基因功能的研究方法課件

第十章.基因功能的研究方法（一）一、計算機(jī)預(yù)測基因功能二、實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因功能1．基因失活是功能分析的主要手段1.1基因敲除（Geneknock-out）1.2基因敲除的技術(shù)路線1.3基因敲除的主要應(yīng)用領(lǐng)域及國內(nèi)外研究進(jìn)展1.4基因失活的表型效應(yīng)有時不易分辨2．轉(zhuǎn)座子突變庫的構(gòu)建2.1插入序列2.2實(shí)驗(yàn)步驟3．內(nèi)含子歸巢突變4．基因的超表達(dá)用于功能檢測5.

反義RNA5.1反義RNA的分類和作用機(jī)制5.2ticRNA(transcriptioninhibitorycomplementaryRNA)5.3反義RNA的功能5.3.1調(diào)控細(xì)菌基因的表達(dá)5.3.2噬菌體溶菌/溶源狀態(tài)的控制5.3.3

IS10轉(zhuǎn)位作用的抑制5.4人工合成構(gòu)建反義RNA5.5使反義RNA分子穩(wěn)定的方法確認(rèn)DNA順序中的基因序列后，下一個問題就是探知其功能，這是基因組研究的一個難度很大的領(lǐng)域。一些已完成測序的基因組順序分析表明，我們所了解的基因組內(nèi)容比真實(shí)的情況少的多。如大腸桿菌與啤酒酵母，在未開始基因組測序前已經(jīng)完成了大量常規(guī)的遺傳學(xué)分析，當(dāng)時遺傳學(xué)家認(rèn)為這2種生物的大多數(shù)基因已經(jīng)通過突變鑒定，但實(shí)際上還有很多空白。大腸桿菌編碼蛋白質(zhì)的4288個基因中，以往知道的只有1853個，僅占43%。至于啤酒酵母，所知更少，僅為30%。一、計算機(jī)預(yù)測基因功能計算機(jī)預(yù)測基因功能的依據(jù)仍然是同源性比較。同源基因都有1個共同的祖先基因，他們之間有許多相似的順序。同源基因可以分為2類：種間同源基因或直系基因(orthologousgene)這是指不同物種之間的同源基因，它們來自物種分隔之前的同一祖先。種內(nèi)同源基因或平行基因(paralogousgene)同一種生物內(nèi)部的同源基因，它們常常是多基因家族的不同成員，其共同的祖先基因可能存在于物種形成之后，也可能出現(xiàn)于物種形成之前。同源基因一般不會有完全一致的核苷酸順序，因?yàn)檫@兩個基因在出現(xiàn)后獨(dú)立的發(fā)生隨機(jī)突變，但它們有相似的順序組成，大部分未突變的核苷酸位置是相同的。當(dāng)一個新的基因序列被確認(rèn)后，根據(jù)同源性可從數(shù)據(jù)庫中查找已知順序的同源基因。根據(jù)進(jìn)化的相關(guān)性可從已知的同源基因推測新基因的功能。

根據(jù)同源性預(yù)測基因時必需注意以下幾點(diǎn)：一般認(rèn)為aa的一致性或相似性在25%以上可視為同源基因；同源性與相似性的含義不同，如aa順序的80%的相似性不能稱為同源性。一致性常指同一位置同一aa在整個多肽序列中所占的比例，而相似性除一致性aa外還包括可取代aa的成員，因此相似性aa的比例總是高于一致性aa。有時在2個無明顯親緣關(guān)系的基因之間會出現(xiàn)局部相似的區(qū)段。這種情況表明，2個無親緣關(guān)系的蛋白質(zhì)可能具有相似的功能，相似的順序是功能的核心區(qū)域。雖然基因本身無共同的祖先，但其功能域卻有共同的起源。它們都是古老祖先的后裔，在進(jìn)化中一方面發(fā)生獨(dú)立突變，另一方面又因基因組重排成為新基因的組成部分。例如信號傳導(dǎo)蛋白，這類蛋白質(zhì)一般都有2個基本的功能域，即接受信號的功能域和傳達(dá)信號的激酶域。

1．基因失活是功能分析的主要手段傳統(tǒng)的遺傳分析主要借助突變型研究表型變異的遺傳基礎(chǔ)，利用紫外線誘導(dǎo)及化學(xué)試劑處理可使生物群體產(chǎn)生突變個體，也可從自然的群體中發(fā)現(xiàn)突變體。經(jīng)遺傳分析將突變基因定位，然后觀察這一突變體是否與改變的表型對應(yīng)。在此基礎(chǔ)上采用分子生物學(xué)方法進(jìn)一步分離與克隆目標(biāo)基因。1.1基因敲除（Geneknock-out）概念：基因敲除除可中止某一基因的表達(dá)外，還包括引入新基因及引入定點(diǎn)突變。即可以是用突變基因或其它基因敲除相應(yīng)的正?；颍部梢杂谜；蚯贸鄳?yīng)的突變基因?；蚯贸?0年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)。80年代初，胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。1985年，首次證實(shí)的哺乳動物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型。此后的幾年中，基因敲除技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展和完善。1.2基因敲除的技術(shù)路線如下：構(gòu)建重組基因載體；用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)；用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞；將擊中細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長成為轉(zhuǎn)基因動物，對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測。

Note:基因敲除的靶細(xì)胞目前最常用的是小鼠ES細(xì)胞?；蚯贸募夹g(shù)路線雖不復(fù)雜，但由于高等真核細(xì)胞內(nèi)外源DNA與靶細(xì)胞DNA序列自然發(fā)生同源重組的機(jī)率非常低，約為百萬分之一，要把基因敲除成功的細(xì)胞篩選出來是一件非常困難的工作。因此，同源重組的篩選和檢測就成了基因敲除技術(shù)所要解決的關(guān)鍵問題。目前已有多種篩選方法，其中1988年猶它大學(xué)的Capecchi教授的研究組發(fā)展的"正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)"適用范圍寬且效率較高。1.3基因敲除主要應(yīng)用領(lǐng)域及國內(nèi)外研究進(jìn)展基因敲除的應(yīng)用領(lǐng)域主要有：建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供材料；改造動物基因型，鑒定新基因和/或其新功能；治療遺傳??；改造生物、培育新的生物品種。

建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供材料

基因敲除小鼠是研究疾病的發(fā)生機(jī)理、分子基礎(chǔ)及診斷治療的重要實(shí)驗(yàn)材料。如1989年囊性纖維化?。–F）的致病基因（CFTR）被成功地克??；1992年成功建立了CFTR基因的基因敲除的CF小鼠模型，為CF基因治療提供了很好的動物模型，得以順利通過了基因治療的動物試驗(yàn)；于1993年開始臨床試驗(yàn)并獲得成功。改造動物基因型，鑒定新基因和/或其新功能，研究發(fā)育生物學(xué)深入研究基因敲除小鼠在胚胎發(fā)育及生命各期的表現(xiàn)，可以得到詳細(xì)的有關(guān)該基因在生長發(fā)育中的作用，為研究基因的功能和生物效應(yīng)提供模式。例如，目前人類基因組研究多由新基因序列的篩選檢測入手，進(jìn)而用基因敲除法在小鼠上觀察該基因缺失引起的表型變化。目前已報道了多種學(xué)習(xí)、記憶以及LTP、LTD有缺陷的基因敲除動物，發(fā)現(xiàn)多種基因在學(xué)習(xí)、記憶的形成過程中必不可少。1.4基因失活的表型效應(yīng)有時不易分辨通過上述種種方法得到的攜帶失活基因的品系與個體后，下一步工作就是檢測突變體表型以便指認(rèn)未知基因的具體功能。這一步也會遇到難題，生物表型范疇很廣。即使單細(xì)胞的酵母，要確認(rèn)一個未知基因?qū)Ρ硇偷呢暙I(xiàn)，也可列出很長的一串名單。至于高等生物，因其某些表型具有難以捉摸的綜合性，區(qū)分其準(zhǔn)確的功能更加棘手。

2．轉(zhuǎn)座子突變庫構(gòu)建

轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法又稱基因標(biāo)簽(genetagging)，通過構(gòu)建插入突變庫系統(tǒng)，分離與克隆功能基因與調(diào)控順序。這一策略主要依據(jù)以下技術(shù)：植物體細(xì)胞全能性；已經(jīng)建立了一套成熟的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，使外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中成功表達(dá)。

目前應(yīng)用的最成功的是玉米的Ac-Ds轉(zhuǎn)座因子系統(tǒng)?；驑?biāo)簽突變庫的工作原理如下：玉米色粒調(diào)控元件

Ac-Ds系統(tǒng)：第9染色體

C基因：色素合成基因。

Ac基因：自主移動的調(diào)節(jié)因子，4.5kb，5個exon，編碼轉(zhuǎn)座酶。

Ds基因：非自主移動的受體因子，0.5－4.0kb，與Ac有同源序列，插入引起色素不能合成。

2.1插入序列(insertionsequence,IS)

僅含有轉(zhuǎn)座酶基因的簡單轉(zhuǎn)移序列。長度多在700－1500bp左右。由末端反向重復(fù)序列(IR)，轉(zhuǎn)座酶基因組成。插入基因組中時，在靶位上生成正向重復(fù)序列(DR)

常見的IS結(jié)構(gòu)。IS

長度

末端IR

靶位DR

插入選擇

IS1

768

23

9

隨機(jī)

IS2

1327

41

95

熱點(diǎn)

IS4

1428

18

（12）

AAAN20TTT

IS5

1195

16

4

熱點(diǎn)

IS10

1329

22

9

TNAGCN

IS50

1531

9

9

熱點(diǎn)2.2實(shí)驗(yàn)步驟將Ac因子轉(zhuǎn)座酶的編碼基因與組成型啟動子如35S構(gòu)建成嵌合基因表達(dá)載體，由于除去了轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)的反向重復(fù)順序，轉(zhuǎn)座酶的編碼基因不能自我轉(zhuǎn)座。這一表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得的再生植株為Ａ（sAc）。外顯子捕獲載體構(gòu)建：在轉(zhuǎn)座子的邊界順序與標(biāo)記基因之間插入內(nèi)含子剪接受體順序，將它們轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得再生植株B。

上述方法用于擬南芥的基因打靶(genetargeting)取得了很好的效果，并已應(yīng)用于水稻，玉米等作物的功能基因分離。但它們也有2點(diǎn)不利之處：插入突變往往是隱性的，必須建立自交的F2代群體才能找到突變株系；植物基因組有大量的冗沉基因，它們可取代突變基因的功能，很多突變的效果不易鑒定。改進(jìn)方法為采用功能增益突變路線，即在轉(zhuǎn)座子邊界內(nèi)部加入強(qiáng)啟動子。3．內(nèi)含子歸巢突變什么是內(nèi)含子歸巢?在I類II類的某些內(nèi)含子中含有開放讀框，可產(chǎn)生具有三種功能的蛋白。這些蛋白可使內(nèi)含子（或以其原來的DNA形式，或作為RNA的DNA拷貝）移動(mobile)，使內(nèi)含子可插到一個新的靶位點(diǎn)，這個現(xiàn)象叫做歸巢（homing）。I組和II組內(nèi)含子分布很廣，在真核和原核細(xì)胞中都有發(fā)現(xiàn)。在這些內(nèi)含子的開放讀框中編碼具有三種功能的蛋白，這些蛋白與DNA或RNA的代謝有關(guān)。核酸內(nèi)切酶：在DNA的靶位點(diǎn)剪切，使內(nèi)含子得以插入；反轉(zhuǎn)錄酶：涉及將內(nèi)含子RNA變成DNA拷貝；成熟酶：從前體的RNA中切掉內(nèi)含子的部分。第I組內(nèi)含子具有編碼核酸內(nèi)切酶的開放讀框；有時成熟酶的活性和此蛋白有關(guān)。第II類內(nèi)含子具有編碼核酸內(nèi)切酶和反轉(zhuǎn)錄酶的序列，另外成熟酶的活性也與此蛋白有關(guān)。在有些情況下還具有與其它酶活性相關(guān)聯(lián)的成熟酶功能的遺傳信息，成熟酶主要功能是使內(nèi)含子的構(gòu)象穩(wěn)定，這于剪接來說是很必要的。現(xiàn)已知道有些第I組內(nèi)含子編碼核酸內(nèi)切酶，它們的作用是幫助內(nèi)含子在雜交中能插入到其不同等位基因的座位中。在真菌的線粒體中普遍存在著內(nèi)含子的多態(tài)性或者缺乏內(nèi)含子，有種觀點(diǎn)認(rèn)為內(nèi)含子來源于基因的插入。通過分析酵母線粒體的大的rRNA基因在雜交中的重組，另一種觀點(diǎn)認(rèn)為以上的現(xiàn)象是基因的丟失。在第I組內(nèi)含子中含有編碼序列。這些內(nèi)含子存在于“ω+”的酵母品系中，但另一品系“ω-”中缺乏此內(nèi)含子，將ω+和ω-進(jìn)行雜交其后代通常都是ω+。如果我們將ω+品系看作供體，將ω-品系前成受體，我們從ω+×ω-雜交中會發(fā)現(xiàn)ω-基因組中產(chǎn)生了內(nèi)含子的新拷貝，結(jié)果使全部后代都表現(xiàn)為ω+。在兩個親本任何一個都可發(fā)生突變而抑制以上的歸巢。突變的結(jié)果使雜交后代中出現(xiàn)了正常分離，即ω+和ω-的后代中出現(xiàn)了正常分離，即ω+和ω-的后代數(shù)相等。這種突變表明了這個過程的性質(zhì)。在ω+的品系中突變發(fā)生在緊靠著內(nèi)含子將要插入的位點(diǎn)。在ω-品系中突變發(fā)生在內(nèi)含子的開放讀框中，從而阻止了蛋白質(zhì)的合成。這表明在ω+品系中的內(nèi)含子編碼的蛋白識別ω-品系的靶位點(diǎn)，將其切開，并將內(nèi)含子的一個新拷貝插入切開的靶位點(diǎn)中，使之變成ω+品系，而且能穩(wěn)定地遺傳。這種蛋白的作用是什么呢？ω內(nèi)含子的產(chǎn)物是一種核酸內(nèi)切酶，它能識別ω-基因并將它作為靶點(diǎn)切開其雙鏈。這種核酸內(nèi)切酶識別18bp的靶序列，此含有內(nèi)含子插入位點(diǎn)。靶序列的剪切是在每條鏈插入位點(diǎn)的3’端這一側(cè)2個堿基處交錯切，這樣剪切位點(diǎn)占4個bp，產(chǎn)生了凸出的單鏈末端。這種類型的剪切是和轉(zhuǎn)座子移到新位點(diǎn)的機(jī)制有關(guān)。雙鏈的斷裂起始了基因的轉(zhuǎn)變，在轉(zhuǎn)變中ω+基因序列產(chǎn)生了一個新拷貝取代ω-基因，這個過程涉及通過復(fù)制機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)座，且僅在DNA水平上發(fā)生或以DNA取代的方式，或以模板轉(zhuǎn)換的方式（與重組修復(fù)相類似）來完成。要注意內(nèi)含子的插入中斷了內(nèi)切酶對這個序列的識別，這樣使其穩(wěn)定。其它含有開放讀框的第I類內(nèi)含子也可以移動。內(nèi)含子永久存在的機(jī)制是相同的：內(nèi)含子編碼的核酸內(nèi)切酶剪切內(nèi)含子將之插入特殊的靶位點(diǎn)。插入的細(xì)節(jié)是有不同的。例如T4噬菌體td內(nèi)含子所編碼的核酸內(nèi)切酶就是在靶位點(diǎn)上游24bp處剪切，然后內(nèi)含子本身插入這個位點(diǎn)，而不是其新產(chǎn)生的拷貝。雖然內(nèi)含子移動的機(jī)制是共同的，但靶位點(diǎn)的序列和內(nèi)含子編碼區(qū)域之間并無同源性。據(jù)推測內(nèi)含子有一個共同的進(jìn)化區(qū)域，但很明顯它們有很大的歧化。靶位點(diǎn)是在各種靶序列中最長的，對于核酸內(nèi)切酶來說也是最特異的。結(jié)果內(nèi)含子永久性地插入到單個的靶位點(diǎn)中，而且不插入基因組的任何其他地方，此就稱為內(nèi)含子歸巢(intronhoming)。含有編碼核酸內(nèi)切酶序列的內(nèi)含子在不同細(xì)菌和低等真核生物中都有所發(fā)現(xiàn)。由此產(chǎn)生一種游離的因子，其編碼的功能涉及到RNA的剪接或者DNA分子之間的移動。與此相關(guān)的觀點(diǎn)認(rèn)為內(nèi)含子編碼區(qū)域中密碼子的用法與外顯子稍有不同。在第Ⅱ類內(nèi)含子中大部分開放讀框都具有一個與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相關(guān)的區(qū)域（除核酸內(nèi)切酶編碼區(qū)之外）。這種類型的內(nèi)含子在低等真核生物和某些細(xì)菌中都有發(fā)現(xiàn)。反轉(zhuǎn)錄酶對于內(nèi)含子來說是特異的，而且和歸巢有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶以初始mRNA為模板合成內(nèi)含子的DNA拷貝，通過采用與反轉(zhuǎn)錄病毒相似的機(jī)制使內(nèi)含子插入到靶位點(diǎn)中。和這種情況有關(guān)的此種類型的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與失去LTRs的一組反轉(zhuǎn)錄子是相似的。在靶位點(diǎn)產(chǎn)生缺口，形成的3′-OH對于引發(fā)來說是需要的。第Ⅱ類內(nèi)含子歸巢的例子與前面介紹的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的機(jī)制相似，內(nèi)切酶在靶位點(diǎn)的雙鏈DNA上切一切口，在缺口上產(chǎn)生了3’末端為反轉(zhuǎn)錄酶提供了引物。內(nèi)含子RNA為cDNA的合成提供了模板。由于此RNA含有內(nèi)含子兩側(cè)的外顯子的序列，所以此cDNA要比內(nèi)含子本身長，它能跨越雙鏈切口，結(jié)果是使內(nèi)含子插入到靶位點(diǎn)。將一種核糖核蛋白和DNA底物的一道溫育在體內(nèi)可產(chǎn)生移動系統(tǒng)。這個核糖核蛋白含有一個帶有第II組內(nèi)含子的RNA和它的蛋白產(chǎn)物。它具有核酸內(nèi)切酶活性，在恰當(dāng)?shù)陌形稽c(diǎn)交錯切割雙鏈。核糖核蛋白的RNA和蛋白兩種成份對于剪切都是需要的。在催化中二者可能都有作用?？梢苿拥膬?nèi)含子似乎是被插入到先前存在的基因中。它們可能進(jìn)化為核內(nèi)前體-mRNA內(nèi)含子。具有自我剪切的能力的內(nèi)含子顯示了剪接進(jìn)化的重要作用。例如它們能移動到核中并成為snRNA的祖先。內(nèi)含子歸巢突變就是利用歸巢特性，將它們插到大腸桿菌的質(zhì)粒載體中，另外再將人類HIV病毒和CCR5基因靶位DNA構(gòu)建到另一載體中。當(dāng)這2類載體在大腸桿菌或人類體外培養(yǎng)細(xì)胞中相遇，內(nèi)含子RNA可以逆剪切方式插入到HIV和CCR5DNA靶位中，而且表現(xiàn)為某種隨機(jī)性。當(dāng)內(nèi)含子反向插入基因內(nèi)部時，由于不表達(dá)IEP，成為永久整合。當(dāng)內(nèi)含子插入方向與IEP轉(zhuǎn)錄方向一致時，內(nèi)含子可以繼續(xù)轉(zhuǎn)移破壞其他位點(diǎn)。這一系統(tǒng)可望用于缺少同源重組系統(tǒng)生物的功能基因組研究。

4．基因的超表達(dá)用于功能檢測

基因功能的檢測除了使其失活外還可讓其過量表達(dá)，基因產(chǎn)物的不足與過量都會破壞這種平衡，表現(xiàn)生長與發(fā)育的異常。基因的超表達(dá)有兩種技術(shù)：1.增加基因的拷貝數(shù)；2.采用強(qiáng)啟動子促使基因表達(dá)

5.反義RNA反義RNA(antisenseRNA)是指mRNA互補(bǔ)的RNA分子。這種反義RNA能與mRNA分子特異性地互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制該mRNA的加工與翻譯，是原核細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)控的一種方式。然而，許多實(shí)驗(yàn)證明，在真核細(xì)胞中亦存在反義RNA，但其功能尚未全部明了。最近幾年來通過人工合成反義RNA的基因，并將之導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄出反義RNA，即能抑制特定基因的表達(dá)，阻斷該基因的功能，有助于了解該基因?qū)?xì)胞生長和分化的作用。同時也暗示了該方法對腫瘤實(shí)施基因治療的可能性。5.1反義RNA的分類和作用機(jī)制下表總結(jié)了原核細(xì)胞內(nèi)天然存在的11種反義RNA。這些反義RNA按其作用機(jī)制可經(jīng)分為三大類。Ⅰ類：這類反義RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或編碼區(qū)，引起翻譯的直接抑制(ⅠA類)或與靶mRNA結(jié)合后引起該雙鏈RNA分子對RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解(ⅠB類)。Ⅱ類：這類反義RNA與mRNA的SD序列的上游非編碼區(qū)結(jié)合，從而抑制靶mRNA的翻譯功能。其作用機(jī)制尚不完全清楚，可能是反義RNA與靶mRNA的上游序列結(jié)合后會引起核糖體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因而阻止了核糖體的結(jié)合。Ⅲ類：這類反義RNA可直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。

5.2

ticRNAtranscriptioninhibitorycomplementaryRNAticRNA是大腸桿菌中CAP蛋白(cAMP結(jié)合蛋白)的mRNA的反義RNA。ticRNA的基因的啟動子可被cAMP-CAP復(fù)合物所激活，從CAPmRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3個核苷酸處開始，以CAPmRNA的模板DNA鏈的互補(bǔ)鏈為模板，合成ticRNA。ticRNA具體長度不清楚，但是它是5’端一段正好和CAPmRNA的5’端有不完全的互補(bǔ)，可以形成雙鏈的RNA雜交體。而在CAPmRNA上緊隨雜交區(qū)之后的是一段約長11bp的A，U豐富區(qū)。這樣的結(jié)構(gòu)十分類似于ρ不依賴性的轉(zhuǎn)錄終止子的結(jié)構(gòu)，從而CAPmRNA的轉(zhuǎn)錄剛剛開始不久后即迅速終止。從這個例子中我們可以看到CAP蛋白合成的自我調(diào)節(jié)作用。當(dāng)CAP合成達(dá)一定量后，即可與cAMP結(jié)合成cAMP-CAP復(fù)合物。再激活ticRNA的啟動子轉(zhuǎn)錄出ticRNA，反過來抑制CAP-mRNA的合成。

5.3反義RNA的功能在原核生物中反義RNA具有多種功能，例如調(diào)控質(zhì)粒的復(fù)制及其接合轉(zhuǎn)移，抑制某些轉(zhuǎn)位因子的轉(zhuǎn)位，對某些噬菌體溶菌-溶源狀態(tài)的控制等。下文僅舉數(shù)例：

5.3.1調(diào)控細(xì)菌基因的表達(dá)反義RNA對編碼CAP基因的調(diào)控作用已如前述。這里再介紹一下micFRNA對ompF基因的表達(dá)的調(diào)控。ompF蛋白質(zhì)是大腸桿菌的外膜蛋白的主要成分這一。micFRNA是從另一基因(ompC基因)附近的DNA序列轉(zhuǎn)錄而來，和ompFmRNA的5‘端有70%的序列互補(bǔ)，因此在體外micFRNA可以抑制ompFmRNA的翻譯。但是這種抑制作用在體內(nèi)是否重要尚有疑問，因?yàn)槿笔icF基因的菌株其ompF蛋白的表達(dá)只受到輕微的影響。

5.3.2噬菌體溶菌/溶源狀態(tài)的控制反義RNA也參與了λ和P22噬菌體的溶菌/溶源狀態(tài)的控制。P22噬菌體編碼一種抗阻遏蛋白Ant，它可以抑制許多λ樣噬菌體的阻遏蛋白與DNA的結(jié)合。這對于剛剛感染細(xì)胞的P22建立λ樣原噬菌體(prophage)是有益的。但是Ant必須在嚴(yán)格的控制下，否則Ant的過分表達(dá)必將阻止溶源狀態(tài)的建立，而成為溶菌性的噬菌體。Ant蛋白質(zhì)表達(dá)的控制是利用反義RNA(sarRNA)能與antmRNA的翻譯起源區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制antmRNA翻譯成Ant蛋白。

在λ噬菌體中cⅡ蛋白控制著溶菌或溶源狀態(tài)的選擇。cⅡ蛋白可以激活λPre啟動子，該啟動子控制的基因是λ噬菌體整合作用所必須的，且同時能抑制λ噬菌體的復(fù)制。cⅡ蛋白的另一功能是延緩λ晚期基因的表達(dá)，其作用機(jī)制是cⅡ蛋白激活PaQ的啟動子，轉(zhuǎn)錄出PaQRNA。PaQRA是編碼Q蛋白的mRNA的反義RNA。因此，PaQRNA能與QmRNA配對雜交而抑制其翻譯，而Q蛋白早已知道是晚期基因表達(dá)的激活蛋白。cⅡ基因本身的表達(dá)還受到稱為oopRNA的反義RNA的調(diào)控。oopRNA與cⅡ基因的3'端互補(bǔ)，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。

5.3.3

IS10轉(zhuǎn)位作用的抑制outRNA是一種反義RNA，可以和IS10編碼的轉(zhuǎn)位酶mRNA(INRNA)5’端結(jié)合而抑制其翻譯，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)只有一個拷貝IS10時，只能生成很少量的outRNA，故轉(zhuǎn)位酶仍可生成。但當(dāng)IS10的拷貝數(shù)增多時，outRNA愈來愈多，其控制作用亦明顯增強(qiáng)，所以稱為多拷貝抑制現(xiàn)象。這種現(xiàn)象可以防止IS10的過量堆積引起的細(xì)胞損害。5.4人工合成構(gòu)建反義RNA既然反義RNA在原核生物中對基因表達(dá)起著重要的調(diào)控作用，那末人工設(shè)計在天然狀態(tài)下不存在的反義RNA來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，想必也是可能的。這已在不少實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。由于目前對靶mRNA的SD序列的上游區(qū)的結(jié)構(gòu)了解甚少，因此，在要設(shè)計Ⅱ類反義RNA用于和靶mRNASD序列上游區(qū)結(jié)合，以期達(dá)到調(diào)節(jié)該mRNA翻譯的目的是比較困難的。

Ⅲ類反義RNA是和mRNA的起始處結(jié)合而形成類似ρ-不依賴性的轉(zhuǎn)錄終止子而使轉(zhuǎn)錄水平上抑制靶基因的表達(dá)。因此，要設(shè)法在靶mRNA上找到一段連續(xù)的U序列，就可以設(shè)計出反義RNA，與該U序列上游的mRNA鏈互補(bǔ)，以形成ρ-不依賴性終止子。理想的作用位點(diǎn)是在靶mRNA的5'端上游的非編碼區(qū)，以免受核糖體的影響。只要靶基因的核苷酸順序已經(jīng)知道，就可以人工設(shè)計出Ⅰ類反義RNA。有時還可設(shè)計同時具有Ⅰ類和Ⅲ類反義RNA功能的反義RNA。我們還可以設(shè)計出天然存在的反義RNA的反義RNA來。這樣就可以拮抗原始反義RNA對靶mRNA的抑制作用。而達(dá)到激活或加強(qiáng)某個靶基因的表達(dá)的目的。然而并不是所有的mRNA對其相應(yīng)的Ⅰ類反義RNA都敏感。例如：有的mRNA壽命很短，只有1-2分鐘，它們和反義RNA結(jié)合的機(jī)會較少，因而就較不敏感。反之，另一些mRNA則很穩(wěn)定，壽命可達(dá)十多分種，則其對相應(yīng)的反義RNA的抑制作用就很敏感。此外，反義RNA本身的穩(wěn)定性有很大的實(shí)際意義。顯然，穩(wěn)定的反義RNA對靶mRNA的調(diào)節(jié)作用比不穩(wěn)定的反義RNA要好。

5.5使反義RNA分子穩(wěn)定的方法反義RNA3’端帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)或類似ρ-不依賴性終止子結(jié)構(gòu)時，可以穩(wěn)定RNA分子。

Gorski等還發(fā)現(xiàn)在T4噬菌體的基因32mRNA的5’端上游的莖環(huán)結(jié)構(gòu)及其附近的序列亦可穩(wěn)定RNA分子。所以在設(shè)計反義RNA基因時，最好將產(chǎn)生3’及5’端這種二級結(jié)構(gòu)的序列克隆在反義RNA基因的兩端。Hirashima等1986年發(fā)現(xiàn)，針對靶mRNA的SD序列和AUG區(qū)域的反義RNA，要比單純對編碼區(qū)域的反義RNA更為有效。1989年Hirashima又發(fā)現(xiàn)，針對SD序列和它的上游區(qū)域（但不包括AUG）的反義RNA更為有效。在真核生物中，針對5'端非編碼區(qū)的反義RNA更有效。但也有實(shí)驗(yàn)表明針對第一內(nèi)含子的反義RNA也同樣有效?，F(xiàn)在設(shè)計反義RNA基因是時應(yīng)注意幾點(diǎn)總結(jié)如下：長的反義RNA并不一定比短的反義RNA更為有效。在原核生物中針對SD序列及其附近區(qū)域的反義RNA可能更有效。在真核生物中，對應(yīng)于5’端非編碼區(qū)的反義RNA可能比針對編碼區(qū)的反義RNA更有效。盡量避免在反義RNA分子中出現(xiàn)自我互補(bǔ)的二級結(jié)構(gòu)。設(shè)計的反義RNA分子中不應(yīng)有AUG或開放讀框，否則該反義RNA亦會與核糖體結(jié)合而影響其與靶mRNA的配對結(jié)合。進(jìn)一步還可以將帶有ribozyme結(jié)構(gòu)的RNA連在反義RNA的3'端尾上，當(dāng)反義RNA與靶mRNA雜交后，即可利用其酶活性來降解靶mRNA。此外，為了增強(qiáng)反義RNA的作用，還可以采取一些額外措施，例如：由于反義RNA對靶mRNA的抑制作用有劑量依賴性，所以在構(gòu)建反義RNA基因時，要選擇強(qiáng)的、可以誘導(dǎo)的啟動子以增強(qiáng)反義RNA本身的表達(dá)。構(gòu)建許多個反義RNA基因串連在一起，以得到線性重復(fù)的多拷貝基因，對提高反義RNA的表達(dá)也有利。RNA酶Ⅲ可以降解RNA：RNA雜交體，所以在構(gòu)建反義RNA基因時，可將RNA酶Ⅲ的基因也同時轉(zhuǎn)化到靶細(xì)胞中并進(jìn)行表達(dá)。這樣，當(dāng)反義RNA與靶mRNA結(jié)合后，RNA酶Ⅲ即可將其降解。這顯然有利于反義RNA的抑制作用。三、其他的基因功能研究方法基因失活與過量表達(dá)是研究基因功能的基本方法，但還有一些其他的方法可將基因失活及過量表達(dá)所知的結(jié)果進(jìn)一步延伸與深化，對蛋白質(zhì)活性進(jìn)行綜合研究。

１．噬菌體展示(phagedisplay)噬菌體展示是一項(xiàng)篩選技術(shù)，它將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白將展示在病毒顆粒的表面，而編碼這個融合子的DNA則位于該病毒粒子內(nèi)。噬菌體展示技術(shù)使大量隨機(jī)多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子（抗體、酶、細(xì)胞表面受體等）的多肽配體通過一種被稱為淘選（panning）的體外選擇程序得以快速鑒定。最簡單的淘選程序，是將噬菌體展示肽庫與包被有靶分子的平板（或磁珠）共溫育，先洗去未結(jié)合噬菌體，然后洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。被洗脫的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，然后再進(jìn)行下一輪的結(jié)合/擴(kuò)增循環(huán)，以富集那些可結(jié)合序列。經(jīng)3-4輪淘選后，通過DNA測序?qū)γ總€可結(jié)合克隆進(jìn)行定性。展示在噬菌體表面的隨機(jī)肽庫可應(yīng)用于許多方面，包括繪制抗原表位圖譜、研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和鑒定非肽配體的肽模擬物。生物活性肽分子的鑒定既可通過對固定的純化受體進(jìn)行淘選，也可在完整細(xì)胞上進(jìn)行淘選。蛋白酶底物的鑒定可通過在隨機(jī)肽區(qū)域的上游加一段親和標(biāo)簽，然后選用特異性的介質(zhì)來區(qū)分切割和未切割的噬菌體。另外，大的蛋白質(zhì)分子，如抗體、激素、蛋白酶抑制劑、酶和DNA結(jié)合蛋白也可展示在噬菌體上，通過對隨機(jī)突變文庫的篩選，分離出各種具有親和力或特異性改變的突變體。PhD-C7C噬菌體展示肽庫試劑盒是將隨機(jī)七肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(pIII)上而構(gòu)建成的一個組合文庫。與其他NEB展示肽庫不同的是，所展示的隨機(jī)多肽兩側(cè)各有一個半胱氨酸。在非還原條件下，這兩個半胱氨酸自發(fā)地形成一個二硫鍵，使展示的多肽環(huán)化，而PhD-7和PhD-12肽庫則展示線性多肽。受限于二硫鍵環(huán)內(nèi)的7肽庫已被證實(shí)能識別抗原表位結(jié)構(gòu)，D-氨基酸靶分子的鏡像配基及開發(fā)以多肽為基礎(chǔ)的治療藥物。二硫鍵環(huán)內(nèi)的7肽表達(dá)在pIII的N末端，第一個半胱氨酸緊接于丙氨酸后，第二個半胱氨酸后有一小段間隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser組成，然后是野生型pIII蛋白。該文庫含有1.2×109個電轉(zhuǎn)化序列（可能的隨機(jī)七肽序列數(shù)為：207=1.28×109），用10μl本試劑盒提供的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，每個序列一次可產(chǎn)生約200個拷貝。原始文庫的大量測序結(jié)果表明該文庫序列具有廣泛的多樣性，無明顯的殘基位置偏嗜。建議不要擴(kuò)增原始文庫來進(jìn)行其他的淘選試驗(yàn)，因?yàn)橐坏┰贁U(kuò)增便可能會出現(xiàn)序列偏性現(xiàn)象。２．酵母雙雜交

(yeasttwo-hybridization)

2.1概念酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)和研究在活細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)平臺，在近幾年來得到了廣泛運(yùn)用。酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，例如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular)，往往由兩個或兩個以上結(jié)構(gòu)上可以分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(domain)構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，DNA-AD)。這兩個結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。大量的研究文獻(xiàn)表明，酵母雙雜交技術(shù)既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作，也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作。因此，它在許多的研究領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。2.2實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)這個特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Bait

protein的基因構(gòu)建在同一個表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Baitprotein。將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-Library表達(dá)載體上。同時將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因His、Ade、LacZ、Mel1，從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。將陽性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-Library載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進(jìn)行測序和分析工作。在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了酵母單雜交、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)?；诮湍鸽p雜交技術(shù)平臺的特點(diǎn)，它已經(jīng)被應(yīng)用在許多研究工作當(dāng)中。2.3利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新基因的主要途徑。當(dāng)我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-Library載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在Genebank中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。例如：Engelender等人以神經(jīng)末端蛋白alpha-synuclein蛋白為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交ClontechMatchmarkerSystem3為操作平臺，從成人腦cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了與alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并證明了Synphilin-1與alpha-synuclein之間的相互作用與帕金森病的發(fā)病有密切相關(guān)。為了研究兩個蛋白之間的相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，找到影響或抑制兩個蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母雙雜交技術(shù)和基因修飾證明了alpha-synuclein的1-65個氨基酸殘基和Synphilin-1的349-555個氨基酸殘基之間是相互作用的位點(diǎn)。研究它們之