同土壤

肥力狀況都可能發(fā)生，但以貧

瘠土壤較易發(fā)生。

(四)傳染性病害與土壤肥力有關(guān)，

土壤類型及土壤特性(五)傳染性病害通常易發(fā)生於陰濕

的環(huán)境，而植株濃密陰濕處更

易發(fā)生。營(yíng)養(yǎng)障礙則與地上部

濕度關(guān)係較小，但若土壤長(zhǎng)期

處於排水不良或乾燥缺水時(shí)，

較易誘發(fā)某些營(yíng)養(yǎng)障礙。①在

強(qiáng)酸性土壤作物容易發(fā)生鈣、

鎂、硼、鉬缺乏，及鋁、錳、

銅毒害②再鹼性(石灰土)土壤

則作物容易發(fā)生鐵、錳、銅、

鋅、硼缺乏。

(五)傳染性病害通常易發(fā)生於陰濕

的環(huán)境，而植株濃密三、營(yíng)養(yǎng)障礙的診斷方法

(一)目識(shí)診斷法

(二)可溶性養(yǎng)分分析(Solublenutrientanalysis)(三)組織化學(xué)及診斷法(HistochemicalandRapidtissuetest)(四)作物養(yǎng)分缺乏之誘導(dǎo)(五)植體分析(六)生化診斷法(Biochemicalindicators)(七)指標(biāo)植物鑑定法三、營(yíng)養(yǎng)障礙的診斷方法(一)目識(shí)診斷法(一)目識(shí)診斷法

雖然目識(shí)法的正確與否需要有豐富的經(jīng)驗(yàn)及敏銳的觀察力，一般目識(shí)診斷法的研判原則可歸納如下：(表2.1)(一)目識(shí)診斷法雖然目識(shí)法的正確與(2)外表呈現(xiàn)異常特徵

每種營(yíng)養(yǎng)元素在植物體內(nèi)均有其獨(dú)特的生理功能，為其他元素所無法彌補(bǔ)及取代的，因此該元素的缺乏或過多都將反映在作物外觀上，所以可從外觀的異常特徵來研判造成營(yíng)養(yǎng)障礙的元素種類。如：

(2)外表呈現(xiàn)異常特徵每種營(yíng)養(yǎng)元素①鎂、鐵、鋅、銅和錳都直接或間

接和葉綠素的形成或光合作用有

關(guān)係；所以這些元素缺乏時(shí)，一

般作物葉片的綠色都會(huì)出現(xiàn)淡化

褪綠、黃化、黃白化甚至白化的

現(xiàn)象。

①鎂、鐵、鋅、銅和錳都直接或間

接和葉綠素的形成或光合作②磷和硼與碳水化合物的運(yùn)轉(zhuǎn)

有關(guān)；缺乏時(shí)，碳水化合物

容易停留在葉片上而有利花青素

的形成，因此莖葉會(huì)呈紫紅色。

③鈣和硼與細(xì)胞分裂及細(xì)胞膜形成

有關(guān)；缺乏時(shí)，分生組織如生長(zhǎng)

點(diǎn)會(huì)萎縮和死亡。

②磷和硼與碳水化合物的運(yùn)轉(zhuǎn)

有關(guān)；缺乏時(shí)，碳水化合物

④硼和開花有關(guān)；硼缺乏時(shí)，花

粉、花粉管受阻，不能正常受

精而出現(xiàn)〝花而不實(shí)〞的現(xiàn)象。

⑤鋅與生長(zhǎng)素形成有關(guān)。鋅缺乏時(shí)

，會(huì)使生長(zhǎng)素形成不足而導(dǎo)致畸

型小葉叢生或小果。

④硼和開花有關(guān)；硼缺乏時(shí)，花

粉、花粉管受阻，不能正常受(二)可溶性養(yǎng)分分析

(Solublenutrientanalysis)

可溶性養(yǎng)分分析，亦可稱為組織速測(cè)法。此方法為根據(jù)葉或莖之抽取液與試劑之快速呈色反應(yīng)而估計(jì)植株?duì)I養(yǎng)狀況。因植物於充足養(yǎng)分供應(yīng)之情況下，部分養(yǎng)分可以離子或溶解之狀態(tài)存在，如養(yǎng)分供應(yīng)受到限制時(shí)，可溶解養(yǎng)分濃度下降。這種濃度之變化，經(jīng)化學(xué)呈色後與標(biāo)準(zhǔn)值或正常葉片反應(yīng)作一比較，可迅速估計(jì)植株養(yǎng)分之含量。(二)可溶性養(yǎng)分分析

(Solublenutrie目前可以買到”Merckoquant”試條，係西德Merck公司出品，對(duì)於氮、鉀、鈣之速測(cè)可快速測(cè)定，但其缺點(diǎn)為常受植株本身葉綠素之干擾，使呈色不能充分表現(xiàn)。如果用於果樹樹液之測(cè)定，則可用導(dǎo)管液抽取法，抽取不含葉綠素之樹液，呈色得以充分顯現(xiàn)。目前可以買到”Merckoquant”試條，係西德Merck(三)組織化學(xué)及診斷法

(HistochemicalandRapidtissuetest)

作物營(yíng)養(yǎng)失調(diào)可以引起細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)(finestructure)的變化，利用光學(xué)顯微鏡觀察，協(xié)助診斷因元素缺乏引起之形態(tài)及解剖上之變化。例如硼缺乏可引起植株形成層分裂但不分化。缺鈣引起髓細(xì)胞之自動(dòng)分解(autolysis)，缺鉀時(shí)皮層細(xì)胞有壞死或失去膨壓等現(xiàn)象，均可用顯微鏡觀察診斷。如果配合細(xì)胞染色法，許多養(yǎng)分缺乏便可快速檢定。缺鉀之組織可以dipicrylamine或sodiumcobaltnitrite法加以測(cè)定，缺鈣組織以picrolonicacid檢定也相當(dāng)方便。

(三)組織化學(xué)及診斷法

(Histochemical(五)植體分析

主要對(duì)象為礦物元素缺乏癥及鹽鹼害。一般將整株植物或其部分組織，或病田土壤進(jìn)行化學(xué)分析，以測(cè)定其礦物元素的成分和含量，並與健康植物的正常值進(jìn)行比較，即可確定病原。

(五)植體分析主要對(duì)象為礦物元素缺乏癥及鹽鹼害作物的營(yíng)養(yǎng)元素是否充足、缺乏或過多，可以由分析植物體內(nèi)的元素含量或由其外觀病徵加以判斷。植物組織元素分析之方法，詳見表2.3。例如臺(tái)灣柑桔類葉片礦物元素暫行標(biāo)準(zhǔn)(表2.4)

。作物的營(yíng)養(yǎng)元素是否充足、缺乏或過多，可以由分析植物體(六)生化診斷法

(Biochemicalindicators)

植物中金屬元素可促進(jìn)生化反應(yīng)，因此可利用生化診斷法診斷作物之礦物元素缺乏癥。特別是可利用酵素活性表現(xiàn)或代謝產(chǎn)物異常作為營(yíng)養(yǎng)失調(diào)診斷依據(jù)。

(六)生化診斷法

(Biochemicalindic(七)指標(biāo)植物鑑定法

礦物元素缺乏癥及空氣污染之鑑定均可使用此法。經(jīng)初步分析之可疑病因，可選用對(duì)該病因（如某元素）最敏感、病徵表現(xiàn)最明顯而穩(wěn)定的植物，種植在罹病植物附近，觀察其病徵反應(yīng)，藉以鑑定該植物是否為該種元素的缺乏癥。表6.5各種礦物元素缺乏癥之指標(biāo)植物其表現(xiàn)之癥狀。

(七)指標(biāo)植物鑑定法礦物元素缺乏癥及空氣污染之四、傳染性病害的診斷

傳染性病原菌所造成的病害部都具有傳染性，一旦在田間開始出現(xiàn)時(shí)，普遍呈分散狀分佈，由點(diǎn)擴(kuò)散到面，也就是由一感染之發(fā)病中心，逐漸向周圍擴(kuò)展的發(fā)病過程，有些病害在田間的擴(kuò)展與某些傳播昆蟲有密切的關(guān)聯(lián)性。

四、傳染性病害的診斷傳染性病原菌所(一)真菌病害的鑑定1.田間診斷及病徵鑑別2.病原的鑑定3.致病性測(cè)定（Pathogenicitytest）4.電子顯微技術(shù)5.電泳技術(shù)(一)真菌病害的鑑定1.田間診斷及病徵鑑別1.田間診斷及病徵鑑別：

真菌性病害其被害之組織表面有病徵，在病徵上有時(shí)可見有粉狀物、黴狀物、粒狀物、及銹粉等癥狀，因此極易與其他病原引起之病害區(qū)別。另一方面可將病株或病部組織攜回實(shí)驗(yàn)室，置於人工濕室內(nèi)培養(yǎng)，以促使病徵充分表現(xiàn)後，再行觀察。1.田間診斷及病徵鑑別：真菌性病害2.病原的鑑定：

一般係以解剖針直接從病組織上挑取子實(shí)體製片，並在顯微鏡下觀察其形態(tài)特徵，從而根據(jù)病原繁殖結(jié)構(gòu)之形態(tài)、孢子的形態(tài)、小大、顏色及著生及著生情況等進(jìn)行鑑定，但對(duì)少見或新的病害，應(yīng)謹(jǐn)慎小心，一般應(yīng)遵循分離培養(yǎng)，接種和再分離，即致病性的測(cè)定後，才作結(jié)論。這種診斷步驟稱為柯霍氏法則（Koch'spostulates）。2.病原的鑑定：一般係以解剖針直3.致病性測(cè)定

（Pathogenicitytest）：

對(duì)於剛新發(fā)現(xiàn)的或較少見的病害，其病原菌必須進(jìn)行致病性測(cè)定，於確認(rèn)具有致病性後，並須對(duì)其有性、無性孢子等繁殖器官之大小，及形態(tài)特徵等觀察以獲取所需鑑定之資料，並查閱相關(guān)之資料後，即可確定病原的種。有些病原真菌仍需測(cè)定其寄主範(fàn)圍後，才能確定係種或變種。

3.致病性測(cè)定

（Pathogenicitytest）：接種病原微生物

接種(inoculation)是指將接種源由其產(chǎn)生的場(chǎng)合轉(zhuǎn)移至感染點(diǎn)(infectioncourt)。接種時(shí)尚需注意下列五項(xiàng)影響因子。(1)被接種的植物是處於感病的(susceptible)時(shí)期及環(huán)境。(2)接種源是在適當(dāng)?shù)馁|(zhì)及量的狀況下。

接種病原微生物接種(inoculation)是(3)接種源是被置於一適當(dāng)?shù)母腥军c(diǎn)；許多病源感染植物的部位，只限於特定的組織或部位。(4)環(huán)境因子需利於感染；許多葉部病原在有高濕度及20~25℃的狀況下一夜，就可造成感染。(5)環(huán)境因子需利於病害的發(fā)展及病徵的表現(xiàn)；最重要的影響因子有溫度、濕度及光線。

(3)接種源是被置於一適當(dāng)?shù)母腥军c(diǎn)；許4.電子顯微技術(shù)：

如利用掃描電子顯微鏡，能觀察到微生物的三維立體形象，使得真菌的孢子及菌絲結(jié)構(gòu)的表面形狀，將形態(tài)學(xué)的鑑定提昇層次。而利用穿透式電子顯微鏡，可觀察游走孢子及子囊的微細(xì)結(jié)構(gòu)，可明顯顯示各種相關(guān)種真菌的差異及關(guān)係。

4.電子顯微技術(shù)：如利用掃描電子顯5.電泳技術(shù)：

帶電粒子（如膠體粒子等）在電場(chǎng)中會(huì)往電荷相反的電極移動(dòng)，稱為電泳（electrophoresis）。電泳的種類很多，現(xiàn)在最常用於生物及微生物鑑定的是聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)(圖5.1)

5.電泳技術(shù)：帶電粒子（如膠體粒子等）在電場(chǎng)中會(huì)它兼有分子篩（molecularsieve）和電泳的雙重作用，能將不同蛋白質(zhì)和酶等混合物，精細(xì)地將DNA片段分離出來，近年來採用此法，除可鑑定真菌外，尚可用於細(xì)菌及線蟲等方面的鑑定。

它兼有分子篩（molecularsieve）和電泳的雙重作(二)細(xì)菌病害的鑑定：

細(xì)菌病害的病徵類型較少，一般在潮濕環(huán)境下，在病部組織表面呈現(xiàn)黃色或乳白色的菌泥（ooze），為細(xì)菌病害的主要病兆。有些細(xì)菌病害並不產(chǎn)生菌泥，單從病徵上較不易診斷，需要用顯微鏡檢查病組織是否存在大量病原細(xì)菌。

(二)細(xì)菌病害的鑑定：細(xì)菌病害的

一般細(xì)菌病害診斷及細(xì)菌鑑定採用的方法如下所述：

1.革蘭氏染色（Gramstaining）2.選擇性培養(yǎng)基3.致病性測(cè)定（Pathogenicitytest）4.血清反應(yīng)鑑定（Serodiagnosis）5.噬菌體測(cè)定（Bacteriophagetest）6.核酸探針（DNAprobe）

一般細(xì)菌病害診斷及細(xì)菌鑑定採用的方法如下所述：1.革蘭氏染色

（Gramstaining）：

將病組織中泌出的細(xì)菌或分離培養(yǎng)的細(xì)菌，固定於載玻片上，進(jìn)行革蘭氏染色，細(xì)菌細(xì)胞呈藍(lán)色者為革蘭氏陽性細(xì)菌，呈紅色者為陰性細(xì)菌。

1.革蘭氏染色

（Gramstaining）：

以3％KOH溶液和濃厚菌液用牙籤均勻攪拌，大約在5-10秒內(nèi)，快速區(qū)分出植物病原細(xì)菌的革蘭反應(yīng)，革蘭氏陰性細(xì)菌由於細(xì)胞壁易被氫氧化鉀溶液分解，釋放出去氧核糖核酸（DNA），因而很快變黏稠；而陽性細(xì)菌則僅變混濁而分散在液滴中。

以3％KOH溶液和濃厚菌液用牙籤均勻攪拌，

在胺基勝肰活性的測(cè)定中，因革蘭氏陽性細(xì)菌並不會(huì)產(chǎn)生對(duì)硝基苯胺（p-nitroaniline）所以無反應(yīng)，但革蘭氏陰性伴隨對(duì)硝基苯胺之產(chǎn)生，而使菌落呈現(xiàn)黃色。

在胺基勝肰活性的測(cè)定中，因革蘭氏陽性細(xì)菌並不會(huì)2.選擇性培養(yǎng)基：

可在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)的病原微生物，利用它任對(duì)營(yíng)養(yǎng)及生理代謝等方面的特定需求，設(shè)計(jì)出適合於要分離的標(biāo)的微生物生長(zhǎng)，而抑制大多數(shù)其他微生物的培養(yǎng)基，稱之為選擇性培養(yǎng)基（selectivemedium）。

2.選擇性培養(yǎng)基：可在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)

如利用D1，D2，D3，D4及D5的選擇性培養(yǎng)可分別分離出Agrobacterium,Clavibacter,Erwinia,Pseudomonas及Xanthomonas等各屬。爾後更進(jìn)一步發(fā)展出可分離到某專一種的選擇性培養(yǎng)基，如分離梨火傷病菌(Erwiniaamylovora)的Miller-Schroth(MS)培養(yǎng)基，一般作物軟腐病菌（E.carotovora）之crystalvioletpectate（CVP）培養(yǎng)基等（表5.1）。如利用D1，D2，D3，D4及D5的選擇性培養(yǎng)可分別表5.1分離植物病原細(xì)菌之選擇性培養(yǎng)基

(依據(jù)Fahy，1983)種類培養(yǎng)基Erwiniaamylovora蔗糖含量高之培養(yǎng)基Miller-Schroth培養(yǎng)基（MS）ErwiniacarotovoraCrystalvioletpectate培養(yǎng)基（CVP）Pseudomonasspp.MediumBofKingetal.（KBA）+抗生素（具螢光性的）Pseudomonasspp.KBA+抗生素和果膠（具螢光性和果膠分解性的）StreptomycesscabiesTyrosinecaseinnitrateagarXanthomonascampestris可溶性澱粉+cycloheximide培養(yǎng)基（某些病變種）X.albilineansSucrosepeptoneagar+penicillin和cycloheximide表5.1分離植物病原細(xì)菌之選擇性培養(yǎng)基

3.致病性測(cè)定

（Pathogenicitytest）：

從感染植物組織分離獲得的純培養(yǎng)細(xì)菌，必須經(jīng)致病性測(cè)定，以符合Koch’s法則的要求，因此就需以各種接種方法進(jìn)行接種誘發(fā)病害試驗(yàn)。通常利用之植物接種測(cè)定為在菸葉上過敏性反應(yīng)的產(chǎn)生；核果及梨果類病原菌之使用摘離果接種法；產(chǎn)生葉部病害病原細(xì)菌則採用葉片浸潤(rùn)和噴霧接種測(cè)定。

3.致病性測(cè)定

（Pathogenicitytest）：4.血清反應(yīng)鑑定（Serodiagnosis）：

可用於比較不同種生物或微生物間蛋白質(zhì)的差異。而細(xì)菌具明顯的抗原性，通常使用活的細(xì)菌或在50-60oC下殺死的細(xì)菌，注射至兔子靜脈中，以獲得免疫血清，當(dāng)這種血清與相同的細(xì)菌接觸時(shí)，會(huì)產(chǎn)生凝聚反應(yīng)（agglutination），因此血清反應(yīng)能較快且準(zhǔn)確的測(cè)定出細(xì)菌的親緣關(guān)係，包括種、近似種和菌系。凝聚反應(yīng)試測(cè)也可配合電泳分析合併使用，而為免疫電泳法（immunoelectrophoresis）（圖5.2）。血清反應(yīng)在細(xì)菌、真菌及病毒的分類方面極有價(jià)值。

4.血清反應(yīng)鑑定（Serodiagnosis）：

免疫電泳法為免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合之方法。此電泳為一電化學(xué)法，具有淨(jìng)電荷之物質(zhì)於電流下發(fā)生移動(dòng)，其移動(dòng)可於瓊脂凝膠或注滿緩衝液之介質(zhì)如乙酸纖維素(celluloseacetate)中進(jìn)行，此時(shí)帶陽電荷物質(zhì)向陰極移動(dòng)，帶陰電荷物質(zhì)則向陽極移動(dòng)。

免疫電泳法為免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合之方法。此電5.噬菌體測(cè)定

（bacteriophagetest）：

噬菌體是寄生於細(xì)菌的病毒，有些噬菌體對(duì)某種或某菌系的細(xì)菌的寄生有專一性，因此，利用這噬菌體的專一性可以測(cè)定其特定的寄主細(xì)菌。例如柑桔潰瘍?。╔anthomonascampestrispv.citri）可用此法來測(cè)定。

5.噬菌體測(cè)定

（bacteriophagetest）：6.核酸探針（DNAprobe）：

DNA探針是利用篩選所得之DNA片段，即DNA引子對(duì)，加以標(biāo)識(shí)後，用來偵測(cè)病原細(xì)菌之存在與否，以及鑑定植物病原細(xì)菌。例如：6.核酸探針（DNAprobe）：D

細(xì)菌性軟腐病（bacterialsoftrot）：由Erwiniacarotovorasubsp.carotovora或E.chysanthemi所引起的，可利用引子對(duì)

5A(5′－GCGGTTGTTCACCAGGTGTTTT-3’)、

5B(5′－ATGGCACGCTACCTGGAAGTAT-3’)、

Y1(5′－TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3’)、

Y2(5′－CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT-3’)

運(yùn)用PCR技術(shù)針對(duì)罹病組織進(jìn)行偵測(cè)鑑定，其中引子對(duì)5A/5B可針對(duì)E.chrysanthemi增幅出500bp之DNA片段，引子對(duì)Y1/Y2可針對(duì)E.carotovorasubsp.Chrysanthemi增幅出500bp之DNA片段，引子對(duì)Y1/Y2可針對(duì)E.carotovorasubsp.carotovora增幅出434bp之DNA片段。

細(xì)菌性軟腐?。╞acterialsoftrot）(三)植物菌質(zhì)體（Phytoplasma）、

螺旋菌質(zhì)體（Spiroplasma）及

木質(zhì)部小菌（Xylella）病害的

鑑定：

這類病原危害都可導(dǎo)致植物葉片組織黃化，植株矮化等系統(tǒng)性病害，此三種病原菌之診斷特性略有差異，若被害植物已排除了是由非生物因素所引起者，可進(jìn)而依下列方法鑑定。

(三)植物菌質(zhì)體（Phytoplasma）、

螺旋菌1.電子顯微鏡法：

對(duì)罹病組織或帶菌媒介昆蟲組織作超薄切片鏡檢，若病組織中或帶菌媒介昆蟲的唾腺組織中，發(fā)現(xiàn)植物菌質(zhì)體或螺旋菌質(zhì)體，而對(duì)照健全組織卻未發(fā)現(xiàn)，則可證明該病原為植物菌質(zhì)體或螺旋菌質(zhì)體。

1.電子顯微鏡法：對(duì)罹病組織或帶2.簡(jiǎn)易光學(xué)顯微鏡診斷：

可直接觀察病植物維管束組織之抽出液，或培養(yǎng)物濾液中之螺旋菌質(zhì)體。

2.簡(jiǎn)易光學(xué)顯微鏡診斷：可直接觀察病植物3.培養(yǎng)診斷法：

在人工合成培養(yǎng)基內(nèi)加入山梨糖醇（sorbitol）或蔗糖，以增加培養(yǎng)基的滲透壓，可以成功地分離到螺旋菌質(zhì)體及部分木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)的木質(zhì)部小菌（Xylellafastidiosa），如下圖所表示者：

3.培養(yǎng)診斷法：在人工合成培養(yǎng)基內(nèi)4.熱療試驗(yàn)：

病植物繁殖材料，以熱療法處理後，對(duì)由植物菌質(zhì)體和木質(zhì)部小菌所危害者有療效，因?yàn)槎呔鶎?duì)熱敏感，但螺旋菌質(zhì)體對(duì)熱不敏感，因此可根據(jù)處理後病徵是否消失或減輕之狀況，來判斷病原。

4.熱療試驗(yàn)：病植物繁殖材料，以熱(四)病毒病害的鑑定：

經(jīng)田間初步綜合分析判斷，病徵為病毒病後，再根據(jù)病毒的傳播方式、寄主範(fàn)圍及在指標(biāo)植物上病徵的表現(xiàn)做進(jìn)一步鑑定。目前對(duì)病毒的鑑定主要是以其生物學(xué)性狀、物理性狀、電子顯微鏡觀察病毒形態(tài)及血清方法等為依據(jù)，再根據(jù)已報(bào)導(dǎo)之有關(guān)文獻(xiàn)分析比較，以確定其種類。

(四)病毒病害的鑑定：1.生物檢定法：

利用指標(biāo)植物例如紅葉藜（Chenopodiumamaranticolor），奎藜（C.quinoa）等，可將欲診斷之病毒抽出液機(jī)械接種於第3or第4葉片上，以觀察其局部病斑是否出現(xiàn)，若出現(xiàn)其情形又如何。

1.生物檢定法：利用指標(biāo)植物例如紅葉藜2.血清學(xué)診斷：

若能製備或購買到各種作物病害的抗血清，則能利用抗血清中的抗體IgG能和原來產(chǎn)生抗體的抗原（病原）發(fā)生專一性反應(yīng)的原理，即能快速簡(jiǎn)便偵測(cè)到有否病原之存在。2.血清學(xué)診斷：若能製備或購買到各

血清診斷的應(yīng)用，依檢查目的的不同有多元抗體（polyclonalantibody）與單元抗體

（monoclonalantibody）之分，多元抗體對(duì)偵測(cè)有否病原的存在較有利，有如散彈槍，而一般針對(duì)未經(jīng)純化材料的血清反應(yīng)偵測(cè)方法甚多，較常用的簡(jiǎn)述如下：

血清診斷的應(yīng)用，依檢查目的的不同有多元抗體（pol（1）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（Double

diffusionagarassay）：

首先在玻片或培養(yǎng)皿上製備瓊脂凝膠板，凝固後依實(shí)際需要，在瓊脂上挖幾個(gè)小孔，孔間保持一定距離，然後將抗原與抗體分別注入小孔中，使它們互相擴(kuò)散，經(jīng)過一段時(shí)間後，於抗原與其相應(yīng)抗體接觸處，形成清晰之白色沈澱弧。每一相應(yīng)的抗原抗體僅能形成一條沈澱弧，因此依據(jù)其沈澱弧之?dāng)?shù)目，即可推測(cè)抗原液中，有多少種抗原，也可依據(jù)沈澱弧融合或交叉關(guān)係，鑑定兩種抗原是否完全相同，部分相同或完全不同（圖5.3）。

（1）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（Double

diffus（2）酶連結(jié)抗體法（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）：

酶連結(jié)抗體法又稱酶免疫分析法（enzymeimmunoassay,EIA），主要用於免疫診斷病毒感染和其他微生物抗原，敏感度高。其所測(cè)定之原理依據(jù)有二點(diǎn)：（1）抗體與部分抗原能吸附於聚乙烯苯（polysytrene）平板小孔內(nèi)，而仍可保持其完整之免疫力；（2）抗原和抗體能與酶結(jié)合形成複合物，此複合物也仍保持完整的免疫和酶功能。一般較常應(yīng)用的方法有雙重抗體三明治法（doubleantibodysandwichassay）和間接免疫吸附法（indirectimmunosorbentassay）。以前者為例說明(圖5.4)：

（2）酶連結(jié)抗體法（Enzyme-linkedimmuno（3）單元抗體

（Monoclonalantibody）：

所謂單元抗體簡(jiǎn)言之是由一個(gè)抗原決定基(epitope=antigendetermineside)所產(chǎn)生出來的抗體稱為單元抗體，單元抗體用於微量抗原的檢測(cè)。想要得到單元抗體，首先要以病毒為抗原免疫注射至白鼠，然後取出脾臟並分離出脾臟細(xì)胞（splencell）與事先培養(yǎng)準(zhǔn)備好的骨髓腫瘤細(xì)胞（myelomacell）培養(yǎng)融合，在選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)下，篩選出脾臟細(xì)胞和骨髓腫瘤細(xì)胞相互融合的細(xì)胞，此種細(xì)胞稱為融合瘤（hybridoma）。

（3）單元抗體

（Monoclonalantibody所得的融合瘤經(jīng)過單一融合瘤細(xì)胞篩選培養(yǎng)，如此所產(chǎn)生出來的抗體就叫單元抗體，又經(jīng)過反應(yīng)鑑定該單元抗體的性質(zhì)後，便可靠繼代培養(yǎng)大規(guī)模地生產(chǎn)高效價(jià)、高度專一化的抗體，用以診檢植物病毒、細(xì)菌和真菌等。具快速和準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

上述之骨髓腫瘤細(xì)胞能在體外傳代繁殖，而免疫動(dòng)物的脾臟細(xì)胞則能產(chǎn)生抗免疫抗原的抗體，兩者融合後的融合瘤細(xì)胞則兼有能產(chǎn)生抗體和體外大量繁殖的特點(diǎn)。

所得的融合瘤經(jīng)過單一融合瘤細(xì)胞篩選培養(yǎng)，如此所產(chǎn)生出來的抗體3.電子顯微鏡法：

由於病毒之顆粒極小，除了電子顯微鏡外，沒有其他之工具可以用來觀察單一的病毒顆粒體。病毒形狀與大小是診斷病毒的一種方法，如果再配合免疫血清學(xué)的方法，其診斷病毒的敏感度與一般認(rèn)為敏感度最高的酶連合抗體法相似。

3.電子顯微鏡法：由於病毒之顆粒極小，4.簡(jiǎn)易光學(xué)顯微鏡診斷法：一般而言，植物病毒感染後皆可在組織內(nèi)產(chǎn)生特有的內(nèi)含體（inclusion），此種內(nèi)含體可能為聚集之病毒顆粒、病毒基因的產(chǎn)物等，這些內(nèi)含體經(jīng)過特殊的染色過程後，可在一般光顯微鏡下檢查出來。

4.簡(jiǎn)易光學(xué)顯微鏡診斷法：一般而言，植物病毒感染後取新鮮的植物表皮組織，用5號(hào)鑷子撕下下表皮而直接放入染色液內(nèi)染色，於經(jīng)過酒精脫色後，再以2-methoxyethylacetate（2-甲氧基乙基醋酸）處理，即可封埋於載玻片上，利用光學(xué)顯微鏡油浸鏡頭觀察之。染色方法有AzureA（紫紅核酸染劑）及Calcomineorange-Luxolbrilliantgreen（橙綠蛋白質(zhì)染劑）二種，前者是針對(duì)內(nèi)含體有核蛋白或核酸成份者，如Cucumbermosaicvirus所引起之內(nèi)含體(圖5.5)，後者是用來染色內(nèi)含體為蛋白質(zhì)性質(zhì)者，如Tobaccomosaicvirus所引起之細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含體(圖5.6)。取新鮮的植物表皮組織，用5號(hào)鑷子撕下下表皮而直接放入(五)線蟲病害病原的鑑定(五)線蟲病害病原的鑑定