AMF和PGPR對番茄生長和土壤中甲胺磷殘留量的影響

AMF和PGPR修復甲胺磷污染土壤的效應*徐麗娟1張金政1袁玉清2李敏1劉潤進1?（1青島農(nóng)業(yè)大學菌根生物技術(shù)研究所，山東青島266109）青島農(nóng)業(yè)大學中心實驗室，山東青島266109）摘要叢枝菌根真菌（arbuscularmycorrhizalfungi,AMF）和根圍促生細菌（plantgrowth-promotingrhizobacteria,PGPR）能降解有毒有機物，但分解土壤中殘留甲胺磷農(nóng)藥尚未見報道。本試驗旨在測定AMF和PGPR礦化甲胺磷的效應。試驗設甲胺磷0、50、100和150μgg-1下，對番茄（Lycospersiconesculentum，品種金冠）接種AMFGlomusmosseae（Gm）、Glomusetunicatum（Ge）、PGPRBacillussubtilis（Bs）、Bacillussp.B697（Bsp）、Pseudomonasfluorescens（Pf）、Gm+Bs、Gm+Bsp、Gm+Pf、Ge+Bs、Ge+Bsp、Ge+Pf和不接種對照，共48個處理。結(jié)果表明，接種Gm顯著增加了根區(qū)土壤和根內(nèi)PGPR定殖數(shù)量，而Pf處理顯著提高了AMF侵染率，表明Gm與Pf能夠相互促進。甲胺磷100μgg-1水平下，Gm+Pf處理的番茄株高顯著高于其他處理，地上部干重顯著高于其他處理（Ge+Pf除外），根系干重顯著高于對照、PGPR各處理和Ge處理；而根內(nèi)甲胺磷濃度則顯著低于其他處理，莖葉中的則顯著低于其他處理（Gm+Bs、Gm+Bsp和Ge+Pf除外）。AMF、PGPR或AMF+PGPR處理均顯著降低番茄體內(nèi)甲胺磷濃度。甲胺磷50~100μgg-1水平下，Gm+Pf顯著降低根區(qū)土壤中甲胺磷殘留量，礦化率達52%~60.6%。AMF和PGPR顯著提高了根區(qū)土壤中甲胺脫氫酶活性，其中以Gm+Pf組合處理的酶活性最高。表明AMF和PGPR均能促進土壤中殘留甲胺磷的降解，Gm+Pf是本試驗條件下的最佳組合。關(guān)鍵詞叢枝菌根真菌；根圍促生細菌；甲胺磷；農(nóng)藥；土壤污染；菌根修復中圖分類號Q939.96;X53;X592文獻標識碼A我國已禁止大量高毒農(nóng)藥的使用，但當前土壤中仍有多種農(nóng)藥殘留[1]。如何修復農(nóng)藥污染的土壤是擺在我們面前亟待解決的問題之一。業(yè)已證實，叢枝菌根真菌（arbuscularmycorrhizalfungi,AMF）能促進植物吸收養(yǎng)分，減輕有害鹽類和農(nóng)藥等對植物造成的危害，改善土壤結(jié)構(gòu)，修復污染土壤，提高寄主植物抗逆性[2-4]。AMF不僅具有一定分解有機物的代謝功能[5]，而且可增強植物對農(nóng)藥的耐受性，降低土壤中農(nóng)藥殘留量[6-9]。表明AMF具有潛在的降解土壤中殘留農(nóng)藥的生理生態(tài)作用，這對于保護環(huán)境和食品安全生產(chǎn)是十分有意義的[10]。然而，AMF分解有毒有機物的效應具有一定局限性。如何加強AMF的降解效應，實現(xiàn)實際應用意義重大。在探索促進AMF功能的研究中，人們注意到根圍促生細菌（plantgrowth-promotingrhizobacteria,PGPR）不僅具有降解有毒有機物、修復污染土壤的作用[11-12]，例如，在液體__________________*國家自然科學基金項目（31272210）和山東省科技發(fā)展計劃（2012GNC11010）資助?通訊作者Correspondingauthor，E-mail:liurjsswwl@126.com作者簡介：徐麗娟（1963-），女，山東煙臺萊州人，高級實驗師，主要從事菌根學和植物生物學研究。E-mail:Lijuan.xu@收稿日期：2015-10-和土壤中BacillussubtilisGB03、BacillussubtilisFZB24、BacillusamyloliquefaciensIN937a和BacilluspumilusSE34均能不同程度降解苯并噻二唑（acibenzolar-S-methyl）、賽克津（草克凈,metribuzin）、敵草胺（napropamide）、霜霉威鹽酸鹽（propamocarbhydrochloride）和噻蟲嗪（thiamethoxam）[13]。而且，一定條件下PGPR與AMF能相互促進定殖、協(xié)同改善土壤理化特性、活化土壤養(yǎng)分、改善植物營養(yǎng)、抑制病原物和促進植物生長[14]，并能聯(lián)合修復污染環(huán)境[15]。秦華等[16]觀察到Acaulosporalaevis90034、Bacillussp.DW1和Gordoniasp.DH3單獨及組合接種處理均能顯著促進土壤中鄰苯二甲酸二異辛酯（DEHP）的降解；而苜蓿根瘤細菌（Rhizobiummeliloti）則顯著增強了AMFGlomuscaledonium對多氯聯(lián)苯（PCBs）的降解效應[17]。這表明通過接種細菌可提高AMF修復效果,同時也為PGPR聯(lián)合AMF協(xié)同分解土壤中殘留農(nóng)藥奠定了理論依據(jù)。基于根圍AMF較其他微生物在生態(tài)位及其生物量上占據(jù)絕對優(yōu)勢[18]，AMF很可能與其他有益生物協(xié)同發(fā)揮降解有機磷農(nóng)藥的作用,而值得進一步試驗。甲胺磷是我國以往常用的有機磷農(nóng)藥,土壤中的殘留量較高。針對該殘留農(nóng)藥的降解，劉茵等[19]觀察到AMF對甲胺磷農(nóng)藥的耐受性較強，AMF促進了番茄對磷的吸收和植株生長。據(jù)此他們推測AMF侵染產(chǎn)生的根圍效應促進了土壤中甲胺磷農(nóng)藥的礦化，并轉(zhuǎn)化為AMF和番茄植株的養(yǎng)分源，從而降低了甲胺磷農(nóng)藥對土壤的污染程度。然而,并未給出相應的試驗結(jié)果以支持這一推斷。因此，AMF能否促進甲胺磷的礦化尚待證實?；谝陨涎芯窟M展，筆者提出AMF與PGPR之間相互作用所構(gòu)成的菌根圍過程中，AMF發(fā)揮關(guān)鍵作用，PGPR則增強AMF分解農(nóng)藥的效應的假設。本試驗目的是評價土壤中甲胺磷不同水平下AMF與PGPR的相互作用及其協(xié)同礦化甲胺磷的效應，為進一步探索AMF和PGPR分解土壤中殘留農(nóng)藥、修復污染土壤的作用機制與技術(shù)奠定基礎。1材料與方法1.1供試材料AMF菌種Glomusmosseae（Gm）和Glomusetunicatum（Ge）由澳大利亞西澳大學LynAbbott教授提供，以保存在煙草根系及其培養(yǎng)基質(zhì)中的孢子、菌絲和菌根根段作為接種物。PGPR菌種Bacillussubtilis（Bs）、Bacillussp.B697（Bsp）和Pseudomonasfluorescens（Pf）由本研究所自三葉草和苜蓿根圍分離、鑒定和保存。采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、蒸餾水1000ml、pH7.2～7.4）和無機鹽培養(yǎng)基（K2HPO41g、KH2PO41g、MgSO4·H2O0.5g、NH4NO31g、CaCl20.02g、FeCl3微量、pH7～7.2）培養(yǎng)PGPR菌種備用。番茄（Lycospersiconesculentum）品種金冠由濟南市日出種業(yè)有限責任公司生產(chǎn)。番茄種子用0.1%的升汞溶液浸泡10min后用清水洗凈，再用60℃的溫水浸種15min及清水浸種12h后，于25～28℃恒溫箱內(nèi)催芽備用。甲胺磷農(nóng)藥（90%），安徽康達化工有限公司生產(chǎn)。供試砂壤土pH7.9、有機質(zhì)9.47gkg-1、全氮0.81gkg-1、速效磷10.2mgkg-1、速效鉀84mgkg-1。采自非農(nóng)田的自然荒地，經(jīng)分析測定該土壤未檢出甲胺磷。土壤風干、過篩（1mm）和滅菌（121℃，1h）后備用。1.2試驗設計采用溫室盆栽試驗，設甲胺磷水平0、50、100、150μgg-1下，分別接種AMFGm、Ge、PGPRBs、Bsp、Pf、Gm+Bs、Gm+Bsp、Gm+Pf、Ge+Bs、Ge+Bsp、Ge+Pf和不接種對照，共48個處理，隨機排列，重復5次。同時，另設不播種不接種空白對照，只分別施加50、100和150μgg-1甲胺磷，以檢測試驗條件下農(nóng)藥的自然降解數(shù)量。所測定的各處理土壤中的甲胺磷濃度為減去自然降解數(shù)量后的濃度。1.3農(nóng)藥處理、接種與管理將上述滅菌土裝入陶盆（30cm×20cm），每盆5kg，按設計的甲胺磷處理濃度，將其混入土壤中。接種AMF的處理則每盆加入50g接種物，不接種對照則加入等量的生長在滅菌基質(zhì)中的煙草根系及其培養(yǎng)基質(zhì)，以保持相同的其他根圍微生物區(qū)系。然后，將兩粒萌芽種子播入盆內(nèi)。根據(jù)溫室濕度、光照和溫度狀況進行人工調(diào)控，以保證出苗整齊，生長健壯。出苗后每盆留苗1棵，于2~3片葉幼苗期采用灌根法接種PGPR每盆10ml菌液（107cfuml-1菌液）。根據(jù)培養(yǎng)基質(zhì)肥力水平和植株生長需要于中后期適當補充30%的Hoagland營養(yǎng)液。接種PGPR處理2、4、6、9和17d后，采集根區(qū)土壤測定施加甲胺磷100μgg-1水平下各處理甲胺脫氫酶活性；于接種PGPR處理35d后測定AMF侵染狀況、根區(qū)土壤和根內(nèi)PGPR著生數(shù)量；于播種后3個月測定根區(qū)土壤中甲胺磷濃度。1.4測定指標與方法根據(jù)Liu和Luo[20]改進的根段頻率估測方法測定AMF侵染率、叢枝著生率、泡囊數(shù)和侵入點數(shù)；以濕篩傾注-蔗糖離心法測定單位質(zhì)量或體積根區(qū)土壤中孢子數(shù)量[21]；以Bashan等[22]、趙斌和何紹江[23]描述的方法測定單位質(zhì)量根區(qū)土壤中和根系上PGPR有效菌落數(shù)量。甲胺磷濃度按照GB/T5009.145-2003（中華人民共和國衛(wèi)生部和中國國家標準化管理委員會,2003）進行檢測。土壤甲胺磷檢測采用氣相色譜法，采用外標（峰面積）定量法定量，保留時間定性。具體過程如下：樣品前處理：稱取通過5mm篩土壤5g置入100ml離心管，加丙酮20ml，然后置于超聲波清洗器中超聲15min，3600rmin-1離心5min后將上清液倒入分液漏斗，并用少量丙酮沖洗殘留樣品。合并丙酮液，用30、15、15ml二氯甲烷萃取3次，轉(zhuǎn)移至燒瓶中（無水硫酸鈉脫水），N2吹至近干，用丙酮定容至10ml，待測。儀器條件：VarianGC3800氣相色譜儀；進樣口溫度230℃，檢測器溫度300℃；載氣為高純N2（99.999%），恒流1.5mlmin-1；色譜柱為HP-1（30m×0.53mm×0.88μm）石英毛細柱，程序升溫測定，在80℃保持1min，以15℃min-1的升溫速率升至170℃保持1min，然后以10℃min-1升至235℃保持5min。甲胺磷礦化率（%）=（C0-C1）/C0×100%，其中，C0、C1分別為初始及反應結(jié)束時的甲胺磷濃度（μg·g-1）。甲胺脫氫酶酶活性按Kiriukhin等[24]方法測定。一個酶活力單位定義為每分鐘減少1μmol2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）所需的酶量。DCPIP在pH7.5時，克分子消光系數(shù)為21.5×103。1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析應用DPS7.05軟件（杭州睿豐信息技術(shù)有限公司）對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用雙因素方差分析（two-wayANOVA）、多因素方差分析和LSD多重比較。2結(jié)果2.1土壤中不同甲胺磷水平下AMF對PGPR定殖數(shù)量的影響研究結(jié)果表明，50~100μgg-1甲胺磷水平下不影響PGPR定殖數(shù)量，接種Ge和Gm處理均顯著增加了PGPR的定殖數(shù)量；而150μgg-1下則降低PGPR數(shù)量，只有Gm處理顯著提高了Pf的定殖數(shù)量；而且接種PGPR、AMF與施加不同濃度甲胺磷三因子間存在互作（表1）。表1土壤中不同甲胺磷水平下AMF對根區(qū)土壤和根內(nèi)PGPR定殖數(shù)量（×107cfug-1）的影響Table1EffectsofAMFoninoculationofPGPR(×107cfug-1)intherhizosphericsoilandrootsrelativetoconcentrationofmethamidophosinthesoil處理Treatments根區(qū)土壤Rootzonesoil根內(nèi)Inroots甲胺磷水平Methamidophoslevels(μgg-1)接種Inoculation0Bs枯草芽胞桿菌3.20±0.23jklmn1.37±0.09hijBsp芽胞桿菌B697菌株2.80±0.06klmno0.80±0.06jklmnPf熒光假單胞菌4.50±0.06hij2.57±0.20efGm+Bs摩西球囊霉+枯草芽胞桿菌6.53±0.78defg4.37±0.20cGm+Bsp摩西球囊霉+芽胞桿菌B697菌株4.60±0.58hij2.30±0.11fgGm+Pf摩西球囊霉+熒光假單胞菌14.60±1.37a8.90±0.44aGe+Bs幼套球囊霉+枯草芽胞桿菌6.73±0.50def3.10±0.06deGe+Bsp

幼套球囊霉+芽胞桿菌B697菌株5.87±0.43fgh2.80±0.17defGe+Pf

幼套球囊霉+熒光假單胞菌10.40±0.79c5.60±0.21b50Bs枯草芽胞桿菌3.37±0.26jklm1.07±0.09ijklBsp芽胞桿菌B697菌株2.97±0.20klmno0.60l±0.06mnoPf熒光假單胞菌4.27±0.26ijk2.70±0.35efGm+Bs摩西球囊霉+枯草芽胞桿菌6.47±0.55defg4.67±0.61cGm+Bsp摩西球囊霉+芽胞桿菌B697菌株4.17±0.19ijkl2.50±0.23efGm+Pf摩西球囊霉+熒光假單胞菌14.70±1.48a8.73±0.43aGe+Bs幼套球囊霉+枯草芽胞桿菌6.30±0.29efg3.03±0.26deGe+Bsp

幼套球囊霉+芽胞桿菌B697菌株5.10±0.17ghi2.30±0.12fgGe+Pf

幼套球囊霉+熒光假單胞菌10.83±0.60bc5.50±0.35b100Bs枯草芽胞桿菌1.73±0.12nopqr0.70±0.12klmnoBsp芽胞桿菌B697菌株1.87±0.10nopqr0.30±0.06noPf熒光假單胞菌2.70l±0.17mnop1.20±0.12ijklGm+Bs摩西球囊霉+枯草芽胞桿菌4.47±0.20hij2.80±0.23defGm+Bsp摩西球囊霉+芽胞桿菌B697菌株2.53±0.15mnopq1.47±0.20hiGm+Pf摩西球囊霉+熒光假單胞菌12.07±1.16b5.70±0.40bGe+Bs幼套球囊霉+枯草芽胞桿菌3.53±0.29jklm1.83±0.18ghGe+Bsp

幼套球囊霉+芽胞桿菌B697菌株2.37±0.10mnopq1.23±0.09hijkGe+Pf

幼套球囊霉+熒光假單胞菌7.47±0.49de3.40±0.23d150Bs枯草芽胞桿菌0.70±0.11r0.23±0.03noBsp芽胞桿菌B697菌株0.80±0.06r0.13±0.03oPf熒光假單胞菌1.30±0.17pqr0.40±0.06mnoGm+Bs摩西球囊霉+枯草芽胞桿菌2.30±0.17mnopq0.97±0.10ijklmGm+Bsp摩西球囊霉+芽胞桿菌B697菌株1.10±0.06qr0.6l±0.06mnoGm+Pf摩西球囊霉+熒光假單胞菌7.87±0.61d2.70±0.12efGe+Bs幼套球囊霉+枯草芽胞桿菌1.50±0.17opqr0.80±0.06jklmnGe+Bsp

幼套球囊霉+芽胞桿菌B697菌株1.13±0.15qr0.40±0.06mnoGe+Pf

幼套球囊霉+熒光假單胞菌3.20±0.23jklmn1.30±0.12hijk顯著性檢驗LevelsofsignificanceM×AMF****M×PGPR****AMF×PGPR****M×AMF×PGPR***注：*表示在5%水平差異顯著，**表示在1%水平差異顯著Note:*meanssignificantdifferenceat5%level;and**meanssignificantdifferenceat1%level2.2土壤中不同甲胺磷水平下PGPR對AMF生長發(fā)育的影響研究結(jié)果表明，50~100μgg-1甲胺磷水平下不影響AMF侵染率，而150μgg-1下則降低AMF侵染。接種Pf處理顯著增加Ge和Gm的侵染率、Gm的叢枝著生率、泡囊數(shù)、侵染點數(shù)和產(chǎn)孢數(shù)量。表明該菌株能很好地促進Gm的侵染和生長發(fā)育。AMF侵染率和泡囊數(shù)在接種PGPR、AMF與施加不同濃度甲胺磷三因子間存在互作（表2）。表2土壤中不同甲胺磷水平下PGPR對AMF侵染和產(chǎn)孢數(shù)量的影響Table2EffectsofPGPRoncolonizationandsporulationofAMFrelativetomethamidophosconcentrationinthesoil處理TreatmentsAMF侵染率叢枝著生率泡囊數(shù)侵入點數(shù)孢子數(shù)量甲胺磷水平Methamidophoslevels(μgg-1)接種InoculationAMFcolonization(%)Arbuscule(%)Vesicles(mm-1)Entrypoints(mm-1)Sporesin50gsoil0Gm摩西球囊霉67.83±4.42bcdefg43.53±1.94cde5.67±0.33ef7.33±0.33e149.3±3.8efghGe幼套球囊霉64.57±2.94defgh40.17±3.41defgh4.33±0.33f8.33±0.33d159.3±4.9cdeGm+Bs摩西球囊霉+枯草芽胞桿菌74.17±6.41abc44.20±1.27cde6.33±0.33d9.33±0.33c144.0±2.9ghijGm+Bsp摩西球囊霉+芽胞桿菌B697菌株75.57±4.14ab39.10±1.10efghi7.33±0.33c10.33±0.33b167.7±5.5bcGm+Pf摩西球囊霉+熒光假單胞菌79.23±4.16a53.70±3.87a9.33±0.33a12.00±0.58a176.0±8.5abGe+Bs幼套球囊霉+枯草芽胞桿菌73.10±4.10abcd42.37±1.68cdef3.00±0.00h9.33±0.33c143.0±2.9ghijGe+Bsp幼套球囊霉+芽胞桿菌B697菌株71.53±2.54abcd46.57±3.15bc5.33±0.33e8.33±0.33d158.0±3.5cdefGe+Pf幼套球囊霉+熒光假單胞菌75.40±4.33ab45.37±2.31bcd6.33±0.33d7.33±0.33e147.3±3.2fghi50Gm摩西球囊霉61.73±2.14efghi40.73±2.22cdefgh5.33±0.33e8.33±0.33d153.0±2.9defgGe幼套球囊霉57.87±2.80hij38.23±1.82efghij3.00±0.00h9.33±0.33c157.0±2.3cdefGm+Bs摩西球囊霉+枯草芽胞桿菌67.83±4.07bcdefg41.47±2.43cdefg4.33±0.33f9.33±0.33c140.0±2.3hijklGm+Bsp摩西球囊霉+芽胞桿菌B697菌株69.67±4.22bcde36.90±1.79fghijk6.33±0.33d9.33±0.33c160.7±3.8cdGm+Pf摩西球囊霉+熒光假單胞菌72.40±5.63abcd50.73±2.40ab8.33±0.33b11.00±0.58b182.3±9.6aGe+Bs幼套球囊霉+枯草芽胞桿菌67.00±2.07bcdefg36.37±1.79fghijk3.00±0.00h10.33±0.33b145.0±2.9ghiGe+Bsp幼套球囊霉+芽胞桿菌B697菌株65.50±2.89cdefgh42.50±2.40cdef5.33±0.33e8.33±0.33d157.3±3.8cdefGe+Pf幼套球囊霉+熒光假單胞菌67.70±3.70bcdefg42.40±2.25cdef7.33±0.33c6.33±0.33f149.0±3.5efgh100Gm摩西球囊霉55.30±1.77ijk35.13±2.31hijkl4.00±0.33fg6.33±0.33f144.0±2.3ghiGe幼套球囊霉50.73±1.36jkl32.17±2.34jklm2.00±0.00ij7.33±0.33e145.0±2.3ghiGm+Bs摩西球囊霉+枯草芽胞桿菌60.40±2.02fghi35.33±2.34ghijkl3.33±0.00gh8.33±0.33d128.7±1.5mnoGm+Bsp摩西球囊霉+芽胞桿菌B697菌株61.70±1.65efghi31.27±1.65klm5.33±0.33e7.33±0.33e150.0±4.0defgGm+Pf摩西球囊霉+熒光假單胞菌69.40±2.98bcdef46.47±2.28bc7.33±0.33c9.33±0.33c173.7±7.8abGe+Bs幼套球囊霉+枯草芽胞桿菌62.33±2.25efghi33.47±2.31ijklm4.33±0.33f7.33±0.33e133.0±1.7jklmGe+Bsp幼套球囊霉+芽胞桿菌B697菌株60.10±2.51ghi38.40±1.91efghij4.00±0.33fg6.00±0.00fg144.0±2.9ghijGe+Pf幼套球囊霉+熒光假單胞菌61.30±2.34efghi35.10±2.17hijkl5.33±0.00e5.33±0.33gh137.7±2.0ijkl150Gm摩西球囊霉43.10±1.73lm30.13±1.73lmn2.00±0.33ij4.00±0.00i130.0±1.2lmnGe幼套球囊霉39.20±1.46m24.40±1.70n1.33±0.00jk4.00±0.00i133.0±2.3jklmGm+Bs摩西球囊霉+枯草芽胞桿菌47.73±2.36klm30.97±2.25klm1.00±0.33k5.00±0.00h117.3±2.0pGm+Bsp摩西球囊霉+芽胞桿菌B697菌株49.90±3.41jkl24.67±1.21n3.00±0.00h6.33±0.33f137.7±2.0ijklGm+Pf摩西球囊霉+熒光假單胞菌60.10±2.15ghi40.60±2.00cdefg4.00±0.58fg7.33±0.33e160.0±4.0cdeGe+Bs幼套球囊霉+枯草芽胞桿菌50.27±2.28jkl27.53±1.39mn2.67±0.33hi5.33±0.33gh121.0±1.7opGe+Bsp幼套球囊霉+芽胞桿菌B697菌株49.20±2.14jkl33.47±2.54ijklm3.33±0.33gh3.00±0.00j132.0±2.3klmnGe+Pf幼套球囊霉+熒光假單胞菌49.93jkl±2.09jkl31.23±2.28klm2.00±0.00ij2.00±0.00k125.0±2.9nop顯著性檢驗LevelsofsignificanceM×AMFNSNS****NSM×PGPRNSNS****NSAMF×PGPR**********M×AMF×PGPR**NS**NSNS注：NS表示不顯著；*表示在5%水平差異顯著，**表示在1%水平差異顯著Note:NSmeansnosignificantdifference;and*meanssignificantdifferenceat5%level;**meanssignificantdifferenceat1%level2.3AMF和PGPR對番茄植株生長和甲胺磷濃度的影響不施加或施加50μgg-1甲胺磷條件下，Bs、Bsp和Pf均可促進番茄植株的生長（圖1），其株高分別為對照的1.2倍、1.3倍和1.4倍，地上部干重分別為對照的1.7倍、1.9倍和2.1倍，均差異顯著（p<0.05）。對照對照BsBspPf圖1土壤中甲胺磷濃度50μgg-1條件下PGPR對番茄植株生長的影響Fig.1EffectsofPGPRonthegrowthoftomatoplantsgrowninthesoiladdedwith50μgg-1methamidophos土壤中施加甲胺磷條件下AMF+PGPR能不同程度地促進番茄植株生長。其中以Gm+Pf處理的番茄株高顯著高于其他處理，而根系中甲胺磷濃度則顯著低于其他處理。AMF、PGPR、AMF+PGPR各處理均顯著降低番茄體內(nèi)甲胺磷濃度，并且AMF與PGPR之間存在互作，二者雙接種較任一單接種的效果更大。表3給出100μgg-1甲胺磷濃度下各處理的數(shù)據(jù)，其他濃度下的結(jié)果與此接近，未給出具體數(shù)據(jù)。表3土壤中甲胺磷100μgg-1濃度下AMF和PGPR對番茄植株生長和甲胺磷濃度的影響Table3EffectsofAMFandPGPRontomatogrowthandmethamidophosconcentrationinthesoiladdedwith100μgg-1methamidophos處理Treatments株高Plantheight（cm）干重Dryweight（gplant-1）甲胺磷濃度Methamidophoscontents（μgg-1）莖葉Stemwithleaves根系Root莖葉Stemwithleaves根系RootCK對照90.4±1.0c23.1±1.2def15.5±0.9c3.3±0.2a7.8±0.3aBs枯草芽胞桿菌93.5±1.7c26.2±1.2f16.5±1.2c1.4±0.1c4.5±0.2bBsp芽胞桿菌B697菌株92.5±1.4c25.9±0.6f16.8±0.8c1.7±0.1bc4.1±0.1bPf熒光假單胞菌98.5±1.2c25.1±1.5ef15.9±0.4c0.8±0.1de2.3±0.1dGm摩西球囊霉98.6±0.3c31.2±2.0bcd22.4±1.4ab1.0±0.1d3.3±0.1cGe幼套球囊霉94.6±2.2c29.2±1.8cde20.4±0.8b1.8±0.1b3.4±0.2cGm+Bs摩西球囊霉+枯草芽胞桿菌99.5±2.6c30.7±1.6bcd22.9±1.7ab0.3±0.4fg1.3±0.1eGm+Bsp摩西球囊霉+芽胞桿菌B697菌株110.5±5.4b31.7±1.6bc21.9±1.1ab0.3±0.0fg1.0±0.1eGm+Pf摩西球囊霉+熒光假單胞菌121.5±4.5a37.7±3.0a25.9±1.7a0.1±0.0g0.5±0.0fGe+Bs幼套球囊霉+枯草芽胞桿菌99.6±1.2c31.5±1.7bc23.7±2.1ab0.5±0.0ef2.0±0.1dGe+Bsp幼套球囊霉+芽胞桿菌B697菌株110.5±2.3b31.7±2.1bc21.9±1.1ab0.7±0.0de2..3±0.2dGe+Pf幼套球囊霉+熒光假單胞菌97.5±3.1c34.7±2.7ab25.9±2.5a0.3±0.0fg1.3±0.1e顯著性檢驗LevelsofsignificanceAMF×PGPR*NSNS****注：CK表示對照；NS表示不顯著；*表示在5%水平差異顯著，**表示在1%水平差異顯著Note:NSmeansnosignificantdifference;and*meanssignificantdifferenceat5%level;**meanssignificantdifferenceat1%level2.4AMF和PGPR礦化甲胺磷農(nóng)藥的效應AMF+PGPR（Ge+Pf除外）雙接種處理的甲胺磷的礦化率顯著大于單接種處理和對照。土壤中甲胺磷濃度50~100μgg-1水平下，Gm+Pf組合處理的礦化率最高（60.6%），差異顯著（p<0.05）（圖2）。處理Treatments圖2接種AMF和PGPR對土壤中殘留甲胺磷農(nóng)藥礦化率的影響Fig.2EffectsofAMFandPGPRonmineralizationoftheresiduesofmethamidophosinsoil2.5AMF和PGPR對根區(qū)土壤中甲胺脫氫酶活性的影響土壤中甲胺磷100μgg-1水平下，PGPR接種處理0、2、4、6、9和17天后甲胺脫氫酶活性結(jié)果表明，各接種處理均在第6天表現(xiàn)出活性高峰，隨后開始下降，并保持在一定水平（圖3)。圖3甲胺磷100μgg-1濃度下AMF和PGPR對根區(qū)土壤中甲胺脫氫酶活性的影響Fig.3EffectsofAMFandPGPRonactivityofmethylaminedehydrogenaseintherhizosphereoftomatoplantsinthesoiladdedwith100μgg-1methamidophos3討論研究表明，有機磷農(nóng)藥對土壤中的細菌、放線菌和固氮菌群的生長有不同程度的抑制作用[25]。體外試驗表明，150μgg-1甲胺磷顯著抑制PGPR的生長和繁殖，其達到對數(shù)生長期的時間較對照遲2~4hr，培養(yǎng)12hr后對照發(fā)酵液中細菌數(shù)量是甲胺磷處理的1.7倍；而且盆栽條件下觀察到高濃度甲胺磷能抑制AMF和PGPR的生長發(fā)育和功能（表1和表2）。本試驗所接種的PGPR為國內(nèi)外試驗所采用[13,18]，在不施加或施加低濃度甲胺磷條件下，供試PGPR均可促進番茄植株的生長（圖1）；在施加100μgg-1濃度或更高濃度的甲胺磷條件下，其促進番茄植株生長的效應不顯著（表3），這可能與高濃度甲胺磷抑制PGPR生長、降低其定繁殖數(shù)量（表1）有關(guān)，從而減弱了PGPR的促生效應。因此，在篩選分解有毒有機物高效PGPR過程中，首先應確定不同PGPR菌株對有毒有機物毒性的耐受性，以提高篩選效率與可靠性。AMF+植物+PGPR共生體系中植物自身也具備吸附、固定和降解有毒物質(zhì)的能力[2,6,10]。本試驗結(jié)果表明，番茄植株本身對土壤中甲胺磷也有平均約23%的礦化率（圖2）。作為與植物互惠共生的AMF和PGPR在促進植物生長的同時，很可能也增強了植物對甲胺磷的礦化。其中，AMF和PGPR誘導植物好氧酶類活性則有待試驗證實。AMF的根外菌絲同樣能吸收、固定和分解土壤中的有毒有機物[7,9]，從而降低了根圍土壤中和植物體內(nèi)的有毒有機物濃度。AMF及其與植物根系形成的菌根不僅對有毒有機物具有較強的耐受性，而且還具有對有機物分解的腐生營養(yǎng)能力，如促進了土壤中枯枝落葉的分解并吸收其養(yǎng)分傳遞給寄主植物利用[5]。這就為該真菌分解土壤中殘留的農(nóng)藥奠定了生理和生態(tài)學基礎，而且理論上和部分試驗證據(jù)表明AMF具備降解化學農(nóng)藥的潛力。接種AMF顯著降低番茄莖葉和根內(nèi)甲胺磷濃度，表明AMF可能具有分解甲胺磷農(nóng)藥，將其部分降解產(chǎn)物作為自身養(yǎng)分利用的潛能，因為AMF的發(fā)育需要大量磷元素[21]。關(guān)于這一點有待深入研究證實。真菌接觸污染物一定時間后，能產(chǎn)生各種誘導酶，進而發(fā)揮降解作用，同時它們可以利用該污染物作為碳源和能源進行生長和繁殖。它們很可能通過獨特的酶系統(tǒng)和代謝途徑，降解不能被細菌單獨降解的有機污染物。只要能促進真菌好氧酶的生產(chǎn)，真菌就能降解土壤中多種有機物，而AMF用于直接降解土壤有機污染物的物質(zhì)很可能是好氧酶類，而且可能是多種水解酶類協(xié)同按一定分解順序進行分解。劉魏魏等[26]于溫室條件下對紫花苜蓿單獨或聯(lián)合接種蘇格蘭球囊霉（Glomuscaledonium）、芽孢桿菌(Bacillussp.)和黃桿菌(Flavobacteriumsp.)均能降解土壤中的多環(huán)芳烴(PAHs)污染物，其中以AMF+多環(huán)芳烴降解細菌處理的降解率最高，達到60.1%，而且同時發(fā)現(xiàn)土壤中脫氫酶活性和PAHs降解菌數(shù)量越高的處理，土壤PAHs的降解率也越高。本試驗則證實了供試AMF和PGPR能相互促進、協(xié)同發(fā)揮作用，提高了土壤中甲胺磷農(nóng)藥的降解率。AMF和PGPR提高甲胺脫氫酶酶活性(圖3)，通過酶促反應降解甲胺磷農(nóng)藥，這一酶催化過程可能是降解甲胺磷的主要途徑之一，值得進一步試驗證實。對于AMF、AMF+PGPR分解甲胺磷的酶類、降解農(nóng)藥的作用機制，尤其是降解的途徑、酶分解的動力學、分解的中間產(chǎn)物以及有關(guān)反應等有待進一步深入研究。此外，不同菌種（株）及其組合對甲胺磷的耐受性和降解率不同（表3和圖2），AMFGlomusmosseae和PGPRPseudomonasfluorescens是高效菌種和組合。而發(fā)熒光的假單胞菌（Pseudomonasspp）不同菌株與AMF組合試驗的結(jié)果表明，不同PGPR菌株與AMF組合在促進高粱生長方面的效果不同[27]。因此，在當前和今后篩選分解有機農(nóng)藥的AMF與PGPR組合菌劑時，不僅要考慮AMF或PGPR各個種的生理生化特性，也要考慮到其同種不同菌株的生理生化特性，以更有針對性的篩選和評價，獲得高效組合菌劑。另一方面，于上述試驗的基礎上，今后應進一步開展大田試驗，以評價其田間降解效率，為研發(fā)AMF+PGPR復合菌劑提供技術(shù)。4結(jié)論無論是單接種還是雙接種AMF和PGPR菌劑均能降解一定種類的有毒有機物，具有潛在的降解土壤中殘留有機農(nóng)藥的生理生態(tài)作用。本研究在前人試驗基礎上，進一步觀察到AMF、PGPR和AMF+PGPR處理均顯著降低番茄體內(nèi)甲胺磷濃度，接種AMF和/或PGPR能礦化甲胺磷，雙接種處理的效果優(yōu)于單接種處理。在甲胺磷50~100μgg-1水平下，Gm+Pf處理的甲胺磷礦化率達到52%~60.6%，顯著降低根區(qū)土壤中甲胺磷殘留量，是本試驗條件下的AMF+PGPR最佳組合。利用AMF和PGPR聯(lián)合協(xié)同修復農(nóng)藥污染土壤具有一定應用潛力。這對于保護環(huán)境、提高食品安全性與可持續(xù)農(nóng)林牧漁業(yè)生產(chǎn)具有深遠的意義。參考文獻[1]朱英月,劉全永,李賀,等.遼東與山東半島土壤中有機氯農(nóng)藥殘留特征研究.土壤學報,2015,52(4):888-901ZhuYY,LiuQY,LiH,etal.ResiduesoforganochlorinepesticidesinsoilsofLiaodongandShandongPeninsulas(InChinese).ActaPedologicaSinica,2015,52(4):[2]孫吉慶,劉潤進,李敏.叢枝菌根真菌提高植物抗逆性的效應及其機制研究進展.植物生理學報,2012,48(9):845-852.

SunJQ,LiuRJ,LiM.Advancesinthestudyofincreasingplantstressresistanceandmechanismsbyarbuscularmycorrhizalfungi(InChinese).PlantPhysiologyJournal,2012,48(9):845-852[3]MiransariM.Contributionofarbuscularmycorrhizalsymbiosistoplantgrowthunderdifferenttypesofsoilstress.PlantBiology,2010,12(4):563–569[4]JonerEJ,LeyvalC.Phytoremediationoforganicpollutantsusingmycorrhizalplants:Anewaspectofrhizosphereinteractions.Agronomie,2003,23:495–502[5]HodgeA,CampbellCD,FitterAH.Anarbuscularmycorrhizalfungusacceleratesdecompositionandacquiresnitrogendirectlyfromorganicmaterial.Nature,2001,413:297–299[6]WangFY,ShiZY,TongRJ,etal.Dynamicsofphoximresiduesingreenonionandsoilasinfluencedbyarbuscularmycorrhizalfungi.JournalofHazardousMaterials,2011,185(1):112–116[7]WangFY,TongRJ,ShiZY,etal.Inoculationswitharbuscularmycorrhizalfungiincreasevegetableyieldsanddecreasephoximconcentrationsincarrotandgreenonionandtheirsoil.

PLoS

ONE,

2011,

6(2):

e16949[8]WuNY,ZhangSZ,HuangHL,etal.DDTuptakebyarbuscularmycorrhizalalfalfaanddepletioninsoilasinfluencedbysoilapplicationofanon-ionicsurfactant.EnvironmentPollution,2008,151:569–575[9]HuangHL,ZhangSZ,ShanXQ,etal.Effectofarbuscularmycorrhizalfungus(Glomuscaledonium)ontheaccumulationandmetabolismofatrazineinmaize(ZeamaysL.)andatrazinedissipationinsoil.EnvironmentPollution,2007,146:452–457[10]王發(fā)園,林先貴.叢枝菌根真菌對污染土壤中農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的影響.土壤學報,2008,2008,45(6):1142-1145.WangFY,LinXG.\o"添加到單詞本"Effectofarbuscularmycorrhizalfungionqualitysafetyoffarmproductsincontaminatedsoils(InChinese).ActaPedologicaSinica,2008,45(6):1142-1145[11]馬瑩,駱永明,滕應,等.根際促生菌及其在污染土壤植物修復中的應用.土壤學報,2013,50(5):1021-1031.MaY,LuoYM,TengY,etal.Plantgrowthpromotingrhizobacteriaandtheirroleinphytoremediationofheavymetalcontaminatedsoils(InChinese).ActaPedologicaSinica,2013,50(5):1021-1031[12]GuoJK,ChiJ.EffectofCd-tolerantplantgrowth-promotingrhizobiumonplantgrowthandCduptakebyLoliummultifloruandGlycinemaxinCd-contaminatedsoil.PlantandSoil,2014,375:205-214[13]MyresiotisCK,VryzasZ,Papadopoulou-MourkidouE.Biodegradationofsoil-appliedpesticidesbyselectedstrainsofplantgrowth-promotingrhizobacteria(PGPR)andtheireffectsonbacterialgrowth.Biodegradation,2012,23:297–310[14]SangeethaJ,KingSolomonE,NatarajanK,etal.EfficacyofAMFandPGPRinoculantsonmaize(ZeamaysL.)plantgrowthandtheirrhizospheresoilproperties//VeluRK.Microbiologicalresearchinagroecosystemmanagement.SpringerIndia,2013:155-173[15]戴梅,王洪嫻,殷元元,等.叢枝菌根真菌與根圍促生細菌相互作用的效應與機制.生態(tài)學報,2008,28(6):2854-2860.DaiM,WangHX,YinYY,etal.Effectandmechanismsofinteractionsbetweenarbuscularmycorrhizalfungiandplantgrowthpromotingrhizobacteria(InChinese).ActaEcologicaSinica,2008,28(6):2854-2860[16]秦華,林先貴,尹睿,等.叢枝菌根真菌和兩株細菌對土壤中DEHP降解及綠豆生長的影響.環(huán)境科學學報,2006,26(10):1651-1657.QinH,LinXG,YinR,etal.InfluenceofanarbuscularmycorrhizalfungiandtwobacterialstrainsonDEHPdegradationandgrowthofmungbeaninsoil(InChinese).ActaScientiaeCircumstantiae,2006,26(10):1651-1657[17]滕應,駱永明,高軍,等.多氯聯(lián)苯污染土壤菌根真菌-紫花苜蓿-根瘤菌聯(lián)合修復效應.環(huán)境科學,2008,29(10):2925-2930.TengY,LuoYM,GaoJ,etal.Combinedremediationeffectsofarbuscularmycorrhizalfungi-legumes-rhizobiumsymbiosisonPCBscontaminatedsoils(InChinese).EnvironmentalScience,2008,29(10):2925-2930[18]LiuRJ,DaiM,WuX,etal.Suppressionoftheroot-knotnematode(Meloidogyneincognita)ontomatobydualinoculationwithAMfungiandplantgrowth-promotingrhizobacteria.Mycorrhiza,2012,22:289–296[19]劉茵,劉秀花,馮固,等.甲胺磷污染對叢枝菌根(AM)共生體形成及宿主番茄生長的影響.湖北農(nóng)業(yè)科學,2004(4):65-67.LiuY,LiuXH,FengG,etal.Effectofmethamidophoscontaminationontheoccurrenceofarbuscularmycorrhizasymbiontandthegrowthofhostplanttomato(InChinese).HubeiAgriculturalSciences,2004(4):65-67[20]LiuRJ,LuoXS.Anewmethodtoquantifytheinoculumpotentialofarbuscularmycorrhizalfungi.NewPhytologist,1994,128:89–92[21]劉潤進,陳應龍.菌根學.北京:科學出版社,2007:380-393.LiuRJ,ChenYL.Mycorrhizology(InChinese).Beijing:SciencePress,2007:380-393[22]BashanY,HolguinG,LifshitzR.Isolationandcharacterizationofplantgrowth-promotingrhizobacteria//GlickBR,ThompsonJE.Methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology.BocaRaton:CRCPress,1993:331–345[23]趙斌,何紹江.微生物學實驗.北京:科學出版社,2002.ZhaoB,HeSJ.Experimentofmicrobiology(InChinese).Beijing:SciencePress,2002[24]KiriukhinMY,ChistoserdovAY,TsygankovYD.MethylaminedehydrogenasefromMethylobacillusflagellatum.MethodsinEnzymology,1990,188:247-250[25]KoradeDL,FulekarMH.Rhizosphereremediationofchlorpyrifosinmycorrhizosphericsoilusingryegrass.JournalofHazardousMaterials,2009,172(2/3):1344-1350[26]劉魏魏,尹睿,林先貴,等.多環(huán)芳烴污染土壤的植物-微生物聯(lián)合修復初探.土壤,2010,42(5):800-806.LiuWW,YinR,LinXG,etal.Interactionofphytoremediation-microorganismtoremediationofagedpolycyclicaromatichydrocarbons(PAHs)pollutedsoils(InChinese).Soils,2010,42(5):800-806[27]PraveenKumarG,KishoreN,LeoDanielAmalrajE,etal.Evaluationof?uorescentPseudomonasspp.withsingleandmultiplePGPRtraitsforplantgrowthpromotionofsorghumincombinationwithAMfungi.PlantGrowthRegulators,2012,67:133–140XULijuan1ZHANGJinzheng1YUANYuqing2LIMin1LIURunjin1?(1InstituteofMycorrhizalBiotechnology,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao,Shandong266109,China)(2CentralLaboratoryofQingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao,Shandong266109,China)AbstractArbuscularmycorrhizalfungi(AMF)andplantgrowth-promotingrhizobacteria(PGPR)areimportantmembersinthesoilmicrobialcommunity,capableofremediatingsoilspollutedwithtoxicorganics,andChinahaslargetractsofsoilscontaminatedwithpesticidesandsomeothertoxicorganicsubstances,waitingtoberemediated.IthasbeenprovedthatAMFandPGPRcandegradetoxicorganicmatters,however,littlehasbeenreportedsofaraboutAMFor/andPGPRdegradingresiduesoforganophosphoruspesticidesinsoil.ThepurposeofthepresentstudywastoevaluateefficiencyofAMFandPGPRdegradingresiduesoforganophosphoruspesticidesinsoilandtoremedyorganicpesticidepollutedsoilswiththetwogroupsofsoilmicrobes.Apotexperiment,designedtohaveatotalof48treatmentswithconcentrationofmethamidophos(0,50,100and150μgg-1)andinoculationpatternofAMFandPGPR(inoculatingtomatoseedswithAMFGlomusmosseae(Gm),Glomusetunicatum(Ge),andtomatoseedlin