酶聯(lián)免疫ELISA課件

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA

郝丹1.ELISA的原理2.ELISA的類型3.ELISA的具體操作主要內(nèi)容

ELISA是一種免疫測(cè)定，基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。1.ELISA的原理1.1抗原抗體反應(yīng)1.1.1可逆性

抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab

抗體的親和力,可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab

的解離程度與K值有關(guān)。

高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。1.1.2特異性

抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。

測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。

1.1.3最適比例

1.1.4敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平；酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10μg/ml；標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平；例如，HBsAg（乙型肝炎表面抗原），其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。

可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。

固相載體抗體抗原酶抗體酶標(biāo)記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗原，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標(biāo)記抗原復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。酶抗原酶標(biāo)記抗原抗體抗原固相載體2.3間接法測(cè)抗體

用于傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。酶抗抗體酶標(biāo)記抗抗體抗體抗原固相載體1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗抗體，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標(biāo)記抗抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。2.4競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。

2.5競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原

小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。

2.6捕獲包被法測(cè)抗體

IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。酶抗體酶標(biāo)記抗體抗原抗抗體固相載體抗體1.將抗抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗體復(fù)合物。3.加入抗原及酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。3ELISA具體操作1標(biāo)本的收集和保存2試劑的準(zhǔn)備3加樣本及反應(yīng)試劑4溫育5洗板6顯色7比色8結(jié)果判斷3.1標(biāo)本的收集和保存未抗凝血標(biāo)本離心前一般令其自行凝集，不可用木棍等剝離凝血塊。通常于室溫（20－25℃）放置30－60min，血標(biāo)本可自發(fā)完全凝集，析出血清；或37℃水浴20－30min，析出血清。以3000r/min轉(zhuǎn)速離心5－10min，使血清分離完全。若過早離心，分離不全，血清中會(huì)殘留部分纖維蛋白原，吸附于反應(yīng)微孔，并且不易洗去，可與酶標(biāo)記物非特異性結(jié)合，造成假陽(yáng)性。

注意：（2）血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)，要注意盡量避免細(xì)菌污染。血清標(biāo)本如在冰箱中保存過久，IgG可發(fā)生聚合，AFP可形成二聚體，使本底加深，產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。細(xì)菌生長(zhǎng)所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶可對(duì)以相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。注意:（3）冰凍保存的標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍結(jié)樣本溶解后，蛋白質(zhì)局部濃縮、分布不均，應(yīng)上下顛倒輕緩混勻，避免氣泡，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰凍保存。3.2試劑的準(zhǔn)備試劑盒成分：常用的固相載體（ELISA板孔）材質(zhì)：聚苯乙烯、聚氯乙烯，具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值底，各板之間、同一板各孔之間性能相近。包被抗原或抗體與聚苯乙烯固相載體通過疏水基團(tuán)作用物理吸附結(jié)合。常用的酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。洗液：非離子型洗滌劑酶反應(yīng)的底物：H2O2，為受氫體；顯色劑：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS（一種銨鹽），為供氫體。終止液為硫酸。3.3加樣本及反應(yīng)試劑在ELISA實(shí)驗(yàn)中一般有3次加樣步驟，即加標(biāo)本、加酶結(jié)合物、加底物和顯色劑。加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：（1）加樣不可太快，避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。如有氣泡，抗原抗體不能有效結(jié)合，導(dǎo)致弱陽(yáng)性甚至假陰性。（2）每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸頭，以免發(fā)生交叉污染。若需稀釋血清，應(yīng)保證稀釋液與血清混合均勻。（3）加酶結(jié)合物、加底物，加液量應(yīng)準(zhǔn)確均一、加液過程迅速。可用試劑盒提供的滴瓶直接滴加。滴加時(shí)，除要注意滴加的角度垂直一致外，滴加速度也很重要。太快，易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象。3.4溫育溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA屬于固相免疫測(cè)定，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異性抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。一般溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，所需時(shí)間相對(duì)較短。最為常用的溫度有37℃和室溫(20－25℃)，其次是43℃和2－8℃，目前國(guó)內(nèi)ELISA商品試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間通常為37℃

30－60分鐘。

關(guān)于溫育，在實(shí)際測(cè)定操作中一定要注意以下幾點(diǎn)：（1）要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間。一般來(lái)說(shuō)，加完樣本或反應(yīng)試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時(shí)間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時(shí)間可能比較長(zhǎng)，而在臨床實(shí)驗(yàn)中，很少有人注意這個(gè)問題，通常將微孔板一放入溫箱即開始計(jì)時(shí)，這樣就很容易造成在實(shí)際測(cè)定中溫育時(shí)間不夠，弱陽(yáng)性樣本測(cè)不出來(lái)的問題。為保證37℃下足夠的溫育時(shí)間，實(shí)驗(yàn)室水浴狀態(tài)應(yīng)保證微孔板底貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)貼片或封蓋。（2）溫育溫度的選擇。在有的ELISA試劑盒的說(shuō)明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1小時(shí)，另一種則為43℃下45分鐘。從免疫測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的本質(zhì)來(lái)看，在較低的溫度下反應(yīng)較長(zhǎng)的時(shí)間最為完全，產(chǎn)物最穩(wěn)定。如2－8℃下反應(yīng)24小時(shí)。較高的反應(yīng)溫度，由于分子運(yùn)動(dòng)的加快，反應(yīng)時(shí)間縮短，這一點(diǎn)對(duì)分子含量較多的強(qiáng)陽(yáng)性樣本測(cè)定沒有問題，但對(duì)分子含量少的弱陽(yáng)性樣本則有漏檢的可能。因此，如須選擇反應(yīng)條件，建議在臨床ELISA測(cè)定中盡量使用較低溫度較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的條件。（3）“邊緣效應(yīng)”的排除。以前在使用96孔板的ELISA測(cè)定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫置于37℃溫箱(非水浴)，板孔升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。而將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，可使溫度迅速平衡。讓反應(yīng)板飄浮在水面上。就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測(cè)定的重復(fù)性。3.5洗板洗滌在ELISA不是反應(yīng)步驟，但也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELISA是靠洗滌清除殘留在板孔中沒能與固相抗體/原結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)，以保證ELISA測(cè)定的特異性。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。實(shí)驗(yàn)室中，洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機(jī)洗板。為保證微孔板的均一性使結(jié)果準(zhǔn)確可靠，最好選用洗板機(jī)洗板。若手工洗板，要注意浸泡時(shí)間和孔間洗液最好不要互相流動(dòng)。流水沖洗法讓水流沖擊板孔表面，簡(jiǎn)便、快速，洗滌效果較好。

3.6顯色在以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中，一般顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15－30分鐘。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。TMB(四甲基聯(lián)苯胺)經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后可完全消退至無(wú)色。TMB的終止液有多種，酸性終止液（硫酸）會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（450nm）測(cè)讀吸光值。底物A（含過氧化氫）底物B（含四甲基聯(lián)苯胺）終止液（含硫酸）雖然成分相同，但說(shuō)明書上未提供其具體成分含量比例，所以不可以通用。3.7比色

ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行。強(qiáng)調(diào)以下幾點(diǎn)：（1）酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，室溫宜在15－30℃，使用前先預(yù)熱儀器15－30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。各種酶標(biāo)儀性能不同，使用前應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書。（2）比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入比色架中，以免銹蝕酶標(biāo)儀比色架。（3）比色測(cè)定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。（4）單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇的問題。所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)；雙波長(zhǎng)比色則在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定一次，最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非敏感波長(zhǎng)下的吸光度值的差值。因此，雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微孔板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異性吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色干擾的優(yōu)點(diǎn)。3.8結(jié)果判斷臨床ELISA測(cè)定按其表示測(cè)定結(jié)果的方式分為定性和定量測(cè)定兩大類。定性測(cè)定只是對(duì)標(biāo)本中是否含有待測(cè)抗原或抗體作出“有”或“無(wú)”的結(jié)論，分別用“陽(yáng)性”和“陰性”來(lái)表示；定量測(cè)定，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。一、加樣槍的使用1.

樣品準(zhǔn)備（1）吸樣之前要保證移液槍、槍頭和液體處于相同溫度。置于冰箱保存的樣品應(yīng)提前取出，室溫放置，使溫度平衡后再吸樣。液體溫度>吸頭溫度的移取的液體體積會(huì)偏大液體溫度<吸頭溫度的移取的液體體積會(huì)偏?。?）

若溶劑瓶中液體太少，可倒入EP管中，方便吸取。

2.體積設(shè)定大體積小體積逆時(shí)針精度最佳小體積大體積順時(shí)針調(diào)至超過設(shè)定刻度，再回調(diào)

可保證最佳的精確度嚴(yán)格的精確調(diào)節(jié)方法3.

裝槍頭

將移液槍端垂直插入吸頭，左右微微轉(zhuǎn)動(dòng)，上緊即可上下敲擊會(huì)引起內(nèi)部的零部件因瞬間強(qiáng)烈撞擊而松散，甚至?xí)?dǎo)致調(diào)節(jié)刻度的旋鈕卡住4.

吸液（1）

垂直吸液，槍頭吸嘴尖端需浸入液面2-4mm以下。（2）

槍頭吸嘴預(yù)潤(rùn)濕（2-3次），使吸嘴內(nèi)壁液體吸附達(dá)到飽和，再吸入樣液，最后打出液體的體積會(huì)很精確。一般液體，正向吸液（一檔二檔）。粘稠液體和易揮發(fā)液體，可反相吸液（二檔一檔）。正向吸液反向吸液（3）

緩慢吸取，控制好彈簧的伸縮速度。吸液速度太快會(huì)產(chǎn)生反沖和氣泡，導(dǎo)致移液體積不準(zhǔn)確和腐蝕槍體。（4）

吸取后將移液槍提離液面，停約一秒鐘，觀察是否有液滴緩慢地流出。若有流出，說(shuō)明有漏氣現(xiàn)象（原因有：槍頭未上緊；槍頭不匹配；移液槍內(nèi)部氣密性不好）。（5）吸嘴外壁殘留液滴可沿壁靠去或用濾紙蘸擦。5.

放液（1）

將吸嘴口貼到容器內(nèi)壁并保持10-40°傾斜。（2）

平穩(wěn)地把按鈕壓到一檔，停約一秒鐘二檔，排出剩余液體。排放致密或粘稠液體時(shí)，壓到一檔后，再多等一兩秒鐘二檔。（3）

壓住按鈕，同時(shí)提起移液器，使吸嘴貼容器壁擦過。（4）

松開按鈕。（5）

按彈射器除去移液嘴。（6）使用完畢。加樣槍的養(yǎng)護(hù)及注意事項(xiàng)吸取液體時(shí)一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，絕不允許突然松開，以防溶液吸入過快而沖入槍體內(nèi)腐蝕柱塞造成漏氣。移液槍應(yīng)輕拿輕放，不能將已吸有液體的移液槍平放或倒置，以免液體倒流腐蝕活塞彈簧。不得用移