研究國人germlineAPC基因變異與罹患大腸癌之關(guān)系課件

APC、MGMT分子變異與國人大腸癌發(fā)生及預(yù)後之關(guān)係

演講者：陳錫秉11研究背景簡介2研究背景簡介2國人大腸癌發(fā)生率逐年攀升趨勢(Colorectalcancer,CRC)

大腸癌：84年國人發(fā)生率第5名的癌癥85年起升為第4名91年起再攀升為第3名92年起成為女性癌癥的第2名93年起成為男性癌癥的第2名新發(fā)生個(gè)案數(shù)從民國84年的4217人增加到94年的9604人，

(中華民國癌癥登記報(bào)告)3國人大腸癌發(fā)生率逐年攀升趨勢3大腸癌在所有癌癥中排名發(fā)生率排名死亡率排名男女男女國人2233

美國3333(中華民國94年癌癥登記報(bào)告,SiegelRetal.CACancerJClin2008)44國人大腸癌發(fā)生率成長曲線(中華民國行政院衛(wèi)生署公佈資料)5國人大腸癌發(fā)生率成長曲線5國人94年大腸結(jié)直腸癌發(fā)生與死亡資料

新發(fā)生粗發(fā)生率新死亡粗死亡率

個(gè)案數(shù)

(每10萬人)

個(gè)案數(shù)(每10萬人)全民960442.18411118.05男性549747.54242520.97

女性410736.64168615.04(中華民國94年癌癥登記報(bào)告)6國人94年大腸結(jié)直腸癌發(fā)生與死亡資料6散發(fā)性(sporadic)：約90%年老、男性、體重過重、高油低纖飲食、煙、酒、膽囊切除術(shù)、膽管腸道造廔術(shù)、女性動情激素、有腸道息肉病史、有結(jié)腸直腸癌病史、家族中有人罹大腸癌(不符合遺傳定律)危險(xiǎn)因子(WeitzJetal.Lancet2005)7散發(fā)性(sporadic)：約90%危險(xiǎn)因子(Weitz遺傳性(hereditary)：約10%FAP:1~2%HNPCC:5~10%其它:~1%Familialadenomatouspolyposis(FAP)家族性腺瘤息肉癥Hereditarynonpolyposiscolorectalcancers(HNPCC)遺傳非息肉性大腸癌(WeitzJetal.Lancet2005)8遺傳性(hereditary)：約10%FamilialFAPAPC基因突變HNPCCMMR基因突變Adenomatouspolyposiscoli(APC)gene大腸腺瘤息肉基因Mismatchrepair(MMR)genes修復(fù)DNA配對錯(cuò)誤的基因危險(xiǎn)因子(WeitzJetal.Lancet2005)9FAPAdenomatouspolyposiscoli約60~80%具有APC突變

FAPAPC突變表現(xiàn)度(penetrance)幾乎達(dá)100%HNPCCMMR突變表現(xiàn)度約70~85%(FearnheadNSetal.HumMolGenet2001)遺傳性散發(fā)性

後天產(chǎn)生的突變somaticmutation

與生俱來的突變germlinemutation10約60~80%具有APC突變FAPHNPCC(FearnhAPC在大腸癌發(fā)展過程所處地位正常上皮早期腺瘤中期腺瘤晚期腺瘤癌

Kras

Smad1,Smad2APC

p53

約15年11APC在大腸癌發(fā)展過程所處地位正常上皮早期腺瘤中期腺瘤晚期APC

基因簡介位置：染色體5q21-5q22基因長度：91067個(gè)鹼基對蛋白質(zhì)產(chǎn)物：2843個(gè)胺基酸,312kD

(NCBIOMIM*611731APCGENE)12APC基因簡介(NCBIOMIM*611731APC國外germlineAPC突變情形(FearnheadNSetal.HumMolGenet2001)13國外germlineAPC突變情形(Fearnhead國外somaticAPC突變情形(FearnheadNSetal.HumMolGenet2001)14國外somaticAPC突變情形(Fearnhead研究目標(biāo)一、研究國人germlineAPC基因變異與罹患大腸癌之關(guān)係。二、研究國人大腸癌病人somaticAPC基因變異與大腸癌用藥、預(yù)後存活之關(guān)係。15研究目標(biāo)15一、研究國人germlineAPC基因變異與罹患大腸癌之關(guān)係。1616研究設(shè)計(jì)疾病組跟對照組做比較研究，研究APC基因上的變異點(diǎn)在兩組人中分布差異。17研究設(shè)計(jì)17研究對象收案條件疾病組：經(jīng)慈濟(jì)及三軍總醫(yī)院大腸直腸科醫(yī)師確定診斷為大腸癌患者。對照組：經(jīng)大腸鏡檢查無發(fā)現(xiàn)大腸腫瘤者。

本研究最後共收受健康受檢者74人，大腸癌病人80人，從周邊靜脈抽取其全血做為研究檢體。並無特別排除者。18研究對象18臨床特質(zhì)對照組74人疾病組80人年紀(jì)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)54.3±10.161.5±12.0性別(男性數(shù)目/百分比)34/45.3%40/50%Dukes分期(數(shù)目/百分比)A8/10%B24/30%C38/47.5%D10/12.5%腫瘤位置(數(shù)目/百分比)近端16/20%遠(yuǎn)端26/32.5%直腸38/47.5%研究對象基本特質(zhì)/knowledge/describe1.asp19臨床特質(zhì)對照組74人疾病組80人年紀(jì)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)研究方法1.從檢體抽取出DNA2.進(jìn)行PCR(polymerasechainreaction)放大

APC全基因exons3.進(jìn)行dHPLC(denaturinghighperformanceliquidchromatography)篩檢4.以ABIPrism3100GeneticAnalyzer進(jìn)行定序5.定序資料使用PC作業(yè)系統(tǒng)BioEditv7.0.5(TomHall,2005)軟體比對6.統(tǒng)計(jì)資料分析20研究方法20ABI3100定序結(jié)果範(fàn)例21ABI3100定序結(jié)果範(fàn)例21Bioedit比對情形範(fàn)例22Bioedit比對情形範(fàn)例22結(jié)果23結(jié)果23所有發(fā)現(xiàn)的APC變異基因變異胺基酸變異變異類型基因變異胺基酸變異變異類型c.1050T>G不改變SNP未報(bào)告過c.4479G>A不改變SNPrs41115c.1378delGp.E460fs缺失未報(bào)告過c.4725A>G不改變SNP未報(bào)告過c.1458T>C不改變SNPrs2229992c.5034G>A不改變SNPrs42427c.1488A>T不改變SNPrs9282599c.5268T>G不改變SNPrs866006c.1635G>A不改變SNPrs351771c.5465A>Tp.D1822VSNPrs459552c.3374T>Cp.V1125A突變未報(bào)告過c.5880G>A不改變SNPrs465899c.3378C>Gp.S1126R突變未報(bào)告過fs:frameshift,轉(zhuǎn)譯框架移位24所有發(fā)現(xiàn)的APC變異基因變異胺基酸變異變異類型基因變異胺基酸甘胺酸GlycineG天冬醯胺酸AsparagineN丙胺酸AlanineA麩胺酸GlutamicacidE纈胺酸ValineV麩醯胺酸GlutamineQ白胺酸LeucineL離胺酸LysineK異白胺酸IsoleucineI精胺酸ArginineR苯丙胺酸PhenylalanineF絲胺酸SerineS

酪胺酸TyrosineY穌胺酸ThreonineT色胺酸TryptophanW甲硫胺酸MethionineM組胺酸HistidineH胱胺酸CysteineC天冬胺酸Asparticacid

D脯胺酸ProlineP25甘胺酸GlycineG天冬醯胺酸AsparagineN丙胺酸與國外germlineAPC變異比較圖(FearnheadNSetal.HumMolGenet2001)26與國外germlineAPC變異比較圖(Fearnhe兩組分佈有差異的APC變異基因變異胺基酸變異變異類型對照組疾病組pc.1458T>C不改變SNPrs2229992TT=2CC=41CT=31TT=5CC=62CT=130.0012c.4479G>A不改變SNPrs41115GG=2AA=49AG=23GG=0AA=69AG=110.0057c.5268T>G不改變SNPrs866006TT=7GG=44GT=23TT=0GG=63GT=170.0023c.5465A>Tp.D1822VSNPrs459552AA=64TT=0AT=10AA=78TT=0AT=20.014527兩組分佈有差異的APC變異基因胺基酸變異類型對照組疾病組pc基因變異OR(95%CI)p

c.1458T>CC(vs.T)1.78(0.99~3.19)0.054

c.4479G>AA(vs.G)2.89(1.37~6.07)0.005

c.5268T>GG(vs.T)2.70(1.44~5.06)0.002

c.5465A>TT(vs.A)0.18(0.04~0.81)0.026

基因變異對罹大腸癌之危險(xiǎn)對比值(OR)28基因變異對罹大腸癌之危險(xiǎn)對比值(OR)28變異點(diǎn)基因型OR(95%CI)p

c.1458T>CCC2.77(1.38~5.56)0.004

(vs.CT+CC)c.4479G>AAA3.20(1.44~7.11)0.004

(vs.AG+GG)c.5268T>GGG2.53(1.24~5.13)0.010

(vs.GT+GG)c.5465A>TAT0.16(0.03~0.78)0.023

(vs.AA)

不同基因型對罹大腸癌之危險(xiǎn)對比值(OR)29不同基因型對罹大腸癌之危險(xiǎn)對比值(OR)29在健康人與病人組之間分佈有顯著差異的變異點(diǎn)有c.1458T>C、c.4479G>A、c.5268T>G、c.5465A>T四點(diǎn)c.1458T>C、c.4479G>A、c.5268T>G較高罹癌危險(xiǎn)c.5465A>T較低罹癌危險(xiǎn)結(jié)果摘要30結(jié)果摘要30GermlineAPC基因的突變率在國人大腸癌患者中極低，有可能是因?yàn)闆]鎖定是FAP的患者，也可能是國人發(fā)生大腸癌的重要觸發(fā)基因是別的基因。從國人germlineAPC基因的突變率低與在這麼少的突變之中就發(fā)現(xiàn)5處國外未報(bào)告過的變異，可合理推論測人罹大腸癌的基因相關(guān)性：有國人特有的種族特異性。找出國人大腸癌特異基因值得進(jìn)一步的研究。討論31GermlineAPC基因的突變率在國人大腸癌患者中極低二、研究國人大腸癌病人somaticAPC基因變異與大腸癌用藥、預(yù)後存活之關(guān)係。3232研究設(shè)計(jì)取CRC病人大腸腫瘤組織，研究APC基因體突變(somaticmutation)對病人預(yù)後存活的關(guān)係，並取病人大腸正常組織做為APC基因變異之控制。33研究設(shè)計(jì)33研究對象收案條件經(jīng)慈濟(jì)與三軍總醫(yī)院大腸直腸科醫(yī)師確定診斷為大腸癌患者，並經(jīng)外科切除手術(shù)可取得大腸組織(正常與癌組織)者。本研究共收受117位病人，紀(jì)錄其診出大腸癌年紀(jì)、性別、腫瘤位置、腫瘤分化程度、癌癥分期、化療及放療情形。34研究對象34招募時(shí)間從2001年1月1日至2004年12月31日，追蹤觀察時(shí)間從受檢者接受外科切除手術(shù)開始，追蹤觀察至其死亡或2006年7月31日截止。研究對象之存活時(shí)間以Kaplan-Meier法處理與分析。失去聯(lián)絡(luò)者或至觀察截止日期2006年7月31日仍存活者視為censoredobservations，以censoreddata處理。35招募時(shí)間從2001年1月1日至2004年研究對象基本特質(zhì)臨床特質(zhì)病人117人年紀(jì)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)65.5±14.2性別(男性數(shù)目/百分比)65/55.6%Dukes分期(數(shù)目/百分比)A9/7.7%B49/41.9%C34/29.0%D25/21.4%腫瘤位置(數(shù)目/百分比)近端21/21.2%遠(yuǎn)端29/29.3%直腸49/49.5%36研究對象基本特質(zhì)臨床特質(zhì)病人117人年紀(jì)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)研究對象基本特質(zhì)臨床特質(zhì)病人117人分化程度(數(shù)目/百分比)良好8/7.4%中度85/78.7%不良15/13.9%存活追縱月數(shù)(中位數(shù)/全距)24.37/0.33~64.535-FU化療(數(shù)目/百分比)61/52.1%放射線治療(數(shù)目/百分比)25/21.4%37研究對象基本特質(zhì)臨床特質(zhì)病人117人分化程度(數(shù)目結(jié)果3838所有發(fā)現(xiàn)的APC變異基因變異胺基酸變異基因變異胺基酸變異c.634A>Tp.K212Xc.3374T>Cp.V1125Ac.904C>Tp.R302Xc.3493A>Tp.K1165Xc.1114A>Gp.N372Dc.3888delAp.A1296fsc.1452_1453insAAp.M485fsc.3899delAp.N1300fsc.1495C>Tp.R499Xc.3907C>Tp.Q1303Xc.2016_2017delTAp.H672fsc.3911_3915delTAGCAp.I1304fsc.2077A>Tp.K693Xc.3922A>Tp.K1308Xc.2804_2805insAp.Y935Xc.3925G>Tp.E1309Xc.2805_2806insTp.N936Xc.3926_3930delAAAGAp.E1309fsfs:閱讀框架移位X:轉(zhuǎn)譯終止42239所有發(fā)現(xiàn)的APC變異基因變異胺基酸變異基因變異胺基酸變異c.所有發(fā)現(xiàn)的APC變異基因變異胺基酸變異基因變異胺基酸變異c.3931_3932insAp.I1311fsc.4260delCp.P1420fsc.3937delAp.T1313fsc.4348C>Tp.R1450Xc.3951delAp.E1317fsc.4358delCp.P1453fsc.3964G>Tp.E1322Xc.4463T>Gp.L1488Xc.4037C>Ap.S1346Xc.4667_46688insCp.T1556fsc.4055T>Cp.V1352Ac.6367T>Cp.C2123Rc.4057G>Tp.E1353Xc.8128A>Cp.S2710Rc.4067C>Gp.S1356Xc.8332G>Tp.A2778Sc.4169_4170delTCp.V1390fs240所有發(fā)現(xiàn)的APC變異基因變異胺基酸變異基因變異胺基酸變異c.與國外somaticAPC變異比較圖(FearnheadNSetal.HumMolGenet2001)MCR:mutationclusterregion41與國外somaticAPC變異比較圖(FearnheaAPC突變與病人存活關(guān)係(Kaplan-Meier,全死因)時(shí)間(月數(shù))有突變△非死亡截止點(diǎn)無突變○非死亡截止點(diǎn)0102030405060701009080706050存活率(%)logranktestP=0.61242APC突變與病人存活關(guān)係(Kaplan-Meier,全死01020304050607010090807060時(shí)間(月數(shù))存活率(%)APC突變與病人存活關(guān)係(Kaplan-Meier,大腸癌死因)logranktestP=0.502有突變△非死亡截止點(diǎn)無突變○非死亡截止點(diǎn)4301020

Cox'sproportional-hazardsmodel各因子致死的危險(xiǎn)度使用Cox'sproportional-hazardsmodel分析。Hazard：存活者中下一瞬間死亡人數(shù)上一瞬間存活人數(shù)即存活者下一瞬間死亡機(jī)率(死亡趨勢)44Cox'sproportional-hazardsmoAPC突變：有突變=1,無突變=0H(t)/H0(t)=exp(β1*APC突變)

◎exp(β1*1)=exp(β1)=HazardRatio

☆exp(β1*0)=exp(0)=

1exp(β1)=2：任何時(shí)候有APC突變者的死亡趨勢是無APC突變者的2倍迴歸模式可如下表示：H(t)=H0(t)*exp(β1*基因突變+β2*性別+…)H(t)/H0(t)=exp(β1*基因突變+β2*性別+…)=HazardRatio45APC突變：有突變=1,無突變=045單因子Cox'sproportional-hazardsmodel分析全死因CRC死因HazardRatio(95%CI)pHazardRatio(95%CI)p男性1.389(0.674–2.8642)0.3731.420(0.644–3.130)0.385年紀(jì)1.028(0.999–1.057)0.0611.015(0.986–1.045)0.318腫瘤位置遠(yuǎn)端直腸0.618(0.251–1.520)1.710(0.807–3.624)0.2940.1610.585(0.219–1.560)1.575(0.707–3.509)0.2840.266癌癥分期2.654(1.718–4.098)<0.0013.053(1.866–4.995)<0.001APC突變1.222(0.562–2.656)0.6121.330(0.578–3.060)0.503化療0.715(0.351–1.458)0.3560.994(0.458–2.157)0.987放療1.027(0.442–2.388)0.9501.036(0.415–2.583)0.94046單因子Cox'sproportional-hazards多因子Cox'sproportional-hazardsmodel分析全死因CRC死因HazardRatio(95%CI)pHazardRatio(95%CI)p癌癥分期2.911(1.891–4.482)<0.0013.053(1.866–4.995)<0.001APC突變1.202(0.550–2.623)0.6451.330(0.578–3.060)0.483化療0.450(0.217–0.933)0.0320.994(0.458–2.157)0.22747多因子Cox'sproportional-hazardsAPC突變與5-FU化療交互作用全死因CRC死因HazardRatio(95%CI)pHazardRatio(95%CI)p癌癥分期2.993(1.946–4.604)<0.0013.369(2.062–5.507)<0.001化療0.268(0.109–0.656)0.0040.339(0.130–0.886)0.027APC突變0.513(0.146–1.801)0.2970.443(0.096–2.043)0.297APC突變+化療5.565(1.061–29.190)0.0426.920(1.061–45.132)0.04348APC突變與5-FU化療交互作用全死因CRC死因Hazar以APC有無突變分層分析全死因CRC死因有APC突變者(29人)HazardRatio(95%CI)pHazardRatio(95%CI)p癌癥分期2.196(1.039–4.644)0.0402.615(1.144–5.974)0.023化療1.502(0.364–6.196)0.5732.347(0.463–11.898)0.303無APC突變者(88人)癌癥分期3.253(1.919–5.512)<0.0013.648(1.978–6.728)<0.001化療0.257(0.105–0.627)0.0030.342(0.131-0.891)0.02849以APC有無突變分層分析全死因CRC死因有APC突變者(117位病人中在29人中發(fā)現(xiàn)29處嚴(yán)重(造成閱讀框架移位或轉(zhuǎn)譯終止)突變

這些突變對病人預(yù)後存活無直接顯著相關(guān)這些突變與5-FU化療對於病人預(yù)後存活有交互作用5-FU化療只降低無這些突變的病人的死亡趨勢結(jié)果摘要50結(jié)果摘要50討論5151SomaticAPC突變與5-FU化療的交互作用，這是首次發(fā)現(xiàn)並且會直接影響到病人臨床治療效果的重大發(fā)現(xiàn)。此研究是小樣本的探索性研究，尚未控制很多重要的影響因子，但這個(gè)顯異的結(jié)果值得進(jìn)一步招募更多參與者來做研究。參考此次初步研究結(jié)果，在往後的研究中，在招募參與者時(shí)，可先控制癌癥分期、腫瘤位置、大腸癌類型等變項(xiàng)，若參與者夠多，可再控制年紀(jì)與性別變項(xiàng)。52SomaticAPC突變與5-FU化療的交互作用，這此研究所發(fā)現(xiàn)的APC突變與5-FU化療的交互作用，其分子機(jī)制還不清楚，若能在眾多臨床研究上都確認(rèn)此結(jié)果，則可做實(shí)驗(yàn)室研究找出其分子機(jī)制。若能在眾多臨床研究上都確認(rèn)此結(jié)果，應(yīng)推廣到整個(gè)醫(yī)療體系上對於大腸癌患者的治療方針。我們建議對於考慮接受5-FU化療的大腸癌患者，宜先做APC基因檢測，無突變者再考慮是否進(jìn)行5-FU化療。53此研究所發(fā)現(xiàn)的APC突變與5-FU化療的交互作用，其此次研究除了得到無APC基因突變者，接受5-FU化療才有好效果的結(jié)論外，我們從研究結(jié)果應(yīng)可合理懷疑有APC基因突變者，接受5-FU化療可能比不受5-FU化療結(jié)果更差，但因分層後樣本數(shù)變小，使上述結(jié)果不顯著，在往後研究中宜注意此點(diǎn)。5454三、研究國人大腸癌病人somaticAPC與MGMT基因promoter甲基化與大腸癌用藥、預(yù)後存活之關(guān)係。5555甲基化(CH3)我們除了研究在APC基因本身的(genetic)變異之外，更考慮做基因外變異(epigenetic)中甲基化的研究。常發(fā)生在promoter區(qū)CpGisland的C上ATGCTCGTAGTAGTCGCGTAACH3CH3CH3

56甲基化(CH3)常發(fā)生在promoter區(qū)CpGiO-6-MethylguanineDNAmethyltransferase(MGMT)MGMT基因其它基因MGMT蛋白質(zhì)甲基化去甲基化57O-6-MethylguanineDNAmethyltrMGMT基因其它基因MGMT蛋白質(zhì)甲基化甲基化58MGMT基因其它基因MGMT蛋白質(zhì)甲基化甲基化58APC與MGMT甲基化相關(guān)研究報(bào)告

APC基因甲基化約在12%到39%。MGMT基因甲基化約在40%到50%。具有K-ras基因中鹼基G變A的變異者，MGMT基因甲基化程度高。基因甲基化，該組織蛋白質(zhì)表現(xiàn)度低。LinSYetal.OncolRep.2004ChenJetal.Carcinogenesis.2005ArnoldCNetal.CancerBiolTher.2004EstellerMetal.CancerRes.2001QiJetal.WorldJGastroenterol.2005ShenLetal.JNatlCancerInst.200559APC與MGMT甲基化相關(guān)研究報(bào)告LinSYeta研究目標(biāo)三、研究國人大腸癌病人somaticAPC與MGMT基因promoter甲基化與大腸癌用藥、預(yù)後存活之關(guān)係。60研究目標(biāo)60研究方法1.全DNA經(jīng)過bisulfite處理2.進(jìn)行MSP(methylationspecificPCR)放大

APC與MGMT基因promoter部份DNA片段3.進(jìn)行電泳並以ethidiumbromide染色並在UV光下呈色判讀M欄位有亮條：具有甲基化DNAU欄位有亮條：具有無甲基化DNA61研究方法M欄位有亮條：具有甲基化DNA61結(jié)果本研究結(jié)果已發(fā)表之報(bào)告

APC基因73/117人(62.4%)12%到39%LinSYetal.OncolRep.2004ChenJetal.Carcinogenesis.2005ArnoldCNetal.CancerBiolTher.2004

MGMT基因

71/117人(60.7%)

40%到50%

EstellerMetal.CancerRes.2001QiJetal.WorldJGastroenterol.2005ShenLetal.JNatlCancerInst.200562結(jié)果本研究結(jié)果已發(fā)表之報(bào)告APC基因73/117APC甲基化存活曲線圖(Kaplan-Meier,全死因)時(shí)間(月數(shù))有甲基化△非死亡截止點(diǎn)無甲基化○非死亡截止點(diǎn)0102030405060701009080706050存活率(%)logranktestP=0.01863APC甲基化存活曲線圖(Kaplan-Meier,全死因01020304050607010090807060時(shí)間(月數(shù))存活率(%)logranktestP=0.076有甲基化△非死亡截止點(diǎn)無甲基化○非死亡截止點(diǎn)APC甲基化存活曲線圖(Kaplan-Meier,大腸癌死因)640102001020304050607010090807060時(shí)間(月數(shù))存活率(%)logranktestP=0.982有甲基化△非死亡截止點(diǎn)無甲基化○非死亡截止點(diǎn)MGMT甲基化存活曲線圖(Kaplan-Meier,全死因)650102001020304050607010090807060時(shí)間(月數(shù))存活率(%)logranktestP=0.992有甲基化△非死亡截止點(diǎn)無甲基化○非死亡截止點(diǎn)MGMT甲基化存活曲線圖(Kaplan-Meier,大腸癌死因)6601020全死因CRC死因HazardRatio(95%CI)pHazardRatio(95%CI)p癌癥分期2.837(1.837–4.382)<0.0013.188(1.943–5.231)<0.001化療0.470(0.227–0.976)0.0430.622(0.281–1.376)0.241APC甲基化0.482(0.233–0.995)0.0480.542(0.247-1.190)0.127MGMT甲基化1.143(0.548–2.386)0.7211.162(0.520–2.598)0.714甲基化Cox'sproportional-hazardsmodel分析67全死因CRC死因HazardRatio(95%CI)全死因CRC死因無MGMT甲基化者(71人)HR(95%CI)pHR(95%CI)p癌癥分期2.585(1.467–4.553)0.0012.829(1.496–5.349)0.023APC甲基化0.593(0.234–1.500)0.2700.607(0.220–1.680)0.337化療0.657(0.250–1.729)0.3940.870(0.298–2.539)0.799無MGMT甲基化者(46人)APC甲基化0.277(0.073–1.051)0.0590.365(0.091–1.462)0.155癌癥分期3.250(1.567–5.743)0.0023.706(1.611–8.522)0.002化療0.210(0.058–0.766)0.0180.267(0.068-1.054)0.05968全死因CRC死因無MGMT甲基化者(71人)HR(95APC甲基化降低病人全死因死亡趨勢，對大腸癌死因而言則無顯著相關(guān)。MGMT甲基化不管是對全死因或大腸癌死因，都與病人的死亡趨勢無顯著相關(guān)。5-FU化學(xué)治療只降低無MGMT基因甲基化病人死亡趨勢。結(jié)果摘要69結(jié)果摘要69現(xiàn)APC基因promoter甲基化主要是抑制APC蛋白質(zhì)的表現(xiàn)：不影響5-FU化學(xué)治療的效果。APC基因無義或框架移位突變產(chǎn)生嚴(yán)重異常的APC蛋白質(zhì)：使5-FU化學(xué)治療較無效果。異常的APC蛋白質(zhì)比缺乏APC蛋白質(zhì)有更強(qiáng)烈的影響。APC蛋白質(zhì)產(chǎn)物不表現(xiàn)與造成APC蛋白質(zhì)異常這兩種不同性質(zhì)的分子變異宜分別分析。討論70現(xiàn)APC基因promoter甲基化主要是抑制APCGermlineAPC基因變異中c.1458T>C、c.4479G>A、c.5268T>G有較高罹癌危險(xiǎn)c.5465A>T有較低罹癌危險(xiǎn)。SomaticAPC基因無義或框架移位突變與5-FU化療對於病人預(yù)後存活有交互作用：5-FU化療只降低無這些突變的病人的死亡傾向。APC甲基化降低病人全死因死亡趨勢。5-FU化學(xué)治療只降低無MGMT基因甲基化病人死亡趨勢?？傉?1GermlineAPC基因變異中c.1458T>C、c樣本不夠大，缺乏對一些相關(guān)變項(xiàng)的控制，研究結(jié)果之外推性不佳，需進(jìn)一步更大樣本更佳研究設(shè)計(jì)來驗(yàn)證。未來可朝多醫(yī)療單位合作的研究，成立系統(tǒng)性聯(lián)合檢體收樣與保存中心，各種相關(guān)因素紀(jì)錄更加詳實(shí)，追蹤觀察時(shí)間可更長。更多其他癌癥、基因與治療之間的交互作用，都是值得整個(gè)相關(guān)醫(yī)療合作與研究。研究限制與改進(jìn)72樣本不夠大，缺乏對一些相關(guān)變項(xiàng)的控制，研究結(jié)果之外推性不佳，謝謝聆聽敬請指教7373中華民國行政院衛(wèi)生署官方網(wǎng)站.tw/cht2006/index_populace.aspx中華民國94年癌癥登記報(bào)告2007年12月發(fā)佈SiegelR,WardE,HaoY,XuJ,MurrayT,ThunMJ.Cancerstatistics,2008.CACancerJClin.2008Mar-Apr;58(2):71-96.WeitzJ,KochM,DebusJ,etal.ColorectalcancerLancet2005;365:153-653.FearnheadNS,BrittonMP,BodmerWF.TheABCofAPC.HumMolGenet2001;10:721-33.NarayanS,RoyD.RoleofAPCandDNAmismatchrepairgenesinthedevelopmentofcolorectalcancers.MolCancer.2003Dec12;2:41.ReyaT,CleversH.Wntsignallinginstemcellsandcancer.Nature.2005Apr14;434(7035):843-50.N?thkeI.Cytoskeletonoutofthecupboard:coloncancerandcytoskeletalchangesinducedbylossofAPC.NatRevCancer.2006Dec;6(12):967-74.Reference74中華民國行政院衛(wèi)生署官方網(wǎng)站http://www.dohLinSYetal.PromoterCpGmethylationoftumorsuppressorgenesincolorectalcanceranditsrelationshiptoclinicalfeatures.OncolRep.2004Feb;11(2):341-8.ChenJetal.MolecularanalysisofAPCpromotermethylationandproteinexpressionincolorectalcancermetastasis.Carcinogenesis.2005Jan;26(1):37-43.ArnoldCNetal.APCpromoterhypermethylationcontributestothelossofAPCexpressionincolorectalcancerswithalleliclosson5q.CancerBiolTher.2004Oct;3(10):960-4EstellerMetal.PromoterhypermethylationoftheDNArepairgeneO(6)-methylguanine-DNAmethyltransferaseisassociatedwiththepresenceofG:CtoA:Ttransitionmutationsinp53inhumancolorectaltumorigenesis.CancerRes.2001Jun15;61(12):4689-92.QiJ,ZhuYQ,HuangMF,YangD.HypermethylationofCpGislandinO6-methylguanine-DNAmethyltransferasegenewasassociatedwithK-rasGtoAmutationincolorectaltumor.WorldJGastroenterol.2005Apr7;11(13):2022-5ShenLetal.MGMTpromotermethylationandfielddefectinsporadiccolorectalcancer.JNatlCancerInst.2005Sep21;97(18):1330-8.7575APC、MGMT分子變異與國人大腸癌發(fā)生及預(yù)後之關(guān)係

演講者：陳錫秉761研究背景簡介77研究背景簡介2國人大腸癌發(fā)生率逐年攀升趨勢(Colorectalcancer,CRC)

大腸癌：84年國人發(fā)生率第5名的癌癥85年起升為第4名91年起再攀升為第3名92年起成為女性癌癥的第2名93年起成為男性癌癥的第2名新發(fā)生個(gè)案數(shù)從民國84年的4217人增加到94年的9604人，

(中華民國癌癥登記報(bào)告)78國人大腸癌發(fā)生率逐年攀升趨勢3大腸癌在所有癌癥中排名發(fā)生率排名死亡率排名男女男女國人2233

美國3333(中華民國94年癌癥登記報(bào)告,SiegelRetal.CACancerJClin2008)794國人大腸癌發(fā)生率成長曲線(中華民國行政院衛(wèi)生署公佈資料)80國人大腸癌發(fā)生率成長曲線5國人94年大腸結(jié)直腸癌發(fā)生與死亡資料

新發(fā)生粗發(fā)生率新死亡粗死亡率

個(gè)案數(shù)

(每10萬人)

個(gè)案數(shù)(每10萬人)全民960442.18411118.05男性549747.54242520.97

女性410736.64168615.04(中華民國94年癌癥登記報(bào)告)81國人94年大腸結(jié)直腸癌發(fā)生與死亡資料6散發(fā)性(sporadic)：約90%年老、男性、體重過重、高油低纖飲食、煙、酒、膽囊切除術(shù)、膽管腸道造廔術(shù)、女性動情激素、有腸道息肉病史、有結(jié)腸直腸癌病史、家族中有人罹大腸癌(不符合遺傳定律)危險(xiǎn)因子(WeitzJetal.Lancet2005)82散發(fā)性(sporadic)：約90%危險(xiǎn)因子(Weitz遺傳性(hereditary)：約10%FAP:1~2%HNPCC:5~10%其它:~1%Familialadenomatouspolyposis(FAP)家族性腺瘤息肉癥Hereditarynonpolyposiscolorectalcancers(HNPCC)遺傳非息肉性大腸癌(WeitzJetal.Lancet2005)83遺傳性(hereditary)：約10%FamilialFAPAPC基因突變HNPCCMMR基因突變Adenomatouspolyposiscoli(APC)gene大腸腺瘤息肉基因Mismatchrepair(MMR)genes修復(fù)DNA配對錯(cuò)誤的基因危險(xiǎn)因子(WeitzJetal.Lancet2005)84FAPAdenomatouspolyposiscoli約60~80%具有APC突變

FAPAPC突變表現(xiàn)度(penetrance)幾乎達(dá)100%HNPCCMMR突變表現(xiàn)度約70~85%(FearnheadNSetal.HumMolGenet2001)遺傳性散發(fā)性

後天產(chǎn)生的突變somaticmutation

與生俱來的突變germlinemutation85約60~80%具有APC突變FAPHNPCC(FearnhAPC在大腸癌發(fā)展過程所處地位正常上皮早期腺瘤中期腺瘤晚期腺瘤癌

Kras

Smad1,Smad2APC

p53

約15年86APC在大腸癌發(fā)展過程所處地位正常上皮早期腺瘤中期腺瘤晚期APC

基因簡介位置：染色體5q21-5q22基因長度：91067個(gè)鹼基對蛋白質(zhì)產(chǎn)物：2843個(gè)胺基酸,312kD

(NCBIOMIM*611731APCGENE)87APC基因簡介(NCBIOMIM*611731APC國外germlineAPC突變情形(FearnheadNSetal.HumMolGenet2001)88國外germlineAPC突變情形(Fearnhead國外somaticAPC突變情形(FearnheadNSetal.HumMolGenet2001)89國外somaticAPC突變情形(Fearnhead研究目標(biāo)一、研究國人germlineAPC基因變異與罹患大腸癌之關(guān)係。二、研究國人大腸癌病人somaticAPC基因變異與大腸癌用藥、預(yù)後存活之關(guān)係。90研究目標(biāo)15一、研究國人germlineAPC基因變異與罹患大腸癌之關(guān)係。9116研究設(shè)計(jì)疾病組跟對照組做比較研究，研究APC基因上的變異點(diǎn)在兩組人中分布差異。92研究設(shè)計(jì)17研究對象收案條件疾病組：經(jīng)慈濟(jì)及三軍總醫(yī)院大腸直腸科醫(yī)師確定診斷為大腸癌患者。對照組：經(jīng)大腸鏡檢查無發(fā)現(xiàn)大腸腫瘤者。

本研究最後共收受健康受檢者74人，大腸癌病人80人，從周邊靜脈抽取其全血做為研究檢體。並無特別排除者。93研究對象18臨床特質(zhì)對照組74人疾病組80人年紀(jì)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)54.3±10.161.5±12.0性別(男性數(shù)目/百分比)34/45.3%40/50%Dukes分期(數(shù)目/百分比)A8/10%B24/30%C38/47.5%D10/12.5%腫瘤位置(數(shù)目/百分比)近端16/20%遠(yuǎn)端26/32.5%直腸38/47.5%研究對象基本特質(zhì)/knowledge/describe1.asp94臨床特質(zhì)對照組74人疾病組80人年紀(jì)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)研究方法1.從檢體抽取出DNA2.進(jìn)行PCR(polymerasechainreaction)放大

APC全基因exons3.進(jìn)行dHPLC(denaturinghighperformanceliquidchromatography)篩檢4.以ABIPrism3100GeneticAnalyzer進(jìn)行定序5.定序資料使用PC作業(yè)系統(tǒng)BioEditv7.0.5(TomHall,2005)軟體比對6.統(tǒng)計(jì)資料分析95研究方法20ABI3100定序結(jié)果範(fàn)例96ABI3100定序結(jié)果範(fàn)例21Bioedit比對情形範(fàn)例97Bioedit比對情形範(fàn)例22結(jié)果98結(jié)果23所有發(fā)現(xiàn)的APC變異基因變異胺基酸變異變異類型基因變異胺基酸變異變異類型c.1050T>G不改變SNP未報(bào)告過c.4479G>A不改變SNPrs41115c.1378delGp.E460fs缺失未報(bào)告過c.4725A>G不改變SNP未報(bào)告過c.1458T>C不改變SNPrs2229992c.5034G>A不改變SNPrs42427c.1488A>T不改變SNPrs9282599c.5268T>G不改變SNPrs866006c.1635G>A不改變SNPrs351771c.5465A>Tp.D1822VSNPrs459552c.3374T>Cp.V1125A突變未報(bào)告過c.5880G>A不改變SNPrs465899c.3378C>Gp.S1126R突變未報(bào)告過fs:frameshift,轉(zhuǎn)譯框架移位99所有發(fā)現(xiàn)的APC變異基因變異胺基酸變異變異類型基因變異胺基酸甘胺酸GlycineG天冬醯胺酸AsparagineN丙胺酸AlanineA麩胺酸GlutamicacidE纈胺酸ValineV麩醯胺酸GlutamineQ白胺酸LeucineL離胺酸LysineK異白胺酸IsoleucineI精胺酸ArginineR苯丙胺酸PhenylalanineF絲胺酸SerineS

酪胺酸TyrosineY穌胺酸ThreonineT色胺酸TryptophanW甲硫胺酸MethionineM組胺酸HistidineH胱胺酸CysteineC天冬胺酸Asparticacid

D脯胺酸ProlineP100甘胺酸GlycineG天冬醯胺酸AsparagineN丙胺酸與國外germlineAPC變異比較圖(FearnheadNSetal.HumMolGenet2001)101與國外germlineAPC變異比較圖(Fearnhe兩組分佈有差異的APC變異基因變異胺基酸變異變異類型對照組疾病組pc.1458T>C不改變SNPrs2229992TT=2CC=41CT=31TT=5CC=62CT=130.0012c.4479G>A不改變SNPrs41115GG=2AA=49AG=23GG=0AA=69AG=110.0057c.5268T>G不改變SNPrs866006TT=7GG=44GT=23TT=0GG=63GT=170.0023c.5465A>Tp.D1822VSNPrs459552AA=64TT=0AT=10AA=78TT=0AT=20.0145102兩組分佈有差異的APC變異基因胺基酸變異類型對照組疾病組pc基因變異OR(95%CI)p

c.1458T>CC(vs.T)1.78(0.99~3.19)0.054

c.4479G>AA(vs.G)2.89(1.37~6.07)0.005

c.5268T>GG(vs.T)2.70(1.44~5.06)0.002

c.5465A>TT(vs.A)0.18(0.04~0.81)0.026

基因變異對罹大腸癌之危險(xiǎn)對比值(OR)103基因變異對罹大腸癌之危險(xiǎn)對比值(OR)28變異點(diǎn)基因型OR(95%CI)p

c.1458T>CCC2.77(1.38~5.56)0.004

(vs.CT+CC)c.4479G>AAA3.20(1.44~7.11)0.004

(vs.AG+GG)c.5268T>GGG2.53(1.24~5.13)0.010

(vs.GT+GG)c.5465A>TAT0.16(0.03~0.78)0.023

(vs.AA)

不同基因型對罹大腸癌之危險(xiǎn)對比值(OR)104不同基因型對罹大腸癌之危險(xiǎn)對比值(OR)29在健康人與病人組之間分佈有顯著差異的變異點(diǎn)有c.1458T>C、c.4479G>A、c.5268T>G、c.5465A>T四點(diǎn)c.1458T>C、c.4479G>A、c.5268T>G較高罹癌危險(xiǎn)c.5465A>T較低罹癌危險(xiǎn)結(jié)果摘要105結(jié)果摘要30GermlineAPC基因的突變率在國人大腸癌患者中極低，有可能是因?yàn)闆]鎖定是FAP的患者，也可能是國人發(fā)生大腸癌的重要觸發(fā)基因是別的基因。從國人germlineAPC基因的突變率低與在這麼少的突變之中就發(fā)現(xiàn)5處國外未報(bào)告過的變異，可合理推論測人罹大腸癌的基因相關(guān)性：有國人特有的種族特異性。找出國人大腸癌特異基因值得進(jìn)一步的研究。討論106GermlineAPC基因的突變率在國人大腸癌患者中極低二、研究國人大腸癌病人somaticAPC基因變異與大腸癌用藥、預(yù)後存活之關(guān)係。10732研究設(shè)計(jì)取CRC病人大腸腫瘤組織，研究APC基因體突變(somaticmutation)對病人預(yù)後存活的關(guān)係，並取病人大腸正常組織做為APC基因變異之控制。108研究設(shè)計(jì)33研究對象收案條件經(jīng)慈濟(jì)與三軍總醫(yī)院大腸直腸科醫(yī)師確定診斷為大腸癌患者，並經(jīng)外科切除手術(shù)可取得大腸組織(正常與癌組織)者。本研究共收受117位病人，紀(jì)錄其診出大腸癌年紀(jì)、性別、腫瘤位置、腫瘤分化程度、癌癥分期、化療及放療情形。109研究對象34招募時(shí)間從2001年1月1日至2004年12月31日，追蹤觀察時(shí)間從受檢者接受外科切除手術(shù)開始，追蹤觀察至其死亡或2006年7月31日截止。研究對象之存活時(shí)間以Kaplan-Meier法處理與分析。失去聯(lián)絡(luò)者或至觀察截止日期2006年7月31日仍存活者視為censoredobservations，以censoreddata處理。110招募時(shí)間從2001年1月1日至2004年研究對象基本特質(zhì)臨床特質(zhì)病人117人年紀(jì)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)65.5±14.2性別(男性數(shù)目/百分比)65/55.6%Dukes分期(數(shù)目/百分比)A9/7.7%B49/41.9%C34/29.0%D25/21.4%腫瘤位置(數(shù)目/百分比)近端21/21.2%遠(yuǎn)端29/29.3%直腸49/49.5%111研究對象基本特質(zhì)臨床特質(zhì)病人117人年紀(jì)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)研究對象基本特質(zhì)臨床特質(zhì)病人117人分化程度(數(shù)目/百分比)良好8/7.4%中度85/78.7%不良15/13.9%存活追縱月數(shù)(中位數(shù)/全距)24.37/0.33~64.535-FU化療(數(shù)目/百分比)61/52.1%放射線治療(數(shù)目/百分比)25/21.4%112研究對象基本特質(zhì)臨床特質(zhì)病人117人分化程度(數(shù)目結(jié)果11338所有發(fā)現(xiàn)的APC變異基因變異胺基酸變異基因變異胺基酸變異c.634A>Tp.K212Xc.3374T>Cp.V1125Ac.904C>Tp.R302Xc.3493A>Tp.K1165Xc.1114A>Gp.N372Dc.3888delAp.A1296fsc.1452_1453insAAp.M485fsc.3899delAp.N1300fsc.1495C>Tp.R499Xc.3907C>Tp.Q1303Xc.2016_2017delTAp.H672fsc.3911_3915delTAGCAp.I1304fsc.2077A>Tp.K693Xc.3922A>Tp.K1308Xc.2804_2805insAp.Y935Xc.3925G>Tp.E1309Xc.2805_2806insTp.N936Xc.3926_3930delAAAGAp.E1309fsfs:閱讀框架移位X:轉(zhuǎn)譯終止422114所有發(fā)現(xiàn)的APC變異基因變異胺基酸變異基因變異胺基酸變異c.所有發(fā)現(xiàn)的APC變異基因變異胺基酸變異基因變異胺基酸變異c.3931_3932insAp.I1311fsc.4260delCp.P1420fsc.3937delAp.T1313fsc.4348C>Tp.R1450Xc.3951delAp.E1317fsc.4358delCp.P1453fsc.3964G>Tp.E1322Xc.4463T>Gp.L1488Xc.4037C>Ap.S1346Xc.4667_46688insCp.T1556fsc.4055T>Cp.V1352Ac.6367T>Cp.C2123Rc.4057G>Tp.E1353Xc.8128A>Cp.S2710Rc.4067C>Gp.S1356Xc.8332G>Tp.A2778Sc.4169_4170delTCp.V1390fs2115所有發(fā)現(xiàn)的APC變異基因變異胺基酸變異基因變異胺基酸變異c.與國外somaticAPC變異比較圖(FearnheadNSetal.HumMolGenet2001)MCR:mutationclusterregion116與國外somaticAPC變異比較圖(FearnheaAPC突變與病人存活關(guān)係(Kaplan-Meier,全死因)時(shí)間(月數(shù))有突變△非死亡截止點(diǎn)無突變○非死亡截止點(diǎn)0102030405060701009080706050存活率(%)logranktestP=0.612117APC突變與病人存活關(guān)係(Kaplan-Meier,全死01020304050607010090807060時(shí)間(月數(shù))存活率(%)APC突變與病人存活關(guān)係(Kaplan-Meier,大腸癌死因)logranktestP=0.502有突變△非死亡截止點(diǎn)無突變○非死亡截止點(diǎn)11801020

Cox'sproportional-hazardsmodel各因子致死的危險(xiǎn)度使用Cox'sproportional-hazardsmodel分析。Hazard：存活者中下一瞬間死亡人數(shù)上一瞬間存活人數(shù)即存活者下一瞬間死亡機(jī)率(死亡趨勢)119Cox'sproportional-hazardsmoAPC突變：有突變=1,無突變=0H(t)/H0(t)=exp(β1*APC突變)

◎exp(β1*1)=exp(β1)=HazardRatio

☆exp(β1*0)=exp(0)=

1exp(β1)=2：任何時(shí)候有APC突變者的死亡趨勢是無APC突變者的2倍迴歸模式可如下表示：H(t)=H0(t)*exp(β1*基因突變+β2*性別+…)H(t)/H0(t)=exp(β1*基因突變+β2*性別+…)=HazardRatio120APC突變：有突變=1,無突變=045單因子Cox'sproportional-hazardsmodel分析全死因CRC死因HazardRatio(95%CI)pHazardRatio(95%CI)p男性1.389(0.674–2.8642)0.3731.420(0.644–3.130)0.385年紀(jì)1.028(0.999–1.057)0.0611.015(0.986–1.045)0.318腫瘤位置遠(yuǎn)端直腸0.618(0.251–1.520)1.710(0.807–3.624)0.2940.1610.585(0.219–1.560)1.575(0.707–3.509)0.2840.266癌癥分期2.654(1.718–4.098)<0.0013.053(1.866–4.995)<0.001APC突變1.222(0.562–2.656