生物制品分析概論

第十三章生物制品分析概論

基本要求概述質(zhì)量檢驗的基本程序與方法常用定量分析方法及其應用

練習與思考

返回主目錄基本要求

1．掌握本類藥物質(zhì)量檢驗的基本程序與方法類型。2．掌握HPLC法和酶活力測定法在本類藥物測定中的應用。3．熟悉本類藥物的范圍、種類、質(zhì)量控制的要點。4．了解本類藥物含量測定的其他方法。返回一、防病、治病的三大藥源化學藥物、生物藥物、中藥

第一節(jié)概述BiopharmaceuticsorBiopharmaceuticals二、生物藥物的定義利用生物體、生物組織或組成生物體的各種成分，綜合利用生物學、微生物學、免疫學、物理化學和藥學的原理與方法制得的藥物。廣義的生物藥物：天然活性生物物質(zhì)、人工合成或半合成的天然物質(zhì)類似物。三、生物藥物的發(fā)展第一代：利用生物材料加工制成的含有某些天然活性成分物質(zhì)與混合成分的粗提物制劑；垂體后葉粉及其注射液甲狀腺粉及其片劑胰酶及其腸溶片、腸溶膠囊三、生物藥物的發(fā)展第二代：根據(jù)生物化學和免疫學原理，應用近代生化分離純化技術從生物體制取的具有針對性治療作用的特異生化成分；尿激酶、肝素鈉、胰島素人血白蛋白、人免疫球蛋白三、生物藥物的發(fā)展第三代：應用生物工程技術生產(chǎn)的天然生理活性物質(zhì)，以及通過蛋白質(zhì)工程原理設計制造的具有比天然物質(zhì)更高活性的類似物，或與天然物質(zhì)結構不同的全新的藥理活性成分。重組人生長激素、重組人IL-2四、生物藥物的分類生化藥物生物合成藥物生物制品

1．生化藥物：

例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。

甘氨酸、丙氨酸五肽胃泌素硫酸魚精蛋白門冬酰胺酶、輔酶Q102.生物合成藥物由微生物代謝所生成的藥物利用微生物及其酶轉(zhuǎn)化反應共同完成的半合成藥物山梨醇木糖醇甘露醇枸櫞酸抗生素3.生物制品以微生物、細胞、動物或人源組織和體液等為原料，應用傳統(tǒng)技術或現(xiàn)代生物技術制成。疫苗抗病毒及抗血清血液制品重組DNA制品診斷制品等疫苗類藥物用病毒或立克次體接種于動物、雞胚，或經(jīng)組織培養(yǎng)后加以處理制造而成。細菌類疫苗病毒類疫苗聯(lián)合疫苗雙價疫苗及多價疫苗抗病毒及抗血清類藥物抗病毒：用細菌類毒素或毒素免疫馬或其他大動物所取得的免疫血清抗菌（抗病毒）血清：用細菌或毒素本身免疫馬或其他大動物所取得的免疫血清抗體被動免疫制劑血液制品由健康人的血液或經(jīng)特異免疫的人血漿，經(jīng)分離、提純或由重組DNA技術制成的血漿蛋白組分，以及血液細胞有形成分。主要用于臨床治療和被動免疫預防人血白蛋白、人免疫球蛋白等重組DNA制品天然基因合成的核苷酸序列內(nèi)切酶連接酶載體重組的遺傳物質(zhì)導入到受體細胞增殖、表達分離純化目的產(chǎn)物重組DNA制品細胞因子類生長因子類激素類酶類疫苗單克隆抗體診斷制品用于檢測相應的抗原、抗體或機體免疫狀態(tài)的制品。毒素、診斷血清、分群血清、分型血清、因子血清、診斷菌液、抗原或抗體致敏血球、免疫擴散板等體外診斷制品和體內(nèi)診斷制品五、中國生物制品的發(fā)展歷史我國第一所生物制品生產(chǎn)、研究機構：中央防疫所（1919年）（北京生物制品研究所前身）50年代，先后成立了北京、武漢、長春、成都、蘭州、上海6大衛(wèi)生部直屬的生物制品研究所以及中國醫(yī)學科學院昆明醫(yī)學生物研究所、成都輸血研究所。一些常用的預防性制品和血液制品五、中國生物制品的發(fā)展歷史60年代初成立中國藥品生物制品檢定所80年代后，進入高速發(fā)展期：出現(xiàn)大量生物制品企業(yè)；種類、劑型快速增加；由預防性制品發(fā)展至診斷性制品，治療、保健性制品五、中國生物制品的發(fā)展歷史1956年成立衛(wèi)生部生物制品委員會1988年成立衛(wèi)生部生物制品標準化委員會。在審批方面，為與化學藥、中藥區(qū)別，國家藥品監(jiān)督管理局專門制定了《新生物制品審批辦法》六、生物藥物的特點1、生物體的基本生化成分2、分子量大、不確定：分子量測定3、結構難確證4、需檢查生物活性5、要求安全性檢查6、需做效價測定7、全過程的質(zhì)量控制生物制品的全程控制危險因素：異源物質(zhì)、不穩(wěn)定、易受微生物污染全程質(zhì)量控制：原材料、生產(chǎn)過程、最終產(chǎn)品生物制品的生產(chǎn)特點：（1）來源于生物體（2）制造過程涉及生物材料和生物學特征（3）工藝存在易變性和安全性問題生物制品的全程控制全程質(zhì)量控制尚無成熟的經(jīng)驗與方法鑒定方法的獨特性生物制品安全性、有效性的保證：（1）嚴格遵守GMP標準（2）完善的制造檢定規(guī)程（3）各生產(chǎn)工序相適應的檢定方法、標準操作細則（SOP）藥品國家標準：法定技術依據(jù)、標準生物制品的國家標準《生物制品及鑒定規(guī)程草案》（1952）《生物制品制造檢定規(guī)程》（1959）《中國生物制品規(guī)程》（第6版2000）《中華人民共和國藥典》（三部）（2005），收載101種生物制品各部藥典收載情況一部藥典：藥材及飲片、植物油脂和提取物、成方制劑和單味制劑等；二部藥典：化學藥品、抗生素、生化藥品、放射性藥品以及藥用輔料等；三部藥典：生物制品，包括疫苗、抗毒素及抗血清、重組DNA制品、體內(nèi)診斷制品等；項目：

1.品名（中文通用名稱、英文名稱、漢語拼音）

2.定義、組成及用途

3.基本要求

4.制造

5.檢定（原液、半成品、成品）

6.保存運輸及有效期

7.使用說明（僅預防類含此項）生物制品質(zhì)量控制的重點有效成分的統(tǒng)一性、結構確證有效成分的均一性、純度檢驗有害物質(zhì)及殘余雜質(zhì)的控制高效、靈敏的生物活性及比活性實驗方法生化藥物和基因工程藥物質(zhì)量檢驗的基本程序與方法鑒別試驗雜質(zhì)檢查安全性檢查含量、效價測定鑒別試驗理化鑒別試驗

化學反應法光譜鑒別法－UV

色譜鑒別法－HPLC生物化學鑒別法

酶法電泳法-等電聚焦電泳、PAGE生物鑒別法對比吸收光譜和特征吸收的一致性對比色譜保留行為的一致性第二節(jié)鑒別試驗（一）理化鑒別法

1.化學鑒別法：

例：胰蛋白酶+對甲苯基磺酰-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽

紫色

2.紫外分光光度法蛋白質(zhì)的UV：芳香族氨基酸側(cè)鏈（主要是酪氨酸、色氨酸，其次是苯丙氨酸）重組人干擾素α1b、α2a、α2b最大吸收峰278nm±3nm；重組人促紅素：最大吸收279nm±2nm；最小吸收250nm±2nm；在320nm~360nm處無吸收峰

3.高效液相色譜法主峰保留時間和肽圖的一致性結合N-末端氨基酸序列分析，是蛋白質(zhì)類生物制品精確的鑒別方法高效液相色譜法：1、反相高效液相色譜法2、分子排阻色譜法毛細管電泳1、毛細管區(qū)帶電泳CZE重組人粒細胞集落刺激因子的肽圖分析1、RP-HPLC條件：VydacC18(150×4.6,5μm)MP:0.1%CF3COOH-CH3CNingradientelutionFR:0.5ml/minDW:214nm2、CZE條件：毛細管柱37cm×75μm，有效長度30cmBuffer:0.05mol/L的磷酸鹽水溶液，pH5.8運行電壓：12KVDW：214nm二、生化鑒別法1.酶法：例：尿激酶的鑒別氣泡上升法原理：激活

方法：取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置37℃±0.5℃恒溫水浴保溫，記時。反應系統(tǒng)在30～40秒內(nèi)凝結，凝結塊內(nèi)有氣泡生成，15分鐘內(nèi)凝結塊溶解，當凝結塊溶解時，氣泡逐漸上升。以0.9%氯化鈉作空白，同法操作，凝結塊在2小時內(nèi)不溶。2.電泳法：以肝素鑒別為例。與國家肝素標準品對照，其移動位置相應。三.生物法：利用生物體進行試驗來鑒別藥物。例：家兔驚厥試驗鑒別胰島素。利用胰島素的降糖作用。給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%葡萄糖注射液，驚厥停止。雜質(zhì)檢查一般雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)檢查安全性檢查第三節(jié)雜質(zhì)檢查一、特殊雜質(zhì)檢查

特殊雜質(zhì)生物污染物產(chǎn)品相關雜質(zhì)工藝添加劑生物污染物1、微生物2、細胞成分3、培養(yǎng)基成分4、有關大分子物質(zhì)宿主細胞、外源性DNA牛血清白蛋白重組制品中的鼠IgG產(chǎn)品相關雜質(zhì)1、二聚體和多聚體2、脫氨或氧化產(chǎn)物3、突變物4、錯誤裂解產(chǎn)物5、二硫化物異構體工藝添加劑1、殘余抗生素2、蛋白分離劑（聚乙二醇、乙醇）3、佐劑氫氧化鋁4、產(chǎn)品穩(wěn)定劑（辛酸鈉、肝素）5、防腐劑（苯酚、間甲酚等）6、細菌與病毒滅活劑（甲醛等）特殊雜質(zhì)檢查1、宿主細胞蛋白殘留量的檢查目的：控制異源蛋白的含量以防超量后引起機體免疫反應測定法：酶聯(lián)免疫吸附劑測定法－ELISA2、外源性DNA殘留量的檢查目的：防止外源性DNA對人類的危害測定法：分子雜交技術、基于DNA結合蛋白分析系統(tǒng)、實時定量PCR技術3、產(chǎn)品相關雜質(zhì)的檢查－同系物、異構體、降解產(chǎn)物等測定法：HPLC和CE4、殘余抗生素的檢查目的：控制生物制品制備時抗生素的用量測定法：抑菌試驗安全性檢查常規(guī)熱原和細菌內(nèi)毒素的檢查異常毒性試驗過敏試驗降壓物質(zhì)試驗無菌試驗一些特殊污染物的檢查致突變試驗生殖毒性試驗二、安全性檢查異常毒性試驗：是用一定劑量的藥物按照指定的操作方法和途徑給予規(guī)定體重的某試驗動物，觀察其極性毒性反應。小鼠、LD50過敏試驗：是對生化藥物和基因工程藥物中的異性蛋白進行進檢查。豚鼠、皮膚過敏和腹腔注射降壓物質(zhì)檢查：檢查藥物中能夠?qū)е卵獕航档偷奈镔|(zhì)，如組胺類。貓或狗無菌檢查：對于不能進行高溫滅菌的生物藥品，必須進行無菌檢查。一些特殊污染物的檢查：主要考慮外源性DNA、一些雜蛋白等。致突變試驗：回復突變試驗、染色體畸變試驗等生殖毒性試驗含量測定HPLCSDSUVorFluorescence效價測定第四節(jié)含量（效價）測定常用的定量分析方法及應用理化分析法生化分析法生物檢定法理化分析法化學分析方法電化學分析法光譜分析法色譜分析法重量法容量分析法重量法：根據(jù)樣品中分離出來的單體或化合物的重量測定所含成分的含量的方法。提取法：用適宜的溶劑提取樣品中的某成分后揮去溶劑進行測定的方法。揮發(fā)法：利用被測組分的揮發(fā)性，或經(jīng)過衍生化后將其轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性物質(zhì)來進行測定的方法。沉淀法：將被測組分轉(zhuǎn)化成沉淀，稱定沉淀的重量來計算含量的方法。容量法：胰酶中胰淀粉酶的測定：氧化還原滴定。淀粉溶液（底物）+胰淀粉酶→還原糖，碘量法測定還原糖。胰酶中胰脂肪酶的測定：酸堿滴定法。橄欖油乳液（底物）+胰脂肪酶→脂肪酸，氫氧化鈉滴定。

藥物膜電極

生物組織膜電極

藥物電極微生物電極

離子選擇性電極法免疫電極

免疫場效應管

酶電極

電化學分析法比色法

利用樣品與顯色劑發(fā)生現(xiàn)色反應，根據(jù)反應產(chǎn)物的顏色強度來測定含量。Elson-Morgan

硫酸軟骨素的比色法測定：在酸性條件下使樣品水解成氨基己糖，再在堿性條件下與乙酰丙酮和二甲氨基苯甲醛反應生成紅色的產(chǎn)物，該產(chǎn)物在525nm處有最大吸收。光譜分析方法具體試驗操作：1、制備對照品溶液－氨基葡萄糖2、制備供試品溶液－硫酸軟骨素3、反應和測定－縮合反應和比色測定A平為供試品溶液的吸收度As平為對照品溶液的吸收度Ws為對照品溶液的濃度（mg/ml）W為稱樣量（mg）0.8309為校正因子500為稀釋倍數(shù)以氨基葡萄糖計≥24.0％色譜法

1）RP-HPLC：反相高效液相色譜法

色譜柱柱：C8，18烷基硅烷鍵合相；

流動相：甲醇（或乙腈）－水（或緩沖液）

梯度洗脫

檢測器：紫外、熒光檢測器；電化學檢測器

應用：肽類、氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖的定量分析2）HPIEC：高效離子交換色譜（highperformance

ionexchangechromatography

）

應用：蛋白質(zhì)，多肽的分離測定

色譜柱：離子交換鍵合相

流動相：0.3mol/L～1.0mol/L的鹽的緩沖液。

梯度洗脫：鹽的濃度逐漸增大。盡量避免使用鹵素類鹽

特點：可回收活性蛋白。

3）HPGFC：高效凝膠過濾色譜法（highperformance

gelfiltrationchromatography

）

原理：分子篩效應（根據(jù)分子大小分離）應用：蛋白質(zhì)、多肽的分離及分子量測定。色譜柱：凝膠色譜柱

流動相：水或緩沖液（常加入有機改性劑）

特點：活性蛋白可回收

4）灌注色譜法（perfusionchromatography

）定義：使用具有“貫通孔”的填料使流動相快速地貫穿填料顆粒流動，從而加快填料內(nèi)傳質(zhì)過程的液相色譜方法。

固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交聯(lián)結構上構成的貫穿孔顆粒(POROS)；顆粒分離介質(zhì)POROSR。雙模式孔結構：80～150nm大擴散孔

600～800nm貫穿孔

允許液體傳送流經(jīng)過分離介質(zhì)內(nèi)表面，使樣品由流動相直接灌注入介質(zhì)顆粒中，擴散作用不再是主要的。介質(zhì)顆粒內(nèi)部可利用反應的表面積增加，容量和分辨率也隨之增加，可使生物活性大分子快速分離純化。

應用：基因工程藥物和其他大分子藥物的分離純化和分析。酶法1、酶活力法：以酶作為分析對象；2、酶分析法：以酶為分析工具或分析試劑；酶活力測定法

1）基本原理：

酶活力是指酶催化一定化學反應的能力。酶活力測定實質(zhì)上是測定一個被酶所催化的化學反應速度。酶反應速度越快所表示的酶活力越高。

活力單位（國際單位，IU）

在25℃，以最適當?shù)牡孜餄舛?、最適當?shù)木彌_液離子強度以及最適當?shù)膒H等條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化1μmol底物的酶量。

比活性（IU/mg蛋白質(zhì)）

每1mg蛋白質(zhì)所含的酶單位數(shù)。

酶反應速度可以用單位時間反應底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。

通常酶活力測定時，先制備酶反應進程曲線和酶濃度曲線。通過酶反應速度的測定，求得酶的濃度或含量。酶反應進程曲線

縱坐標為底物或產(chǎn)物的變化量，橫坐標為反應時間，曲線斜率表示反應速度。從酶反應進程曲線求得反應的初速度。

酶濃度曲線

縱坐標為反應速度，橫坐標為酶量。通過酶濃度曲線檢驗反應測定系統(tǒng)是否適宜。

酶活力測定的要求：測得的反應速度必須和酶濃度有線性的比例關系，這也是檢驗酶反應和測定系統(tǒng)是否適宜、正確的標準。

2）酶促反應的條件及影響因素

底物的濃度：一般選用底物的濃度[S]=100Km

pH：選用一個適宜的緩沖離子和離子強度、

適宜的pH值的緩沖系統(tǒng)