層析技術課件

第五章層析技術生物化學與分子生物學教研室

徐宏偉第五章層析技術生物化學與分子生物學教研室

徐宏偉層析法也稱色譜法(chromatography)，是1906年俄國植物學家MichaelTswett發(fā)現并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”。1941年，英國生物學家Martin和Synge首先提出了色譜塔板理論，為后來各種色譜技術的發(fā)展奠定了基礎。層析法也稱色譜法(chromatography)層析法最基本的特征是有一個固定相和一個流動相，當兩相作相對運動時，由于混合物中各組分在物理化學性質(如吸附力、溶解度、分子的形狀與大小、分子的電荷性及親和力等)上的差別，使各組分在兩相間進行反復多次的分配而得到分離。層析法最基本的特征是有一個固定相和一個流動相，當兩相作相對運

層析類別主要依據的理化性質此類的層析方法舉例吸附層析吸附力磷酸鈣凝膠層析分配層析分配系數各種薄層層析、紙上層析離子交換層析分子的電荷性、極性DEAE-纖維素柱層析凝膠過濾層析分子大小交聯葡聚糖柱層析親和層析親和分子間的親和力

層析類別主要依據的理化性質層析技術可按兩相的狀態(tài)不同進行分類，如以氣體為流動相的叫做氣相層析（gaschromatography），以液體為流動相的叫做液相層析（liquidchromatography）。由于固定相也有液體和固體的不同，故氣相層析還可細分為氣—液和氣—固層析兩種，同理，液相層析即可細分為液—液和液—固層析兩種。層析技術可按兩相的狀態(tài)不同進行分類，如以氣體為流動相的叫做氣

根據流動相的形式：液相層析、氣相層析

根據流動相的形式：層析基本操作過程

裝置選擇上樣和洗脫結果檢測

上樣均一性洗脫裝置目的不同檢測方法不同活性檢測基質均勻性柱層析的L/d比值層析基本操作過程裝置選擇上樣和洗脫結果檢測上樣均一性4、層析裝置的儀器化HPLC與微機、質譜等連用4、層析裝置的儀器化HPLC與微機、質譜等連用層析前蛋白質處理

主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白質，但分辨率低。層析前蛋白質處理主要是利用鹽析法、等第一節(jié)凝膠過濾層析技術又稱凝膠排阻層析或分子篩方法利用某些化學惰性的多孔網狀結構的物質(多為凝膠)為填料，使混合物中的各種物質按其分子大小不同得到分離。第一節(jié)凝膠過濾層析技術又稱凝膠排阻層析或分子篩方法優(yōu)點：凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，溫度范圍廣，不需要有機溶劑，分離效果好缺點：樣品被不斷稀釋，上樣量不能太大，否則分辨率變差優(yōu)點：凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和一、凝膠過濾層析的基本原理多孔性親水性凝膠一是隨洗脫液垂直向下移動二是無定向的擴散運動。凝膠顆粒內部具有多孔網狀結構，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內外，在柱內經過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。一、凝膠過濾層析的基本原理多孔性親水性凝膠

凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網狀結構的物質，每個顆粒的細微結構及篩孔的直徑均勻一致，小分子可以進入凝膠網孔，而大分子則排阻于顆粒之外。凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網狀結構的物質，每個顆大分子物質沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動，流程短，移動速率快，先被洗出層析柱小分子物質可通過凝膠網孔進入顆粒內部，然后再擴散出來，故流程長，移動速度慢，最后被洗出層析柱大分子物質沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動，流程短，移動速率快，先第七章層析技術課件第七章層析技術課件目錄目錄分配系數(kd)Ve為某一被分離成分被洗脫時所用洗脫液的體積，稱為洗脫體積；Vo為凝膠顆粒間自由空間的總容積，稱為空白體積或外水體積；Vi為凝膠顆粒內部孔穴的總容積，稱為內水體積或進人體積。

分配系數(kd)Ve為某一被分離成分被洗脫時所用洗脫液的體體積參數分子在柱中移動的速度取決于該分子在固定相和流動相間的分配系數Kd，Kd表示某一分子在特定的凝膠柱內的洗脫行為。Kd＝(Ve一Vo)／ViVe洗脫體積Vo外水體積Vi內水體積體積參數分子在柱中移動的速度第七章層析技術課件Ve=Vo該成分的分子全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中，因而洗脫速度最快。即該成分的Kd＝0。Vi＝Ve-Vo該成分不被排阻而可完成進入凝膠顆粒內部,因而洗脫速度最慢。即該成分的Kd=l。Kd值介于0-l之間，物質的洗脫速度隨其Kd值的增加而降低一般物質的Kd值是0<Kd<l。

洗脫行為可以有三種可能的情況:洗脫行為可以有三種可能的情況:

凝膠Kd＝0Kd=l0<Kd<l凝膠Kd＝0Kd=l0<Kd<l第七章層析技術課件Kd具有以下意義：（1）對于完全被排阻的極端大分子，由于Ve＝Vo，因此Kd＝O（2）對于能自由擴散凝膠顆粒內部的小分子物質，Ve＝Vo＋Vi，Kd＝1（3）對于能部分擴散入凝膠顆粒內部的大分子物質，Kd在0～1之間（4）凡Kd＞1的物質，表明它們能被凝膠吸附或具有離子交換作用，而不僅僅是分子篩效應（5）Kd值越接近1，表明分子越小，洗脫越慢；相反，Kd值越接近0，表明分子越大，洗脫越快。Kd具有以下意義：（1）對于完全被排阻的極端大分子，由于Ve柱床體積(Vt)為凝膠基架的總體積(Vr)與內水體積(Vi)及外水體積(Vo)之和。實驗室常用Vt－Vo代替Vi來計算分配系數，所得值稱為平均分配系數，用Kav表示，其定義為

對于某一特定的凝膠柱，Kav與kd之比是1個常數，它不隨溶質的性質或濃度而改變，因此可代替kd來度量被分離物的洗脫行為。

柱床體積(Vt)為凝膠基架的總體積(Vr)與內水體積影響分離效果的因素流速加樣體積樣品濃度離子強度影響分離效果的因素流速二、常用凝膠的種類和性質立體多孔網狀結構，惰性對pH和溫度的穩(wěn)定性能反復使用顆粒大小比較均勻葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠及瓊脂糖凝膠。二、常用凝膠的種類和性質立體多孔網狀結構，惰性凝膠過濾層析的介質

葡聚糖系列瓊脂糖系列聚丙烯酰胺系列多孔硅膠凝膠過濾層析的介質葡聚糖系列

基本操作

凝膠的選擇凝膠柱的制備上樣洗脫凝膠柱的重復使用與保存基本操作凝膠的選擇三、凝膠過濾層析的實驗技術

(一)凝膠的選擇與處理

根據被分離物質分子的大小、形狀和分離目的進行選擇1.分離分子量相差懸殊的兩種物質，如蛋白質脫鹽2.純化蛋白質時，則需要根據各組分的分子量分布范圍及各種凝膠的分離范圍選用合適的凝膠

三、凝膠過濾層析的實驗技術(一)凝膠的選擇與處理粗粒，中粒：分離效果差，但流速快，可用于工業(yè)上物質的制備細粒：洗脫曲線峰形對稱、峽窄、分離度好超細顆粒：能給予最好分離，但流速慢，實驗時間長粗粒，中粒：分離效果差，但流速快，可用于工業(yè)上物質的制(二)層析柱的選擇

柱子要直，內徑均一；下端死區(qū)小柱的有效長度越大，洗脫峰之間的距離則越寬，分辨率越高。過細的柱子，會因管壁效應而影響分離效果(二)層析柱的選擇柱層析的L/d比值

柱層析的L/d比值2、凝膠柱的制備

用于分組分離

短而粗L/D值＜10

用于分級分離

L/D值比較大對很難分離的組分一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1～5cm范圍內，小于1cm產生管壁效應，大于5cm則稀釋現象嚴重。柱L/D值的選擇2、凝膠柱的制備用于分組分離柱L/D值的選擇裝柱前，凝膠基質用蒸餾水或洗脫液中充分溶脹。凝膠柱填裝后通常可以采用一種有色的物質，如藍色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，以檢測凝膠柱的均勻程度。裝柱前，凝膠基質用蒸餾水或洗脫液中充分溶脹。

(三)洗脫劑的選擇

能完全溶解欲分離的樣品而且對樣品的穩(wěn)定無影響；且不影響對樣品的監(jiān)測，并能很快去除。洗脫劑的離子強度至少0.2mol/L(三)洗脫劑的選擇(四)裝柱

層析柱垂直，氣泡排除，一次傾入層析柱洗脫平衡凝膠柱應均勻、無斷層、無氣泡(五)上樣

樣品應預先離心，均勻地加樣(四)裝柱(六)洗脫注意控制流速降低流速通常能提高分辨率流速過慢，則縱向擴散和對流反會限制分辨率的提高流出液用人工或自動部分收集器定量地分部收集(七)保存

加防腐劑或滅菌后，可置冰箱中保存數月(六)洗脫四、凝膠過濾層析的應用1、主要用于大分子物質：如蛋白質、核酸、多糖等的分離2、脫鹽，放射性同位素，熒光素3、蛋白質的分子量的測定離心柱層析法：分子克隆四、凝膠過濾層析的應用1、主要用于大分子物質：如蛋白質、3、測定高分子物質的分子量測大于所用載體上限分子的洗脫體積測小于下限的分子的洗脫體積標定凝膠過濾柱的Vo標定凝膠過濾柱的Vi測定一系列已知分子量的標淮樣品在柱上的洗脫體積Ve以(Ve-Vi)／(Vo-Vi)和1ogMw作圖測得了待測分子量的樣品的Ve由(Ve-Vi)／(Vo-Vi)從標準曲線上可以求得未知樣品的分子量藍色葡聚糖氨基酸、有色鹽類↓↓↓↓↓↘↙以標準樣品的分子量的1ogMw對Ve作圖or3、測定高分子物質的分子量測大于所用載體上限分子的洗脫體積測

洗脫液中蛋白質濃度洗脫液中蛋白質濃度第七章層析技術課件4、高分子溶液的濃縮將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中水分和低分子量的物質就會進入凝膠粒子內部高分子物質則排阻在凝膠顆粒之外離心或過濾，去除溶脹的凝膠濃縮的高分子溶液↓4、高分子溶液的濃縮將SephadexG-25或50干膠投入5、蛋白質復性研究變性蛋白加入凝膠柱高濃度變性劑存在，蛋白呈無規(guī)則卷曲變性蛋白體積大，只能進入顆粒間隙，遷移速度快變性劑分子量小，進入顆粒內部，遷移速度慢緩沖液洗脫蛋白變性劑濃度降低，轉成復性緩沖液變性蛋白復性，以天然形態(tài)洗脫出柱↓↓↓↓↓↓5、蛋白質復性研究變性蛋白加入凝膠柱高濃度變性劑存在，蛋白呈五、注意事項(一)柱床支持物使用不當(二)凝膠膨脹過程中操作不當(三)凝膠柱、毛細管和流出口處有氣泡(四)工作壓過高(五)層析柱的保潔差五、注意事項(一)柱床支持物使用不當第二節(jié)離子交換層析技術離子交換層析(ion-exchangechromatography)是根據物質所帶電荷的差別進行分離純化的一種方法第二節(jié)離子交換層析技術離子交換層析(ion-exchan一、離子交換層析的基本原理一、離子交換層析的基本原理離子交換劑是以纖維素或葡聚糖凝膠等不溶性物質為母體引入陽性或陰性離子基團的特殊制劑帶有陽離子基團的交換劑，可置換吸附帶負電荷的物質，稱為陰離子交換劑

帶陰離子基團的交換劑，則可置換吸附帶正電荷的物質，稱為陽離子交換劑

離子交換劑是以纖維素或葡聚糖凝膠等不溶性物質為母體

蛋白質分子是兩性物質不同的蛋白質有不同的等電點，與不同類型離子交換劑以不同的親和力相互交換吸附。當緩沖液中的離子基團與結合在交換劑上的蛋白質相競爭時親和力小的蛋白質分子首先被解吸而洗脫親和力大的蛋白質則后被解吸與洗脫因此，依靠增加緩沖液的離子強度和/或改變酸堿度，可改變蛋白質的吸附狀況，使不同親和力的蛋白質得以分離。

蛋白質分子是兩性物質第七章層析技術課件目錄目錄離子交換劑的基質

瓊脂糖離子交換劑

離子交換交聯葡聚糖聚苯乙烯離子交換纖維素離子交換劑的基質瓊脂糖離子交換聚苯乙烯離子交換

二、常用離子交換劑的種類及其性質1、離子交換纖維素樹脂以纖維素為母體，結合一定的離子基團而成。離子交換纖維素上的交換基團排列疏散，對蛋白質等大分子的吸附不太牢固，用溫和的條件便可將其洗脫下來，因此不會引起大分子變性，是分離蛋白質、核酸、抗生素等不太穩(wěn)定的生化物質的理想介質。二、常用離子交換劑的種類及其性質1、離子交換纖維素樹脂

常用：DEAE-纖維素（二乙基氨基纖維素）CM-纖維素（羧甲基纖維素）開放性長鏈和松散的網狀結構，有較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實際交換容量要比離子交換樹脂大的多。親水性，對蛋白質等生物大分子物質吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達到分離的目的，因此不致引起生物大分子物質的變性和失活。

回收率高優(yōu)點：常用：DEAE-纖維素（二乙基氨基纖維素）開放性長鏈和松2、離子交換葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠為母體，結合一定的離子基團而成交換容量大，一般為離子交換纖維素的3-5倍由于其是網狀結構，因而其不僅具有離子交換能力，還同時兼有分子篩的作用。2、離子交換葡聚糖凝膠基本操作緩沖液的選擇層析柱的選擇

洗脫流速↓↙加樣洗脫洗脫液的監(jiān)測收集及組分鑒定離子交換劑的清洗、再生和保存

↓↓↓←離子交換劑的處理

↘↑離子交換劑的選擇

基本操作緩沖液的選擇層析柱的選擇洗脫流速↓↙加樣洗脫三、離子交換層析的實驗技術（一）離子交換劑的選擇與處理有陰陽離子之分外，還有強弱之分應根據被分離物質的物理化學性質，即根據其所帶電荷的種類、數量及所處的環(huán)境，尤其是環(huán)境中是否有其它離子，這些離子的電性、數量等因素進行選擇。三、離子交換層析的實驗技術（一）離子交換劑的選擇與處理對吸附性強的離子或不穩(wěn)定的物質，常選用弱酸性或弱堿性離子交換樹脂，這樣易于洗脫和再生，也不易破壞被分離物質對于吸附性弱的離子，常選用強酸性或強堿性離子交換樹脂，這樣可利用堿性或酸性條件增強被吸附物的離子化作用。對吸附性強的離子或不穩(wěn)定的物質，常選用弱酸性或弱堿性離子交換分離蛋白質時若在高于其等電點的pH條件下不發(fā)生變性，則可選用陰離子交換劑；若在低于其等電點的pH條件下，不發(fā)生變性，則可選用陽離子交換劑；如果某蛋白質在高于或低于其等電點1個pH單位的條件下都很穩(wěn)定，則選用兩種離子交換劑中的任何一種均可達到分離目的。分離蛋白質時第七章層析技術課件2、離子交換劑的處理酸堿浸泡進一步去除雜質，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子，一般陽離子交換劑最后用堿NaOH處理，陰離子交換劑最后用酸HCl處理。

膨化將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的配基充分暴露出來。水懸浮去除雜質和細小顆粒2、離子交換劑的處理酸堿浸泡膨化水懸浮

(二)裝柱一般以直徑與長度之比為1：15為宜當樣品量多且組分復雜時，可選用稍長的柱子用起始緩沖液充分滴注洗脫，至流出液與進柱前溶液有相同的pH應注意離子交換樹脂在柱中均勻分布(三)加樣

加樣前，樣品應預先對起始緩沖液充分透析平衡(二)裝柱(四)洗脫

①增加緩沖液離子強度②改變pH③同時改變離子強度與pH(四)洗脫洗脫的方式①一步洗脫法②分段洗脫法③梯度洗脫法：用濃度(或pH)連續(xù)改變的洗脫液進行洗脫。洗脫的方式第七章層析技術課件洗脫速度洗脫速度通常要保持恒定洗脫速度慢比快的分辨率好如果洗脫峰相對集中某個區(qū)域造成重疊，則應適當縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當提高洗脫速度。洗脫速度洗脫速度通常要保持恒定洗脫液的監(jiān)測收集及組分鑒定監(jiān)測

用紫外檢測儀進行，在280nm處觀察洗脫液的光吸收收集

用分布收集器收集，可以自動收集，也可以手動收集鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳、測定活性等洗脫液的監(jiān)測收集及組分鑒定監(jiān)測離子交換劑的清洗、再生和保存

可溶于堿的污染物

0.1mol/LNaOH洗滌Milli-Q純化的蒸餾水洗滌

結合緩沖液洗滌可以除去諸如脂類、蛋白質和核酸這類的污染物。對于疏水性污染物乙醇溶液（如70%的乙醇）或非離子型的去污劑洗滌可以除去脂類和其他的疏水性物質?！x子交換劑的清洗、再生和保存可溶于堿的污染物→→金屬污染物

EDTA飽和的10mmol/LHCL（即pH=2）處理柱子沉淀物雜質

去污劑、尿素和鹽酸胍，可將柱子在6mol/L的尿素中平衡和溫育，然后用去離子水和緩沖液洗滌。金屬污染物

再生

對使用過的離子交換劑進行處理，使其恢復原來性狀的過程。酸堿交替浸泡保存處理洗凈蛋白等雜質后，加入適當的防腐劑，一般加入0.02%的疊氮鈉，4°C下保存。再生第三節(jié)親和層析技術親和層析(affinitychromatography)是利用生物分子間的親和吸附和解吸而設計的層析方法，即通過固定于水不溶性的固相支持物(載體)上的互補物(配體)的特異性，可逆性的吸附而使物質分離。該層析條件溫和，過程簡單，純化的倍數高，第三節(jié)親和層析技術親和層析(affinitychrom對分離含量低又不甚穩(wěn)定的生物活性物質極為有效專門的吸附劑，并尋找一種專門的層析條件方能進行工作。對分離含量低又不甚穩(wěn)定的生物活性物質極為有效一、親和層析的基本原理生物大分子具有和某些相對應的專一分子(一般為結構上與其相應的分子)相結合的特性這種結合既是特異性的，又是可逆性的；改變條件又能使這種結合解除生物分子間的這種結合能力，稱為親和力一、親和層析的基本原理生物大分子具有和某些相對應的專一分酶的活性部位和底物、抑制劑、輔助因子酶的變構中心與變構因子(或稱效應物)之間抗原與抗體之間激素與受體之間核糖核酸與其互補脫氧核糖核酸之間酶的活性部位和底物、抑制劑、輔助因子親和力生物分子間存在很多特異性的相互作用，如抗原－抗體、酶－底物或抑制劑、激素－受體等，它們之間都能夠專一而可逆的結合。分離原理通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行分離純化。親和力第七章層析技術課件第七章層析技術課件第七章層析技術課件二、親和層析的實驗技術載體活化、配體偶聯、樣品吸附、解吸分離

(一)載體的種類與選擇

必須有高親水性，使生物大分子容易與它接近它的非特異性吸附要十分小它必須具有大量可供活化而能與配體結合的基團二、親和層析的實驗技術載體活化、配體偶聯、樣品吸附、解吸分離纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃等纖維素：有比較強的非特異性吸附作用葡聚糖凝膠網孔孔徑較小，通透性差，應用最廣的是瓊脂糖凝膠制品。

纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃等珠狀瓊脂糖凝膠(Sepharose2B、4B和6B)溴化氰(CNBr)活化適于偶聯各種含游離-NH2的配體珠狀瓊脂糖凝膠親水性強，理化性質穩(wěn)定，具有疏松的網狀結構珠狀瓊脂糖凝膠(Sepharose2B、4B和6B)在親和層析中，常用小分子物質作為配體親和吸附與其相配的大分子物質。在載體與配體之間引入一“手臂”(間臂)，配體就得以伸人溶液，從而可大大提高吸附效率。間臂的長度要恰當，太短效果不顯著，太長易造成彎曲折疊，反而減小吸附能力在親和層析中，常用小分子物質作為配體親和吸附與其相配的大分子第七章層析技術課件第七章層析技術課件(二)配體的選擇好的配體是親和層析的基礎

1、配體必須有對所純化物質的特異性和可逆性的親和作用親和力太弱，不足以用于親和層析有效地純化所需要的物質親和力太強，要想使被結合物不失活而被洗脫，則可能很困難2．配體必須具有在活性部位以外的化學上可修飾的基團：通過這些基團，配體可與載體偶聯，而不破壞其與親和分子結合的活性。(二)配體的選擇好的配體是親和層析的基礎(三)載體活化與配體偶聯充分膨脹與洗滌后，在攪拌下滴加溴化氫pH保持在11，偶聯反應在pH8～10范圍最有效回旋偶聯2小時，或4℃偶聯過夜封閉載體上未被配體偶聯的所有活性位點(三)載體活化與配體偶聯配體與待分離的物質有適當的親和力與待分離的物質之間的親和力要有較強的特異性與載體穩(wěn)定的共價結合自身應具有較好的穩(wěn)定性配體配體的分類特異性配體只與單一或很少種類的蛋白質等生物大分子結合的配體eg.抗原和抗體、酶和它的抑制劑

通用性配體特異性不是很強，能和某一類的蛋白質等生物大分子結合的配體eg.凝集素可以結合各種糖蛋白

配體的分類特異性配體蛋白質親和層析中的合適配體蛋白質親和層析中的合適配體基本操作選擇適當的配體將配體固定化到基質上將目的蛋白混合液加樣到基質上除去非特異性結合的蛋白質洗脫純的目的蛋白基本操作選擇適當的配體第七章層析技術課件上樣層析柱較短，通常10cm左右樣品液的濃度不宜過高上樣時流速比較慢樣品緩沖液中有一定的的離子強度上樣時選擇適當較低的溫度上樣層析柱較短，通常10cm左右(四)層析為使樣品吸附完全，親和層析可反復上樣

當被分離的混合液通過親和層析柱時，相應的分子與配體發(fā)生特異性親和反應而被吸附，其它雜質則流出柱外。然后，需要用適當的洗脫緩沖液將被吸附的物質解吸下來。

1.專一性洗脫：用于親和結合力相對弱的物質，洗脫劑是通過競爭性的與配體結合而將被分離物解吸洗脫下來的(四)層析2．非專一性洗脫：(1)pH變化：用pH梯度洗脫比用單一pH洗脫更為有效（2）離子強度變化：NaC1是最常用于增加離子強度的試劑(3)改變洗脫液的極性(4)變形洗脫劑在洗脫后必須立即除去變性劑，以避免其長時間的變性作用而使生物分子失活2．非專一性洗脫：(五)純化產物脫鹽(六)親和吸附劑的再生與貯存

三、注意事項1．溴化氰活化Sepharose4B的反應，最適pH是112．應絕對避免使用電磁攪拌，以免引起載體珠形結構的破壞3．應采取適當低的流速4．用極性pH進行洗脫時，為防止極性pH對生物分子活性的影響，每收集一管洗出液，即進行pH調整，使接近中性。5.對于結合弱的物質，可以待樣品進入膠柱后，關封出口，讓樣品在柱中停留一段時間（甚至過夜），使其能被充分結合(五)純化產物脫鹽專一性洗脫

專一性洗脫

優(yōu)點：特異性強，可以進一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率?？杀苊獾鞍踪|變性缺點：較常的時間、較大的洗脫條件。改善方法：選擇親和力強的物質洗脫、加大洗脫液濃度專一性洗脫優(yōu)點：專一性洗脫非專一性洗脫與配體親和力較小

連續(xù)大體積平衡緩沖液沖洗，不影響活性，但洗脫體積較大，待分離物質濃度較低。配體結合較強時

適當的pH、離子強度洗脫，注意盡量不影響待分離物質的活性與配體結合非常牢固時

使用較強的酸、堿或在洗脫液中加入脲、胍等變性劑，使蛋白質等待分離物質變性，洗脫后再復性非專一性洗脫與配體親和力較小(五)純化產物脫鹽洗脫所得的親和層析產物常含有鹽類等小分子物質，可經SephadexG-25柱層析