免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件

免疫學(xué)檢測新技術(shù)

及其臨床應(yīng)用

免疫學(xué)檢測新技術(shù)

及其臨床應(yīng)用主要內(nèi)容免疫學(xué)理論及技術(shù)研究和臨床免疫學(xué)檢測技術(shù)構(gòu)成重要免疫學(xué)檢測技術(shù)和新技術(shù)及其應(yīng)用介紹主要內(nèi)容免疫學(xué)理論及技術(shù)研究和臨床一、免疫學(xué)理論及技術(shù)

研究和臨床

一、免疫學(xué)理論及技術(shù)

研究和臨床

1796年，愛得華?琴納發(fā)明了牛痘疫苗從而保護人不得天花，WHO于1979年宣布天花滅絕。1796年，愛得華?琴納發(fā)明了牛痘疫苗從而保護人不得天花，W免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件72011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎BruceA.BeutlerBorninUSAJulesA.HoffmannBorninLuxembourgRalphM.SteinmanBorninCanada證實Toll基因編碼產(chǎn)物在識別病原微生物激活免疫反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用發(fā)現(xiàn)LPS受體：一種Toll樣受體發(fā)現(xiàn)樹突細胞可激活T細胞引發(fā)免疫應(yīng)答72011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎BruceA.Beutl傳染病預(yù)防疾病治療免疫診斷免疫學(xué)理論及技術(shù)研究的臨床意義傳染病預(yù)防免疫學(xué)理論及技術(shù)研究的臨床意義接種疫苗預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎?WHO

接種疫苗預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎?WHO免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件已批準上市的細胞因子多肽藥物IFNα肝炎、白血病、AIDS、癌癥IFNγ類風(fēng)關(guān)，感染性疾病，慢性肉芽腫，過敏性皮炎G-CSF化療導(dǎo)致的粒細胞減少癥、再障、自身骨髓移植GM-CSF化療導(dǎo)致的血細胞減少癥、再障、自身骨髓移植EPO慢性腎衰所致貧血、癌癥或癌癥化療所致貧血、失血后貧血IL-2癌癥、免疫缺陷、疫苗佐劑IFN-β多發(fā)性硬化癥IL-11放化療所致的血小板減少癥SCF與G-CSF聯(lián)合應(yīng)用于外周血干細胞移植EGF燒傷、潰瘍(外用藥，在中國應(yīng)用)βFGF燒傷、外周神經(jīng)炎(外用藥，在中國應(yīng)用)已批準上市的細胞因子多肽藥物IFNα肝炎、白血病、AIDS、可溶性IL-1R(吸入劑）哮喘可溶性IL-1R(注射劑）急性髓樣白血病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可溶性IL-4R哮喘抗IL-4人源化抗體哮喘可溶性TNF-RII-Fc融合蛋白類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性心衰可溶性TNF-RI-Fc融合蛋白休克、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥人源化抗EGF-R2單抗乳腺癌抗TNF-α單抗局限性腸炎人源化抗IL-8抗體銀屑病細胞因子或其受體拮抗劑及其臨床應(yīng)用可溶性IL-1R(吸入劑）哮喘可溶性IL-1R(注射劑）急性二、免疫學(xué)技術(shù)構(gòu)成二、免疫學(xué)技術(shù)構(gòu)成基于抗原抗體反應(yīng)的檢測技術(shù)細胞免疫檢測技術(shù)基于抗原抗體反應(yīng)的檢測技術(shù)抗原抗體反應(yīng)的特點特異性一種抗原只能與其刺激機體產(chǎn)生的抗體結(jié)合，這種抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性稱特異性?？赡嫘钥乖贵w主要通過分子表面的氫鍵、疏水鍵、靜電和范得華力非共價結(jié)合?？梢娦栽谝欢ǚ秶鷥?nèi)，抗原抗體比例合適時，可出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)物。階段性抗原抗體特異性結(jié)合階段；反應(yīng)可見階段?？乖贵w反應(yīng)的特點特異性第一抗體（一抗）：用已知抗原免疫人或動物后，機體會產(chǎn)生特異性抗體存在于血清中，這種抗體叫做一抗。第二抗體（二抗）：Ig具有同種型抗原特異性，將人Ig免疫動物，或?qū)游颕g免疫異種動物可制備出抗抗體，又稱二抗。第一抗體（一抗）：用已知抗原免疫人或動物后，機體會產(chǎn)生特異性抗原抗體反應(yīng)類型和檢測方法凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補體參加的反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)抗原抗體反應(yīng)類型和檢測方法凝集反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)

凝集反應(yīng)（顆粒性抗原）

沉淀反應(yīng)（可溶性抗原）

補體參加的反應(yīng)：溶血空斑實驗

免疫標(biāo)記技術(shù)直接凝集反應(yīng)玻片凝集：ABO血型鑒定試管凝集：肥達反應(yīng)間接凝集反應(yīng)：直接/間接Coombs試驗間接凝集抑制反應(yīng)：免疫妊娠診斷試驗單向免疫擴散：定量雙向免疫擴散：檢測復(fù)雜抗原抗體、半定量免疫電泳：血清蛋白及抗體成分分析免疫酶技術(shù)（酶標(biāo)記）ELISA免疫組化：以組織或細胞為抗原間接法:已知抗原測抗體夾心法:已知抗體測抗原免疫熒光技術(shù):熒光素標(biāo)記同位素標(biāo)記技術(shù):同位素標(biāo)記抗原抗體反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補體參加的反應(yīng)免疫細胞的分離外周血（人）淋巴細胞分層液單個核細胞玻璃粘附法單核細胞淋巴細胞尼龍毛、E花結(jié)淘選、磁珠、流式T細胞B細胞淘選、磁珠、流式T細胞亞群（利用T細胞表面CD分子）免疫細胞的分離外周血（人）淋巴細胞分層液單個核細胞玻璃粘附法免疫細胞功能測定淋巴細胞功能測定吞噬細胞功能測定T細胞增殖試驗B細胞增殖試驗：細胞毒試驗3H-TdR摻入法MTT摻入法溶血空斑試驗51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法凋亡細胞檢測法形態(tài)學(xué)DNA-ladderTUNEL流式中性粒細胞趨化功能的測定中性粒細胞吞噬功能的測定巨噬細胞吞噬功能測定炭粒廓清試驗雞紅細胞吞噬試驗免疫細胞功能測定T細胞增殖試驗B細胞增殖試驗：細胞毒試驗3H四、重要免疫學(xué)檢測技術(shù)和新技術(shù)及其應(yīng)用介紹四、重要免疫學(xué)檢測技術(shù)和新技術(shù)及其應(yīng)用介紹抗體作為工具的治療和檢測方法細胞的分離和功能分子功能檢測

免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件（一）抗體作為工具的治療和檢測方法

抗體技術(shù)

ELISAWestern-blot

免疫沉淀免疫組織化學(xué)（一）抗體作為工具的治療和檢測方法抗體技術(shù)1.抗體技術(shù)抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段第一代：多克隆抗血清第二代：細胞工程抗體（單克隆抗體）第三代：基因工程抗體

1.抗體技術(shù)抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段（1）單克隆抗體技術(shù)原理

(1)B細胞能產(chǎn)生抗體，但不易在體外培養(yǎng)；

(2)骨髓瘤細胞能在體內(nèi)、外無限增殖，但不能分泌抗體；

(3)兩者形成的雜交瘤細胞即能大量增殖，又能合成和分泌特異性抗體。（1）單克隆抗體技術(shù)原理單克隆抗體的制備

制備單克隆抗體的方法是用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤細胞變異株與脾臟的B細胞融合。采用HAT選擇性培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中加次黃嘌呤，氨基喋呤及胸腺嘧啶核苷），變異的瘤細胞不具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺與尿核苷酸單磷酸合成DNA，這一途徑又被氨基喋呤所阻斷，所以未融合的瘤細胞不可避免也要死亡。

B淋巴細胞在一般培養(yǎng)基中不能長期生長，一般于二周內(nèi)均死亡。融合的雜交瘤細胞由于脾淋巴細胞具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶，可以通過次黃嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻斷，因此雜交瘤細胞大量繁殖而被篩選出來。單克隆抗體的制備免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件單克隆抗體與常規(guī)抗血清的性質(zhì)比較

單克隆抗體與常規(guī)抗血清的性質(zhì)比較（2）基因工程抗體類型嵌合抗體人源化抗體完全人源化抗體抗體分子片段新型抗體分子V區(qū)C區(qū)CDRVHCH1CH2CH3VLCLC端L鏈H鏈N端（2）基因工程抗體類型V區(qū)C區(qū)CDRVHCH1CH2CH3V嵌合抗體（chimericantibody）：在基因水平上將小鼠的Ig可變區(qū)與人的Ig恒定區(qū)嵌合在一起。

人源化抗體（humanizedantibody）：又稱CDR移植抗體（CDRgraftingantibody）即將針對某種抗原的鼠源特異性抗體超變區(qū)代替人的Ig超變區(qū)，所產(chǎn)生的抗體幾乎為人源的。鼠抗體人-鼠嵌合抗體

人源化抗體嵌合抗體（chimericantibody）：在基因水平上完全人源化抗體完全人源化抗體是指將人類抗體基因通過轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)，將人類編碼抗體的基因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達人類抗體，達到抗體全人源化的目的。方法：噬菌體抗體庫技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、基因工程小鼠制備法、轉(zhuǎn)染色體小鼠、抗體工程藥物標(biāo)聯(lián)及增效技術(shù)完全人源化抗體抗體分子片段：抗體分子的抗原結(jié)合部位局限在可變區(qū)組成的Fv段,保留抗體上的抗原特異性結(jié)合區(qū)域,構(gòu)建無Fc段、分子量較小、具抗原結(jié)合功能的分子片段的小分子抗體,其具有易于穿透血管壁和組織屏障進入病灶,有利于腫瘤的診斷和治療,免疫原性強,避免了Fc段與無關(guān)Fc受體結(jié)合所帶來的副作用,可作為載體分子偶聯(lián)多種活性蛋白基因如酶、毒素等用于疾病的導(dǎo)向性治療,且不需進行糖基化修飾,可在大腸桿菌中表達等特點。從而可改善其抗體的藥代動力學(xué)特性,并適合于臨床的應(yīng)用。

抗體分子片段：抗體分子的抗原結(jié)合部位局限在可變區(qū)組成的Fv①單鏈抗體（singlechainFv，scFv）

②二硫鍵穩(wěn)定的Fv(disulfide-stabilizedFv，ds-Fv)ds-FvscFvVHVLVLVHds-FvscFvVHVLVLVH③單域抗體（singledomainantibody）及分子識別單位（molecularrecognitionunit,MRU）即單個V區(qū)抗體。④多價抗體（multivalenantibody）和多特異抗體（mulit-specificantibody）是指含有多個共價結(jié)合的Fv，具有一種或多種特異性的基因工程抗體。

多價FvFv多特異Fv③單域抗體（singledomainantibody）及新型抗體分子將抗體分子的部分片段與抗體無關(guān)的序列相連接，或利用其可變區(qū)特異結(jié)合抗原特性的同時發(fā)揮其它的生物學(xué)活性；或利用Ig分子的恒定區(qū)某些功能特點來加強與其結(jié)合的功能分子生物活性。

Fc新型抗體分子Fc抗原化抗體（antigenantibody,AgAb）將具有編碼蛋白抗原表位的抗原基因片段植入抗體的超變區(qū)中，使肽鏈接近天然構(gòu)象，可模擬抗原分子使機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體。抗原化抗體（antigenantibody,AgAb）AphagemidvectorPhagemidvectorcontainingaleadersequence,afragmentofthegeneexpressingphagecoatprotein3andM13originofreplication.基因工程抗體的獲得常規(guī)的基因重組、表達技術(shù)通過轉(zhuǎn)基因動物通過噬菌體抗體庫技術(shù)AphagemidvectorPhagemidvect免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件單克隆抗體的臨床應(yīng)用

所治療的疾病：腫瘤、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病、器官移植、感染、心血管疾病等針對的抗原：細胞膜分子（CD分子、膜受體及粘附分子、腫瘤相關(guān)抗原）、細胞因子、獨特型、病毒單克隆抗體的臨床應(yīng)用免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件帕尼單抗（Panitumumab），即維克替比（Vectibix），安進公司帕尼單抗（Panitumumab），免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件國內(nèi)已經(jīng)獲批生產(chǎn)的單抗產(chǎn)品公司名稱商品名通用名適應(yīng)癥武漢生物制品研究所

注射用抗人T細胞CD3鼠單抗器官移植排異東莞宏逸士生物技術(shù)藥業(yè)

抗人白細胞介素/8單克隆抗體乳膏銀屑病恩博克大連亞維藥業(yè)

抗人白細胞介素/8單克隆抗體乳膏銀屑病上海中信國健藥業(yè)益賽普注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體/抗體融合蛋白類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等上海美恩生物技術(shù)唯美生碘[131I]腫瘤細胞核人鼠嵌合單克隆抗體注射液肝癌治療百泰生物藥業(yè)泰欣生尼妥珠單抗注射液結(jié)直腸癌上海賽金生物醫(yī)藥強克注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體/抗體融合蛋白強直性脊柱炎上海中信國健藥業(yè)健尼哌重組抗CD25人源化單克隆抗體注射液抗移植排斥國內(nèi)已經(jīng)獲批生產(chǎn)的單抗產(chǎn)品公司名稱商品名通用名適應(yīng)癥武2.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）將已知的抗原或抗體吸附于聚苯乙烯反應(yīng)板表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行。通過級聯(lián)放大作用，酶催化底物顯色可進行定性、定量分析微量的抗體或抗原。常用于標(biāo)記的酶為辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）。靈敏度高，特異性好，操作簡單，程序規(guī)范化。廣泛用于臨床疾病診斷。2.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）將已知的抗原或抗體吸附于間接ELISA夾心ELISA競爭ELISA左圖：酶標(biāo)板、移液器；右圖：酶標(biāo)儀間接ELISA左圖：酶標(biāo)板、移液器；右圖：酶標(biāo)儀間接ELISA：用于檢測液相中的抗體間接ELISA：用于檢測液相中的抗體競爭ELISA：用來測定小分子抗原

夾心ELISA：測定二價或二價以上的大分子抗原競爭ELISA：用來測定小分子抗原

夾心ELISA：測定二價3.免疫印跡法（Western-blot）先將抗原經(jīng)SDS電泳分開，再將分開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，然后放入含有抗體的液體中，洗去未結(jié)合抗體，再加標(biāo)記的二抗，通過顯色或發(fā)光顯示結(jié)果。3.免疫印跡法（Western-blot）先將抗原經(jīng)SDS免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件4.免疫沉淀法某些情況下，凝膠分離和印跡過程中抗原會降解，有些抗原表位會破壞，無法和特異抗體結(jié)合，此時，用免疫沉淀法可鑒定與抗體結(jié)合的抗原。該技術(shù)可用于可溶性抗原，也可用于細胞表面抗原的分析。待檢抗原用同位素標(biāo)記，加入抗體，使兩者特異結(jié)合，再加入共沉淀試劑，如proA等，使抗原抗體復(fù)合物沉淀下來，電泳后，固定膠經(jīng)放射自顯影，顯現(xiàn)特異標(biāo)記抗原所在的位置。4.免疫沉淀法某些情況下，凝膠分離和印跡過程中抗原會降解，免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件5.免疫組織化學(xué)用標(biāo)記的已知抗體與組織或細胞表面抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對抗原進行定性、定位或定量檢測的技術(shù)。常用方法：酶免疫組化（HRP等）免疫熒光技術(shù)（FITC、PE等）免疫金組化（膠體金）免疫電鏡技術(shù)（鐵蛋白、膠體金等）5.免疫組織化學(xué)用標(biāo)記的已知抗體與組織或細胞表面抗原發(fā)生反間接免疫熒光法檢測抗核抗體（Hep2細胞）間接免疫熒光法檢測抗核抗體（Hep2細胞）

免疫細胞的分離Ficoll的應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)流式細胞技術(shù)抗原特異性T細胞系的建立（二）細胞的分離和功能免疫細胞的分離（二）細胞的分離和功能

免疫細胞功能測定細胞增殖的檢測：3H-TdR摻入法、CFSE效應(yīng)細胞測定：ELISPOT細胞毒試驗Tetramer技術(shù)細胞凋亡的檢測：DNALadder、TUNEL、流式細胞技術(shù)（二）細胞的分離和功能免疫細胞功能測定（二）細胞的分離和功能1.淋巴細胞分層液（Ficoll）分離血細胞將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液（聚蔗糖-泛影葡胺）中即可配制成密度合適的分層液。不同動物血中的單個核細胞對分離液的密度要求各不相同。水平式離心后，離心管中會出現(xiàn)幾個不同層次的液體和細胞帶。BeforecentrifugeAftercentrifugemononuclearcells1.淋巴細胞分層液（Ficoll）分離血細胞將適量340g2.免疫磁珠分離技術(shù)將已知抗細胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)在磁性微珠上，與細胞懸液作用后置于磁場中，借磁力的作用將磁珠結(jié)合的細胞分開。2.免疫磁珠分離技術(shù)將已知抗細胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)在磁性微免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件3.流式細胞技術(shù)3.流式細胞技術(shù)基本概念流式細胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞）的多項特性，并加以定量的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量基本概念原理原理流式細胞術(shù)的特點極短時間內(nèi)可分析大量細胞，只要標(biāo)本中的細胞數(shù)量足夠，流式細胞儀（Flowcytometer）可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千個細胞的速率進行測量，測量的細胞總數(shù)可達數(shù)千、數(shù)萬乃至數(shù)百萬個。可同時分析單個細胞的多種特征，當(dāng)同時用多種分子探針，如用不同熒光素標(biāo)記的不同單克隆抗體進行多色熒光染色，通過流式細胞分析，即可獲得單細胞的多種信息，使細胞亞群的識別、計數(shù)更為準確。定性或定量分析細胞：通過熒光染色對單細胞的某些成分如DNA含量、抗原或受體表達量、酶活性以及細胞的功能等均可進行單細胞水平的定性與定量分析強大的分選功能，在分析的同時可以對特定群體加以分選流式細胞術(shù)的特點流式細胞儀的臨床應(yīng)用1.淋巴細胞免疫分型

淋巴細胞亞群分析2.細胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測3.免疫功能和免疫調(diào)控的研究淋巴細胞和單核細胞的活化檢測細胞因子的檢測CD4絕對計數(shù)、淋巴細胞CD4/CD8分析(HIV的診斷與研究)流式細胞儀的臨床應(yīng)用PE-CD19，F(xiàn)ITC-CD3抗體檢測淋巴細胞表型PE-CD19，F(xiàn)ITC-CD3抗體檢測淋巴細胞表型其他應(yīng)用：如細胞凋亡的分析、血液病、腫瘤及其基因表達產(chǎn)物的檢測、干細胞研究等。其他應(yīng)用：4.T細胞系的建立4.T細胞系的建立5.細胞增殖的檢測：3H-TdR摻入法、CFSE觀察在有絲分裂原（PHA、ConA）或特異性抗原刺激下T細胞的增殖反應(yīng)，測定細胞免疫功能。用3H-TdR法測T細胞增殖。5.細胞增殖的檢測：3H-TdR摻入法、CFSE觀察在有絲3H-TdR摻入法3H-TdR摻入法CFSE：羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-car-boxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,CFSE)是一種可穿過細胞膜的熒光染料,具有與細胞結(jié)合特異性的琥珀酰亞胺酯基團與具有非酶促水解作用的羧基熒光素二醋酸鹽基團結(jié)合在一起可使CFSE成為一種良好的細胞標(biāo)記物。CFSE進入細胞后可以不可逆地與細胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細胞蛋白質(zhì)上。細胞經(jīng)CFSE染色后,在分裂增殖的過程中,標(biāo)記的CFSE可平均分配到子代細胞中,使熒光在細胞分裂增殖過程中被逐漸稀釋,因而熒光強度逐漸減弱。即在1個增殖的細胞群中,各連續(xù)傳代細胞以熒光強度的1/2而遞減為特征。CFSE廣泛應(yīng)用于淋巴細胞的增殖試驗中。此外,它還可應(yīng)用于細胞移植、細胞分裂周期的估算及細胞分選等方面。CFSE：羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-car-免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件6.效應(yīng)細胞測定：ELISPOT產(chǎn)生特異抗體的單個B細胞或分泌特異細胞因子的單個T細胞通過ELISPOT測定。測定抗體生成細胞，將淋巴細胞加入抗原致敏的板中。產(chǎn)生的特異性抗體即與抗體產(chǎn)生細胞鄰近的抗原發(fā)生結(jié)合。利用偶聯(lián)在抗免疫球蛋白上的酶和顯色劑，結(jié)合抗體的斑點即可被檢測。測定細胞因子產(chǎn)生細胞的板用抗細胞因子抗體包被，捕獲的細胞因子用酶標(biāo)記的抗細胞因子不同表位的抗體來測定。6.效應(yīng)細胞測定：ELISPOT產(chǎn)生特異抗體的單個B細胞或免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件7.細胞毒試驗

CTL細胞通常測定它們裂解靶細胞的能力（如病毒感染細胞、腫瘤細胞等）。靶細胞裂解可由鉻釋放試驗測定。靶細胞和51Cr一起孵育，51Cr被攝入靶細胞與蛋白結(jié)合。孵育后，把靶細胞轉(zhuǎn)至培養(yǎng)板與效應(yīng)細胞共同培養(yǎng)4～16小時，取出上清，測量被效應(yīng)細胞裂解的靶細胞釋放的51Cr量。7.細胞毒試驗

CTL細胞通常測定它們裂解靶細胞的能力（如鉻釋放細胞毒試驗鉻釋放細胞毒試驗8.Tetramer技術(shù)

Tetramer技術(shù)可以在離體細胞中測定抗原特異的CTL細胞，而無需體外擴增。TCR識別的MHC-肽復(fù)合物直接染色抗原特異T細胞。TCR與MHC-肽復(fù)合物親和力低，迅速的解離無法進行直接染色。帶有4個MHC-肽復(fù)合物的MHC四聚體可極大地增加對TCR的親和力。將適當(dāng)?shù)腗HC分子與一個肽段（BSP）融合，可作為生物素的底物，MHC-BSP和β2微球蛋白在E.coli中表達，與CTL的特異表位肽段混合，形成的MHC-肽段復(fù)合物被純化獲取。生物素化的復(fù)合物與熒光標(biāo)記的親和素以4:1比例混合產(chǎn)生四聚體。這些標(biāo)記的四聚體與抗原特異CTL結(jié)合，通過FACS檢測。8.Tetramer技術(shù)

Tetramer技術(shù)可以在離體細免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件9.細胞凋亡的檢測細胞凋亡與細胞壞死是兩個不同的過程細胞凋亡的主要檢查手段形態(tài)學(xué)檢查Ladders實驗流式細胞儀檢查與凋亡相關(guān)的病理過程HIV自身免疫性疾病腫瘤9.細胞凋亡的檢測細胞凋亡與細胞壞死是兩個不同的過程細胞凋亡的生理意義在于：確保細胞正常發(fā)育和生長；維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；細胞發(fā)揮積極的防御功能。細胞凋亡和許多疾病密切相關(guān)：細胞凋亡不足：如腫瘤和自身免疫病；細胞凋亡過度：如心肌缺血、心力衰竭、神經(jīng)元退行性疾病和病毒感染；凋亡不足與過度并存：如動脈粥樣硬化。細胞凋亡的生理意義在于：細胞凋亡的主要表現(xiàn)細胞內(nèi)酶改變：Caspase-3活化細胞膜不對稱性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI細胞核DNA的斷裂改變：TUNNEL實驗凋亡相關(guān)蛋白：FasBcl-2細胞凋亡的主要表現(xiàn)(1)DNAladder凋亡細胞DNA可被核酸酶在核小體單位之間隨機切斷，產(chǎn)生180~200bp及其倍數(shù)的寡核苷酸片段，在瓊脂糖電泳中呈現(xiàn)階梯DNA區(qū)帶圖譜。(1)DNAladder凋亡細胞DNA可被核酸酶在核小體免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件(2)TUNEL（TdTdependentdUTP-biotinnickendlabeling)在細胞培養(yǎng)物中加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxyribonucleotidyl,TdT）和生物素標(biāo)記的核苷酸（dUTP），TdT能在游離的DNA3’端缺口連接標(biāo)記的核苷酸，利用生物素-親和素-酶（熒光）放大系統(tǒng)，在DNA斷裂處顯色，可標(biāo)示凋亡細胞。(2)TUNEL（TdTdependentdUTP-b免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件(3)

流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡凋亡細胞因核斷裂，呈亞二倍體，用FACS分析亞二倍體數(shù)目，可指示細胞凋亡程度；因凋亡細胞的細胞膜受損，膜磷脂成分暴露，可與熒光標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白（AnnexinV)結(jié)合，用FACS分析，可檢測懸浮細胞中凋亡細胞的頻率。PI-Fluorescence#Events正常G0/G1期細胞(3)流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡凋亡細胞因核斷裂，呈亞二倍體PIAnnexinV-FITCPIAnnexinV-FITC（三）分子功能檢測轉(zhuǎn)基因動物基因KnockoutRNAi技術(shù)（三）分子功能檢測轉(zhuǎn)基因動物1.轉(zhuǎn)基因動物將目的基因（或基因組片段）用顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵或著床前的胚胎細胞中，使目的基因整合到基因組中，然后將此受精卵或胚胎細胞再植入受體動物的輸卵管（或子宮）中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動物。1.轉(zhuǎn)基因動物將目的基因（或基因組片段）用顯微注射等方法注方法顯微注射法胚胎干細胞法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法方法顯微注射法對基因組織或階段特異表達的研究通過新表型，發(fā)現(xiàn)基因的新功能通過突變表型，發(fā)現(xiàn)新基因用于只在胚胎期才表達的基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究建立外源基因表達、調(diào)控的動物模型對遺傳疾病的研究建立人類疾病的動物模型,進而研究這些疾病的發(fā)病機理及治療方法

動物新品種的培育作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器應(yīng)用對基因組織或階段特異表達的研究應(yīng)用2.基因敲除基因敲除(Geneknockout)是借助分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和動物胚胎學(xué)的方法,通過胚胎干細胞（ES）這一特殊的中間環(huán)節(jié)將小鼠的正常功能基因的編碼區(qū)破壞,藉以揭示基因功能最直接的手段之一,因此成為后基因組時代的重要研究方法和內(nèi)容。通過DNA同源重組，使得ES細胞特定的內(nèi)源基因被破壞而造成其功能喪失，然后通過ES細胞介導(dǎo)得到該基因喪失的小鼠模型的過程。迄今為止,只有小鼠干細胞的建系方法最成熟、效果最穩(wěn)定,因此小鼠是目前基因敲除研究的唯一的實驗動物模型。2.基因敲除基因敲除(Geneknockout)是借免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件意義基因敲除與多種疾病的研究基因敲除與生物制藥意義基因敲除與多種疾病的研究3.RNAiRNAi是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種古老的、保守的生物途徑，是生物體適應(yīng)外界環(huán)境、調(diào)控基因表達、防止外來遺傳因子入侵的重要機制，具有重大的生物學(xué)意義。

RNAi現(xiàn)已成為國內(nèi)外研究的熱點，被《Science》評為2002年最重大科技突破。2006年的Nobel醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎授予了RNAi的提出者AndrewFire和CraigMello，從發(fā)現(xiàn)到獲獎僅8年時間。隨著對RNAi機制研究的深入和RNAi技術(shù)的不斷完善，RNAi有望成為治療病毒感染性疾病的新方法。3.RNAiRNAi是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種古老的、保守的生物第一步（起始階段）是較長dsRNA在ATP參與下被RNaseⅢ樣的特異核酸酶切割加工成21~23nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA的兩條單鏈末端為5’－磷酸和3’－羥基，且3’端均有２~3個突出的核苷酸。果蠅中的RNaseⅢ樣核酸酶稱為Dicer。Dicer有解旋酶活性并含有dsDNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)域。Dicer的類似物相繼在擬南芥、秀麗線蟲及哺乳動物等機體中被發(fā)現(xiàn)。

RNAi的作用機制第一步（起始階段）是較長dsRNA在ATP參與下被RNase第二步（效應(yīng)階段）是siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶等多種成分組成。活化的RISC在單鏈siRNA引導(dǎo)下識別互補的mRNA，并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導(dǎo)鏈中心所對應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶進一步降解，從而干擾基因表達。

第二步（效應(yīng)階段）是siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶應(yīng)用基因治療：RNAi作用的高度特異性有可能特異地抑制致病的突變等位基因，但又不影響正常的等位基因。腫瘤的基因治療：腫瘤是多個基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控異常的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單個癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計針對這一序列的dsRNA分子，只導(dǎo)入一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個基因同時沉默。應(yīng)用基因治療：RNAi作用的高度特異性有可能特異地抑制致病研究基因的功能：由于RNAi可以特異性抑制特定的基因，獲得功能喪失，因此可用于功能基因組的研究（類似Geneknockout)。防御病毒的感染：RNAi具有對抗侵入性遺傳因子（如病毒、轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)基因）的作用、打破其復(fù)制循環(huán)、減弱或消除其基因毒性作用。由于RNAi也存在于哺乳動物細胞中，RNAi或許可被利用來治療病毒性疾病。研究基因的功能：由于RNAi可以特異性抑制特定的基因，獲得考試題1.分別舉自身免疫病實例闡述Th細胞、B細胞和CTL在組織損傷中的作用。2.何謂宿主抗移植物反應(yīng)？闡述其臨床分型及其發(fā)生機制？3.試述單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用及其對免疫學(xué)發(fā)展的影響。4.考試（應(yīng)激反應(yīng)）后學(xué)生容易患感冒等病毒感染性疾病，（1）請運用免疫學(xué)知識和內(nèi)分泌知識推測其原因，（2）檢測哪些指標(biāo)可以證明你的推測？5.任選一種已在臨床上廣泛使用的細胞因子，說明其應(yīng)用范圍及作用機制。6.腫瘤免疫的基本特征是什么？答題說明：請回答如下問題，并將答案以手寫體完成于A4紙上（不可打?。⒚餍彰?、學(xué)號和班級。答卷10月11日前交到校本部階平樓292或291室。考試題1.分別舉自身免疫病實例闡述Th細胞、B細胞和CTL免疫學(xué)檢測新技術(shù)

及其臨床應(yīng)用

免疫學(xué)檢測新技術(shù)

及其臨床應(yīng)用主要內(nèi)容免疫學(xué)理論及技術(shù)研究和臨床免疫學(xué)檢測技術(shù)構(gòu)成重要免疫學(xué)檢測技術(shù)和新技術(shù)及其應(yīng)用介紹主要內(nèi)容免疫學(xué)理論及技術(shù)研究和臨床一、免疫學(xué)理論及技術(shù)

研究和臨床

一、免疫學(xué)理論及技術(shù)

研究和臨床

1796年，愛得華?琴納發(fā)明了牛痘疫苗從而保護人不得天花，WHO于1979年宣布天花滅絕。1796年，愛得華?琴納發(fā)明了牛痘疫苗從而保護人不得天花，W免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件1082011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎BruceA.BeutlerBorninUSAJulesA.HoffmannBorninLuxembourgRalphM.SteinmanBorninCanada證實Toll基因編碼產(chǎn)物在識別病原微生物激活免疫反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用發(fā)現(xiàn)LPS受體：一種Toll樣受體發(fā)現(xiàn)樹突細胞可激活T細胞引發(fā)免疫應(yīng)答72011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎BruceA.Beutl傳染病預(yù)防疾病治療免疫診斷免疫學(xué)理論及技術(shù)研究的臨床意義傳染病預(yù)防免疫學(xué)理論及技術(shù)研究的臨床意義接種疫苗預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎?WHO

接種疫苗預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎?WHO免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件已批準上市的細胞因子多肽藥物IFNα肝炎、白血病、AIDS、癌癥IFNγ類風(fēng)關(guān)，感染性疾病，慢性肉芽腫，過敏性皮炎G-CSF化療導(dǎo)致的粒細胞減少癥、再障、自身骨髓移植GM-CSF化療導(dǎo)致的血細胞減少癥、再障、自身骨髓移植EPO慢性腎衰所致貧血、癌癥或癌癥化療所致貧血、失血后貧血IL-2癌癥、免疫缺陷、疫苗佐劑IFN-β多發(fā)性硬化癥IL-11放化療所致的血小板減少癥SCF與G-CSF聯(lián)合應(yīng)用于外周血干細胞移植EGF燒傷、潰瘍(外用藥，在中國應(yīng)用)βFGF燒傷、外周神經(jīng)炎(外用藥，在中國應(yīng)用)已批準上市的細胞因子多肽藥物IFNα肝炎、白血病、AIDS、可溶性IL-1R(吸入劑）哮喘可溶性IL-1R(注射劑）急性髓樣白血病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可溶性IL-4R哮喘抗IL-4人源化抗體哮喘可溶性TNF-RII-Fc融合蛋白類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性心衰可溶性TNF-RI-Fc融合蛋白休克、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥人源化抗EGF-R2單抗乳腺癌抗TNF-α單抗局限性腸炎人源化抗IL-8抗體銀屑病細胞因子或其受體拮抗劑及其臨床應(yīng)用可溶性IL-1R(吸入劑）哮喘可溶性IL-1R(注射劑）急性二、免疫學(xué)技術(shù)構(gòu)成二、免疫學(xué)技術(shù)構(gòu)成基于抗原抗體反應(yīng)的檢測技術(shù)細胞免疫檢測技術(shù)基于抗原抗體反應(yīng)的檢測技術(shù)抗原抗體反應(yīng)的特點特異性一種抗原只能與其刺激機體產(chǎn)生的抗體結(jié)合，這種抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性稱特異性。可逆性抗原抗體主要通過分子表面的氫鍵、疏水鍵、靜電和范得華力非共價結(jié)合。可見性在一定范圍內(nèi)，抗原抗體比例合適時，可出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)物。階段性抗原抗體特異性結(jié)合階段；反應(yīng)可見階段。抗原抗體反應(yīng)的特點特異性第一抗體（一抗）：用已知抗原免疫人或動物后，機體會產(chǎn)生特異性抗體存在于血清中，這種抗體叫做一抗。第二抗體（二抗）：Ig具有同種型抗原特異性，將人Ig免疫動物，或?qū)游颕g免疫異種動物可制備出抗抗體，又稱二抗。第一抗體（一抗）：用已知抗原免疫人或動物后，機體會產(chǎn)生特異性抗原抗體反應(yīng)類型和檢測方法凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補體參加的反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)抗原抗體反應(yīng)類型和檢測方法凝集反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)

凝集反應(yīng)（顆粒性抗原）

沉淀反應(yīng)（可溶性抗原）

補體參加的反應(yīng)：溶血空斑實驗

免疫標(biāo)記技術(shù)直接凝集反應(yīng)玻片凝集：ABO血型鑒定試管凝集：肥達反應(yīng)間接凝集反應(yīng)：直接/間接Coombs試驗間接凝集抑制反應(yīng)：免疫妊娠診斷試驗單向免疫擴散：定量雙向免疫擴散：檢測復(fù)雜抗原抗體、半定量免疫電泳：血清蛋白及抗體成分分析免疫酶技術(shù)（酶標(biāo)記）ELISA免疫組化：以組織或細胞為抗原間接法:已知抗原測抗體夾心法:已知抗體測抗原免疫熒光技術(shù):熒光素標(biāo)記同位素標(biāo)記技術(shù):同位素標(biāo)記抗原抗體反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補體參加的反應(yīng)免疫細胞的分離外周血（人）淋巴細胞分層液單個核細胞玻璃粘附法單核細胞淋巴細胞尼龍毛、E花結(jié)淘選、磁珠、流式T細胞B細胞淘選、磁珠、流式T細胞亞群（利用T細胞表面CD分子）免疫細胞的分離外周血（人）淋巴細胞分層液單個核細胞玻璃粘附法免疫細胞功能測定淋巴細胞功能測定吞噬細胞功能測定T細胞增殖試驗B細胞增殖試驗：細胞毒試驗3H-TdR摻入法MTT摻入法溶血空斑試驗51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法凋亡細胞檢測法形態(tài)學(xué)DNA-ladderTUNEL流式中性粒細胞趨化功能的測定中性粒細胞吞噬功能的測定巨噬細胞吞噬功能測定炭粒廓清試驗雞紅細胞吞噬試驗免疫細胞功能測定T細胞增殖試驗B細胞增殖試驗：細胞毒試驗3H四、重要免疫學(xué)檢測技術(shù)和新技術(shù)及其應(yīng)用介紹四、重要免疫學(xué)檢測技術(shù)和新技術(shù)及其應(yīng)用介紹抗體作為工具的治療和檢測方法細胞的分離和功能分子功能檢測

免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件（一）抗體作為工具的治療和檢測方法

抗體技術(shù)

ELISAWestern-blot

免疫沉淀免疫組織化學(xué)（一）抗體作為工具的治療和檢測方法抗體技術(shù)1.抗體技術(shù)抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段第一代：多克隆抗血清第二代：細胞工程抗體（單克隆抗體）第三代：基因工程抗體

1.抗體技術(shù)抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段（1）單克隆抗體技術(shù)原理

(1)B細胞能產(chǎn)生抗體，但不易在體外培養(yǎng)；

(2)骨髓瘤細胞能在體內(nèi)、外無限增殖，但不能分泌抗體；

(3)兩者形成的雜交瘤細胞即能大量增殖，又能合成和分泌特異性抗體。（1）單克隆抗體技術(shù)原理單克隆抗體的制備

制備單克隆抗體的方法是用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤細胞變異株與脾臟的B細胞融合。采用HAT選擇性培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中加次黃嘌呤，氨基喋呤及胸腺嘧啶核苷），變異的瘤細胞不具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺與尿核苷酸單磷酸合成DNA，這一途徑又被氨基喋呤所阻斷，所以未融合的瘤細胞不可避免也要死亡。

B淋巴細胞在一般培養(yǎng)基中不能長期生長，一般于二周內(nèi)均死亡。融合的雜交瘤細胞由于脾淋巴細胞具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶，可以通過次黃嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻斷，因此雜交瘤細胞大量繁殖而被篩選出來。單克隆抗體的制備免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件單克隆抗體與常規(guī)抗血清的性質(zhì)比較

單克隆抗體與常規(guī)抗血清的性質(zhì)比較（2）基因工程抗體類型嵌合抗體人源化抗體完全人源化抗體抗體分子片段新型抗體分子V區(qū)C區(qū)CDRVHCH1CH2CH3VLCLC端L鏈H鏈N端（2）基因工程抗體類型V區(qū)C區(qū)CDRVHCH1CH2CH3V嵌合抗體（chimericantibody）：在基因水平上將小鼠的Ig可變區(qū)與人的Ig恒定區(qū)嵌合在一起。

人源化抗體（humanizedantibody）：又稱CDR移植抗體（CDRgraftingantibody）即將針對某種抗原的鼠源特異性抗體超變區(qū)代替人的Ig超變區(qū)，所產(chǎn)生的抗體幾乎為人源的。鼠抗體人-鼠嵌合抗體

人源化抗體嵌合抗體（chimericantibody）：在基因水平上完全人源化抗體完全人源化抗體是指將人類抗體基因通過轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)，將人類編碼抗體的基因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達人類抗體，達到抗體全人源化的目的。方法：噬菌體抗體庫技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、基因工程小鼠制備法、轉(zhuǎn)染色體小鼠、抗體工程藥物標(biāo)聯(lián)及增效技術(shù)完全人源化抗體抗體分子片段：抗體分子的抗原結(jié)合部位局限在可變區(qū)組成的Fv段,保留抗體上的抗原特異性結(jié)合區(qū)域,構(gòu)建無Fc段、分子量較小、具抗原結(jié)合功能的分子片段的小分子抗體,其具有易于穿透血管壁和組織屏障進入病灶,有利于腫瘤的診斷和治療,免疫原性強,避免了Fc段與無關(guān)Fc受體結(jié)合所帶來的副作用,可作為載體分子偶聯(lián)多種活性蛋白基因如酶、毒素等用于疾病的導(dǎo)向性治療,且不需進行糖基化修飾,可在大腸桿菌中表達等特點。從而可改善其抗體的藥代動力學(xué)特性,并適合于臨床的應(yīng)用。

抗體分子片段：抗體分子的抗原結(jié)合部位局限在可變區(qū)組成的Fv①單鏈抗體（singlechainFv，scFv）

②二硫鍵穩(wěn)定的Fv(disulfide-stabilizedFv，ds-Fv)ds-FvscFvVHVLVLVHds-FvscFvVHVLVLVH③單域抗體（singledomainantibody）及分子識別單位（molecularrecognitionunit,MRU）即單個V區(qū)抗體。④多價抗體（multivalenantibody）和多特異抗體（mulit-specificantibody）是指含有多個共價結(jié)合的Fv，具有一種或多種特異性的基因工程抗體。

多價FvFv多特異Fv③單域抗體（singledomainantibody）及新型抗體分子將抗體分子的部分片段與抗體無關(guān)的序列相連接，或利用其可變區(qū)特異結(jié)合抗原特性的同時發(fā)揮其它的生物學(xué)活性；或利用Ig分子的恒定區(qū)某些功能特點來加強與其結(jié)合的功能分子生物活性。

Fc新型抗體分子Fc抗原化抗體（antigenantibody,AgAb）將具有編碼蛋白抗原表位的抗原基因片段植入抗體的超變區(qū)中，使肽鏈接近天然構(gòu)象，可模擬抗原分子使機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體?？乖贵w（antigenantibody,AgAb）AphagemidvectorPhagemidvectorcontainingaleadersequence,afragmentofthegeneexpressingphagecoatprotein3andM13originofreplication.基因工程抗體的獲得常規(guī)的基因重組、表達技術(shù)通過轉(zhuǎn)基因動物通過噬菌體抗體庫技術(shù)AphagemidvectorPhagemidvect免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件單克隆抗體的臨床應(yīng)用

所治療的疾病：腫瘤、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病、器官移植、感染、心血管疾病等針對的抗原：細胞膜分子（CD分子、膜受體及粘附分子、腫瘤相關(guān)抗原）、細胞因子、獨特型、病毒單克隆抗體的臨床應(yīng)用免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件帕尼單抗（Panitumumab），即維克替比（Vectibix），安進公司帕尼單抗（Panitumumab），免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件國內(nèi)已經(jīng)獲批生產(chǎn)的單抗產(chǎn)品公司名稱商品名通用名適應(yīng)癥武漢生物制品研究所

注射用抗人T細胞CD3鼠單抗器官移植排異東莞宏逸士生物技術(shù)藥業(yè)

抗人白細胞介素/8單克隆抗體乳膏銀屑病恩博克大連亞維藥業(yè)

抗人白細胞介素/8單克隆抗體乳膏銀屑病上海中信國健藥業(yè)益賽普注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體/抗體融合蛋白類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等上海美恩生物技術(shù)唯美生碘[131I]腫瘤細胞核人鼠嵌合單克隆抗體注射液肝癌治療百泰生物藥業(yè)泰欣生尼妥珠單抗注射液結(jié)直腸癌上海賽金生物醫(yī)藥強克注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體/抗體融合蛋白強直性脊柱炎上海中信國健藥業(yè)健尼哌重組抗CD25人源化單克隆抗體注射液抗移植排斥國內(nèi)已經(jīng)獲批生產(chǎn)的單抗產(chǎn)品公司名稱商品名通用名適應(yīng)癥武2.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）將已知的抗原或抗體吸附于聚苯乙烯反應(yīng)板表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行。通過級聯(lián)放大作用，酶催化底物顯色可進行定性、定量分析微量的抗體或抗原。常用于標(biāo)記的酶為辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）。靈敏度高，特異性好，操作簡單，程序規(guī)范化。廣泛用于臨床疾病診斷。2.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）將已知的抗原或抗體吸附于間接ELISA夾心ELISA競爭ELISA左圖：酶標(biāo)板、移液器；右圖：酶標(biāo)儀間接ELISA左圖：酶標(biāo)板、移液器；右圖：酶標(biāo)儀間接ELISA：用于檢測液相中的抗體間接ELISA：用于檢測液相中的抗體競爭ELISA：用來測定小分子抗原

夾心ELISA：測定二價或二價以上的大分子抗原競爭ELISA：用來測定小分子抗原

夾心ELISA：測定二價3.免疫印跡法（Western-blot）先將抗原經(jīng)SDS電泳分開，再將分開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，然后放入含有抗體的液體中，洗去未結(jié)合抗體，再加標(biāo)記的二抗，通過顯色或發(fā)光顯示結(jié)果。3.免疫印跡法（Western-blot）先將抗原經(jīng)SDS免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件4.免疫沉淀法某些情況下，凝膠分離和印跡過程中抗原會降解，有些抗原表位會破壞，無法和特異抗體結(jié)合，此時，用免疫沉淀法可鑒定與抗體結(jié)合的抗原。該技術(shù)可用于可溶性抗原，也可用于細胞表面抗原的分析。待檢抗原用同位素標(biāo)記，加入抗體，使兩者特異結(jié)合，再加入共沉淀試劑，如proA等，使抗原抗體復(fù)合物沉淀下來，電泳后，固定膠經(jīng)放射自顯影，顯現(xiàn)特異標(biāo)記抗原所在的位置。4.免疫沉淀法某些情況下，凝膠分離和印跡過程中抗原會降解，免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件5.免疫組織化學(xué)用標(biāo)記的已知抗體與組織或細胞表面抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對抗原進行定性、定位或定量檢測的技術(shù)。常用方法：酶免疫組化（HRP等）免疫熒光技術(shù)（FITC、PE等）免疫金組化（膠體金）免疫電鏡技術(shù)（鐵蛋白、膠體金等）5.免疫組織化學(xué)用標(biāo)記的已知抗體與組織或細胞表面抗原發(fā)生反間接免疫熒光法檢測抗核抗體（Hep2細胞）間接免疫熒光法檢測抗核抗體（Hep2細胞）

免疫細胞的分離Ficoll的應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)流式細胞技術(shù)抗原特異性T細胞系的建立（二）細胞的分離和功能免疫細胞的分離（二）細胞的分離和功能

免疫細胞功能測定細胞增殖的檢測：3H-TdR摻入法、CFSE效應(yīng)細胞測定：ELISPOT細胞毒試驗Tetramer技術(shù)細胞凋亡的檢測：DNALadder、TUNEL、流式細胞技術(shù)（二）細胞的分離和功能免疫細胞功能測定（二）細胞的分離和功能1.淋巴細胞分層液（Ficoll）分離血細胞將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液（聚蔗糖-泛影葡胺）中即可配制成密度合適的分層液。不同動物血中的單個核細胞對分離液的密度要求各不相同。水平式離心后，離心管中會出現(xiàn)幾個不同層次的液體和細胞帶。BeforecentrifugeAftercentrifugemononuclearcells1.淋巴細胞分層液（Ficoll）分離血細胞將適量340g2.免疫磁珠分離技術(shù)將已知抗細胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)在磁性微珠上，與細胞懸液作用后置于磁場中，借磁力的作用將磁珠結(jié)合的細胞分開。2.免疫磁珠分離技術(shù)將已知抗細胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)在磁性微免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件3.流式細胞技術(shù)3.流式細胞技術(shù)基本概念流式細胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞）的多項特性，并加以定量的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量基本概念原理原理流式細胞術(shù)的特點極短時間內(nèi)可分析大量細胞，只要標(biāo)本中的細胞數(shù)量足夠，流式細胞儀（Flowcytometer）可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千個細胞的速率進行測量，測量的細胞總數(shù)可達數(shù)千、數(shù)萬乃至數(shù)百萬個?？赏瑫r分析單個細胞的多種特征，當(dāng)同時用多種分子探針，如用不同熒光素標(biāo)記的不同單克隆抗體進行多色熒光染色，通過流式細胞分析，即可獲得單細胞的多種信息，使細胞亞群的識別、計數(shù)更為準確。定性或定量分析細胞：通過熒光染色對單細胞的某些成分如DNA含量、抗原或受體表達量、酶活性以及細胞的功能等均可進行單細胞水平的定性與定量分析強大的分選功能，在分析的同時可以對特定群體加以分選流式細胞術(shù)的特點流式細胞儀的臨床應(yīng)用1.淋巴細胞免疫分型

淋巴細胞亞群分析2.細胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測3.免疫功能和免疫調(diào)控的研究淋巴細胞和單核細胞的活化檢測細胞因子的檢測CD4絕對計數(shù)、淋巴細胞CD4/CD8分析(HIV的診斷與研究)流式細胞儀的臨床應(yīng)用PE-CD19，F(xiàn)ITC-CD3抗體檢測淋巴細胞表型PE-CD19，F(xiàn)ITC-CD3抗體檢測淋巴細胞表型其他應(yīng)用：如細胞凋亡的分析、血液病、腫瘤及其基因表達產(chǎn)物的檢測、干細胞研究等。其他應(yīng)用：4.T細胞系的建立4.T細胞系的建立5.細胞增殖的檢測：3H-TdR摻入法、CFSE觀察在有絲分裂原（PHA、ConA）或特異性抗原刺激下T細胞的增殖反應(yīng)，測定細胞免疫功能。用3H-TdR法測T細胞增殖。5.細胞增殖的檢測：3H-TdR摻入法、CFSE觀察在有絲3H-TdR摻入法3H-TdR摻入法CFSE：羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-car-boxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,CFSE)是一種可穿過細胞膜的熒光染料,具有與細胞結(jié)合特異性的琥珀酰亞胺酯基團與具有非酶促水解作用的羧基熒光素二醋酸鹽基團結(jié)合在一起可使CFSE成為一種良好的細胞標(biāo)記物。CFSE進入細胞后可以不可逆地與細胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細胞蛋白質(zhì)上。細胞經(jīng)CFSE染色后,在分裂增殖的過程中,標(biāo)記的CFSE可平均分配到子代細胞中,使熒光在細胞分裂增殖過程中被逐漸稀釋,因而熒光強度逐漸減弱。即在1個增殖的細胞群中,各連續(xù)傳代細胞以熒光強度的1/2而遞減為特征。CFSE廣泛應(yīng)用于淋巴細胞的增殖試驗中。此外,它還可應(yīng)用于細胞移植、細胞分裂周期的估算及細胞分選等方面。CFSE：羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-car-免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件6.效應(yīng)細胞測定：ELISPOT產(chǎn)生特異抗體的單個B細胞或分泌特異細胞因子的單個T細胞通過ELISPOT測定。測定抗體生成細胞，將淋巴細胞加入抗原致敏的板中。產(chǎn)生的特異性抗體即與抗體產(chǎn)生細胞鄰近的抗原發(fā)生結(jié)合。利用偶聯(lián)在抗免疫球蛋白上的酶和顯色劑，結(jié)合抗體的斑點即可被檢測。測定細胞因子產(chǎn)生細胞的板用抗細胞因子抗體包被，捕獲的細胞因子用酶標(biāo)記的抗細胞因子不同表位的抗體來測定。6.效應(yīng)細胞測定：ELISPOT產(chǎn)生特異抗體的單個B細胞或免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件7.細胞毒試驗

CTL細胞通常測定它們裂解靶細胞的能力（如病毒感染細胞、腫瘤細胞等）。靶細胞裂解可由鉻釋放試驗測定。靶細胞和51Cr一起孵育，51Cr被攝入靶細胞與蛋白結(jié)合。孵育后，把靶細胞轉(zhuǎn)至培養(yǎng)板與效應(yīng)細胞共同培養(yǎng)4～16小時，取出上清，測量被效應(yīng)細胞裂解的靶細胞釋放的51Cr量。7.細胞毒試驗

CTL細胞通常測定它們裂解靶細胞的能力（如鉻釋放細胞毒試驗鉻釋放細胞毒試驗8.Tetramer技術(shù)

Tetramer技術(shù)可以在離體細胞中測定抗原特異的CTL細胞，而無需體外擴增。TCR識別的MHC-肽復(fù)合物直接染色抗原特異T細胞。TCR與MHC-肽復(fù)合物親和力低，迅速的解離無法進行直接染色。帶有4個MHC-肽復(fù)合物的MHC四聚體可極大地增加對TCR的親和力。將適當(dāng)?shù)腗HC分子與一個肽段（BSP）融合，可作為生物素的底物，MHC-BSP和β2微球蛋白在E.coli中表達，與CTL的特異表位肽段混合，形成的MHC-肽段復(fù)合物被純化獲取。生物素化的復(fù)合物與熒光標(biāo)記的親和素以4:1比例混合產(chǎn)生四聚體。這些標(biāo)記的四聚體與抗原特異CTL結(jié)合，通過FACS檢測。8.Tetramer技術(shù)

Tetramer技術(shù)可以在離體細免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件9.細胞凋亡的檢測細胞凋亡與細胞壞死是兩個不同的過程細胞凋亡的主要檢查手段形態(tài)學(xué)檢查Ladders實驗流式細胞儀檢查與凋亡相關(guān)的病理過程HIV自身免疫性疾病腫瘤9.細胞凋亡的檢測細胞凋亡與細胞壞死是兩個不同的過程細胞凋亡的生理意義在于：確保細胞正常發(fā)育和生長；維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；細胞發(fā)揮積極的防御功能。細胞凋亡和許多疾病密切相關(guān)：細胞凋亡不足：如腫瘤和自身免疫病；細胞凋亡過度：如心肌缺血、心力衰竭、神經(jīng)元退行性疾病和病毒感染；凋亡不足與過度并存：如動脈粥樣硬化。細胞凋亡的生理意義在于：細胞凋亡的主要表現(xiàn)細胞內(nèi)酶改變：Caspase-3活化細胞膜不對稱性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI細胞核DNA的斷裂改變：TUNNEL實驗凋亡相關(guān)蛋白：FasBcl-2細胞凋亡的主要表現(xiàn)(1)DNAladder凋亡細胞DNA可被核酸酶在核小體單位之間隨機切斷，產(chǎn)生180~200bp及其倍數(shù)的寡核苷酸片段，在瓊脂糖電泳中呈現(xiàn)階梯DNA區(qū)帶圖譜。(1)DNAladder凋亡細胞DNA可被核酸酶在核小體免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件(2)TUNEL（TdTdependentdUTP-biotinnickendlabeling)在細胞培養(yǎng)物中加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxyribonucleotidyl,TdT）和生物素標(biāo)記的核苷酸（dUTP），TdT能在游離的DNA3’端缺口連接標(biāo)記的核苷酸，利用生物素-親和素-酶（熒光）放大系統(tǒng)，在DNA斷裂處顯色，可標(biāo)示凋亡細胞。(2)TUNEL（TdTdependentdUTP-b免疫學(xué)新技術(shù)及其臨床應(yīng)用講稿課件(3)

流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡凋亡細胞因核斷裂，呈亞二倍體，用FACS分析亞二倍體數(shù)目，可指示細胞凋亡程度；因凋亡細胞的細胞膜受損，膜磷脂成分暴露，可與熒光標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白（AnnexinV)結(jié)合，用FACS分析，可檢測懸浮細胞中凋亡細胞的頻率。PI-Fluorescence#Events正常G0/G1期細胞(3)流式細胞技術(shù)檢測