江蘇省高校科研項(xiàng)目申報(bào)書

江蘇省高校科研項(xiàng)目申報(bào)書江蘇省高?？蒲许?xiàng)目申報(bào)書江蘇省高?？蒲许?xiàng)目申報(bào)書資料僅供參考文件編號(hào)：2022年4月江蘇省高?？蒲许?xiàng)目申報(bào)書版本號(hào)：A修改號(hào)：1頁次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：附件4-1-1-1：江蘇省普通高校學(xué)術(shù)學(xué)位研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目申報(bào)書博士研究生□碩士研究生□一級(jí)學(xué)科名稱：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科名稱：免疫學(xué)研究方向：糖生物學(xué)申請(qǐng)項(xiàng)目名稱：TAK1的糖基化修飾在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境中的作用指導(dǎo)教師：季玉紅所在學(xué)校：南通大學(xué)江蘇省學(xué)位委員會(huì)制表江蘇省教育廳二O一四年四月

填表說明一、填寫本表前，應(yīng)先仔細(xì)閱讀《江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目實(shí)施與管理辦法》等有關(guān)文件及本說明，務(wù)必實(shí)事求是填寫。二、填寫本表欄目時(shí)，如需要可加附頁。三、本表所有信息必須全部填寫，不存在的內(nèi)容一律填“無”。項(xiàng)目概況項(xiàng)目名稱TAK1的糖基化修飾在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境中的作用項(xiàng)目類別A.人文社科項(xiàng)目□B.自然科學(xué)項(xiàng)目□起止年限2014年05月至2015年05月二級(jí)學(xué)科代碼1001二級(jí)學(xué)科名稱100102重點(diǎn)學(xué)科國家級(jí)□省級(jí)□申請(qǐng)人姓名徐志偉性別男出生年月1991年1月博（碩）士入學(xué)年月2013年9月所在院系醫(yī)學(xué)院聯(lián)系電話電子信箱立項(xiàng)依據(jù)（包括項(xiàng)目來源，研究意義，國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢(shì)等）炎癥反應(yīng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)外界刺激如感染和組織損傷而產(chǎn)生的一種復(fù)雜的生理性反應(yīng),由趨化因子、細(xì)胞因子、脂類炎癥介質(zhì)等參與。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞,激活的巨噬細(xì)胞在炎癥開始后迅速抵達(dá)炎癥部位,參與吞噬病原體和分泌各種參與炎癥反應(yīng)的介質(zhì)和細(xì)胞因子[1-2】。炎癥反應(yīng)中所產(chǎn)生的大量炎癥介質(zhì)在有效清除病原體的同時(shí),也可造成正常細(xì)胞和組織的病理性損傷。因此,對(duì)炎癥反應(yīng)這把機(jī)體防御雙刃劍的有效調(diào)控就顯得尤為重要。巨噬細(xì)胞至少可以被分為兩種類型:Ml型,即經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(Classicallyactivatedmacrophage)和MZ型,即替代性活化的巨噬細(xì)胞(Altemativelyaetivatedmacrophage)"MI型巨噬細(xì)胞在細(xì)菌或其產(chǎn)物脂多糖(Lipopolysaceharides,LpS)或干擾素(Interferon一了,IFN一丫)的誘導(dǎo)下產(chǎn)生,表現(xiàn)為:高遞呈抗原的能力[3-4】;高分泌白細(xì)胞介素12(Inierlukin一12,IL一12)和白細(xì)胞介素23(Inierlukin一23,IL一23)及其隨后誘導(dǎo)的I型免疫應(yīng)答;高產(chǎn)生毒性中間產(chǎn)物[一氧化氮(Nitrieoxide,No),活性氧中間產(chǎn)物(Reaetiveoxygenintermediates,Rol):的能力"因此,Ml型巨噬細(xì)胞被認(rèn)為具有殺傷細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞并可以分泌多種促炎性細(xì)胞因子的能力"而MZ型巨噬細(xì)胞可由白細(xì)胞介素4(Interlukin一4,IL一4)!白細(xì)胞介素13(Interlukin一13,IL一13)!糖皮質(zhì)激素!轉(zhuǎn)化生長因子一p(Transformatinggro誠hfacto卜p,TGF一p)和前列腺素EZ(ProstaglandinEZ,PGEZ)等誘導(dǎo)產(chǎn)生[5],表現(xiàn)為:低的遞呈抗原的能力;產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖和活性的細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素10(Interfukin一10,IL一10);較好的清除碎片的能力;促進(jìn)血管生成和創(chuàng)傷愈合的能力。轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β活化激酶Ⅰ（TAKⅠ），也叫做絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7)，是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一員[6]。TAKⅠ在TNFα的產(chǎn)生和其他炎性介質(zhì)激活MAPK中有關(guān)鍵作用，比如p38aMAPK，c-Jun氨基末端激酶(JNK1/JNK2)，ERK1/2和轉(zhuǎn)錄因子核因子kB(NFkB)kB(NFkB)，TAKⅠ在幾種細(xì)胞因子介導(dǎo)的先天免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)中很重要，包括TNFα，IL-1和TGF-β通路，也包括Toll樣受體的下游信號(hào)和NOD1/2。在這些通路中，多個(gè)促炎細(xì)胞因子和內(nèi)毒素觸發(fā)TAKⅠ的活動(dòng)，引起自身磷酸化作用和IkB激酶復(fù)合物的繼發(fā)補(bǔ)充，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NFkB的激活。原生形態(tài)的TAKⅠ包含一個(gè)催化激酶亞單位與調(diào)節(jié)亞基TABⅠ（TAK1結(jié)合蛋白1，一種擬磷酸化酶）形成的復(fù)合物和兩種同源蛋白TAB2orTAB3之一。脂多糖或IL-1引起的TAK1的活化由Lys63相關(guān)的多聚泛素化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6多聚泛素化觸發(fā)，它與TAB2和TAB3的碳端的鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合，刺激TAK1的自身磷酸化和活化[7]。蛋白質(zhì)的糖基化可以影響蛋白質(zhì)的折疊、成熟、配體-受體結(jié)合及胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在維持生理功/或疾病的發(fā)生中均發(fā)揮重要作用[8]。越來越多的研究表明，蛋白質(zhì)的糖基化修飾與巨噬細(xì)胞炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)糖基化修飾與機(jī)體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，例如白細(xì)胞表面的整合素及選擇素等細(xì)胞表面分子在被糖基化修飾后，能促進(jìn)其向炎性部位募集，以完成免疫細(xì)胞識(shí)別/清除病原體等過程。最近的研究也表明蛋白質(zhì)糖基化修飾參與膠巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境的形成及炎癥的發(fā)生及發(fā)展[9].巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面的高級(jí)糖基化終產(chǎn)物（advancedglycosylationendproduct，AGE）能與巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面高度聚糖化作用終產(chǎn)物的受體（receptorforadvancedglycationendproducts，RAGE）相結(jié)合，抑制巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，上述研究結(jié)果表明蛋白糖基化修飾可影響巨噬細(xì)胞局部的炎癥反應(yīng)，在炎癥過程中發(fā)揮重要作用[10】。目前國內(nèi)外研究巨噬細(xì)胞炎癥作用過程中所涉及的信號(hào)通路主要有，絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedproteinkinase，MAPK）信號(hào)通路以及細(xì)胞核因子-kappaB（nuclearfactor-kappaB，NF-κB）信號(hào)通路[11]。轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶（TAK1，MEKK7）是MAP3K家族的成員之一，能被多種細(xì)胞因子包括IL-1β，IL-18，TNF-α等激活，處于這兩條途徑的分支點(diǎn)上[12]。TAK1作為炎癥反應(yīng)中細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)上游重要的激酶，可能對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥起著重要的調(diào)節(jié)作用。其中經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路的激活在炎癥過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。已有的研究表明脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的炎癥模型中，TAK1的活性明顯上調(diào)，以及炎癥因子的表達(dá)穩(wěn)定性增高[13-14]。但TAK1的糖基化對(duì)其炎癥具體的分子調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。綜上所述，TAK1是否存在糖基化的修飾LPS刺激巨噬細(xì)胞炎性激活調(diào)節(jié)過程是否需要TAK1糖基化的參與具體的調(diào)節(jié)機(jī)制是什么這些問題都值得我們深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】AyubA,AshfaqUA,HaqueA.HBVinducedHCC:majorriskfactorsfromgenetictomolecularlevel.BiomedResInt.2013;13(1):810461.ThomasDL.GlobalcontrolofhepatitisC:wherechallengemeetsopportunity.NatMed.2013;19(7):850-858.BaroneC,KoeberleD,MetselaarH,ParisiG,SansonnoD,SpinziG.MultidisciplinaryapproachforHCCpatients:hepatologyfortheoncologists.AnnOncol.2013;24(2):15-23.TianY,YangW,SongJ,WuY,NiB.HepatitisBvirusXprotein-inducedaberrantepigeneticmodificationscontributingtohumanhepatocellularcarcinomapathogenesis.MolCellBiol.2013;33(15):2810-2816.Lazo-GómezR,Ramírez-JarquínUN,Tovar-Y-RomoLB,Tapiadeacetylasesandtheirroleinmotorneurondegeneration.FrontCellNeurosci.2013;7(3):243.HojfeldtJW,AggerK,HelinK.Histonelysinedemethylasesastargetsforanticancertherapy.NatRevDrugDiscov.2013;12(12):917-30.ParbinS,KarS,ShilpiA,SenguptaD,DebM,RathSK,PatraSK.Histonedeacetylases:asagaofperturbedacetylationhomeostasisincancer.JHistochemCytochem.2014;62(1):11-33.KellyRD,CowleySM.Thephysiologicalrolesofhistonedeacetylase(HDAC)1and2:complexco-starswithmultipleleadingparts.BiochemSocTrans.2013;41(3):741-749.ReichertN,ChoukrallahMA,MatthiasP.MultiplerolesofclassIHDACsinproliferation,differentiation,anddevelopment.CellMolLifeSci.2012;69(13):2173-2187.SchneiderG,Kr?merOH,SchmidRM,SaurD.Acetylationasatranscriptionalcontrolmechanism-HDACsandHATsinpancreaticductaladenocarcinoma.JGastrointestCancer.2011;42(2):8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)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MTDH與p65結(jié)合的改變；采用核漿分離技術(shù)、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)TAK1及p65的核漿分布情況，分析TAK1糖基化修飾對(duì)于p65向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)情況的影響；采用westernblot分析IκBα的磷酸化水平變化；采用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)，分析TAK1糖基化修飾對(duì)于細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性的影響；采用RealtimePCR技術(shù)、ELISA法，檢測(cè)炎性細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-10等）的合成及分泌改變。（d）在此基礎(chǔ)上，分別利用多種炎癥因子IL-1β、TNF-α等處理巨噬細(xì)胞，模擬巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境，并干預(yù)TAK1的表達(dá)，分析其對(duì)上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的影響。5.分析TAK1發(fā)生0-糖基化修飾對(duì)巨噬細(xì)胞激活的影響。(1)TAK1發(fā)生N-糖基化修飾對(duì)TAK1與IKK結(jié)合能力的影響。a）將野生型及糖基化位點(diǎn)突變的TAK1轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后，檢測(cè)外轉(zhuǎn)受體的表達(dá)情況；b）利用FITC標(biāo)記的15-P-DJ處理巨噬細(xì)胞1小時(shí)，固定細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面綠色熒光的結(jié)合情況，觀察干預(yù)TAK1糖基化修飾對(duì)其與IKK結(jié)合能力的影響。(c）MTT法檢測(cè)上所述巨噬細(xì)胞中細(xì)胞活力的變化，ELISA檢測(cè)上述細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌的變化，同時(shí)收集細(xì)胞蛋白，免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞活化標(biāo)記物的變化；分析TAK1發(fā)生0-糖基化修飾對(duì)巨噬細(xì)胞磷酸化的影響將野生型及糖基化位點(diǎn)突變型TAK1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞，采用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合westernblot,檢測(cè)TAK1的磷酸化的變化將野生型及糖基化位點(diǎn)突變型TAK1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞，在炎癥因子的刺激的情況下，采用westernblot檢測(cè)TAK1以及靶定下游分子的磷酸化變化技術(shù)路線：創(chuàng)新性：（1）本項(xiàng)目研究的特色之處：本項(xiàng)目以炎癥發(fā)生過程中蛋白質(zhì)翻譯后的O-GlcNAc修飾為核心，以TAK1的糖基化修飾為切入點(diǎn)，系統(tǒng)的從細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)等多學(xué)科系統(tǒng)的研究刺激情況下TAK1的O-GlcNAc修飾在巨噬細(xì)胞炎癥發(fā)生及發(fā)展中的作用，為研究巨噬細(xì)胞炎癥的發(fā)生機(jī)制，尋找炎癥治療方法提供理論依據(jù)。這是本項(xiàng)目的特色之處。（2）本項(xiàng)目研究的創(chuàng)新之處：本項(xiàng)目研究中將蛋白質(zhì)糖基化修飾引入到巨噬細(xì)胞炎癥的調(diào)解中，從糖生物學(xué)角度研究表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)制。本項(xiàng)目的研究可為闡明多因素導(dǎo)致的炎癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。這是本項(xiàng)目研究的創(chuàng)新之處。可行性：（1）立項(xiàng)依據(jù)充分，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確，課題研究理論可行。前期的研究發(fā)現(xiàn)TAK1蛋白質(zhì)的糖基化修飾參與巨噬細(xì)胞炎癥的發(fā)展，而TAK1也被報(bào)道參與炎癥的發(fā)生發(fā)展。課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)TAK1可以發(fā)生呢個(gè)O-糖基化修飾，并在前期的研究中發(fā)現(xiàn)炎癥情況下O-GlcNAc明顯增加，這提示在巨噬細(xì)胞炎癥發(fā)生發(fā)展過程中，TAK1的糖基化修飾促進(jìn)炎癥的發(fā)生與發(fā)展。（2）成員隊(duì)伍合理，學(xué)科層次全面，項(xiàng)目研究人員可行。項(xiàng)目研究組成員來自外科學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)等多學(xué)科，擁有多學(xué)科的而研究背景，為項(xiàng)目的完成提供理論支持；同時(shí)項(xiàng)目組中有多位成員主持及參加國家自然科學(xué)基金的研究，具有完成本課題的能力。（3）研究方法多樣，研究的技術(shù)可行。項(xiàng)目組在前期的研究中已經(jīng)系統(tǒng)的掌握細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)、表觀遺傳學(xué)等多學(xué)科的研究技術(shù)及方法，可為本課題的研究提供技術(shù)支持。研究工作的總體安排及進(jìn)度2013年01月-2015年12月 分析TAK1存在糖基化修飾；在此基礎(chǔ)上分析TAK1的O-GlcNAc修飾位點(diǎn)。參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會(huì)議1人/次。2015年01月-2015年10月 分析TAK1的O-GlcNAc修飾對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥的改變；在此基礎(chǔ)上分析其對(duì)NF-kB通路的影響。參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會(huì)議1人/次。2015年11月-2016年03月 分析TAK1的O-GlcNAc修飾對(duì)TAK1調(diào)節(jié)的靶基因表達(dá)改變；在此基礎(chǔ)上分析其對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子的影響。參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會(huì)議1人/次；參加國際學(xué)術(shù)會(huì)議1人/次。總結(jié)結(jié)果，發(fā)表論文1-2篇。2016年04月-2016年12月 分析巨噬細(xì)胞中TAK1的O-GlcNAc修飾與巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境的關(guān)系；構(gòu)建炎癥模型干預(yù)TAK1的O-GlcNAc糖基化修飾，分析對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥發(fā)生及發(fā)展的影響。參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會(huì)議1人/次；參加國際學(xué)術(shù)會(huì)議1人/次?？偨Y(jié)結(jié)果，發(fā)表論文1-2篇?？偨Y(jié)課題研究內(nèi)容，撰寫項(xiàng)目結(jié)題報(bào)告。五、研究工作的預(yù)期成果及成果提交形式1.在293T細(xì)胞中，運(yùn)用免疫共沉淀結(jié)合westernblot,檢測(cè)TAK1分子本身存在糖基化修飾在293T細(xì)胞中，用OGA的抑制劑GlcNAcstatin處理以后，明顯增強(qiáng)了TAK1的糖基化水平。在巨噬細(xì)胞中，分別用不同濃度的LPS對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激，檢測(cè)TAK1的糖基化變化，發(fā)現(xiàn)明顯增加。六、研究基礎(chǔ)和工作條件（申請(qǐng)人與本課題有關(guān)的研究成果，含承擔(dān)項(xiàng)目、發(fā)表論文、獲獎(jiǎng)、國內(nèi)外評(píng)價(jià)與引用情況；現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備、研究技術(shù)及協(xié)作條件等）1．工作基礎(chǔ)（與本項(xiàng)目相關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績）。課題組多年來從事炎癥發(fā)生及發(fā)展機(jī)制的研究。目前已經(jīng)有的與本課題研究相關(guān)的基礎(chǔ)有：（1）在前期的研究中，課題組已經(jīng)對(duì)炎癥的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制展開大量的研究，已經(jīng)積累豐富的研究基礎(chǔ)（課題組前期發(fā)表的相關(guān)論文1-4）；（2）課題組多年來一直從事蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)及其相互作用的研究，已經(jīng)積累本課題研究必須的方法（課題組前期發(fā)表的相關(guān)論文5-8）；（3）課題組在前期研究中已經(jīng)對(duì)蛋白質(zhì)糖基化修飾展開研究，并積累豐富基礎(chǔ)（課題組前期發(fā)表的相關(guān)論文9-10）；（4）課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)TAK1存在糖基化修飾；（5）課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)TAK1糖基化的表達(dá)后，明顯抑制了巨噬細(xì)胞炎癥的發(fā)生。課題組前期發(fā)表的與本項(xiàng)目研究內(nèi)容相關(guān)的論文:WuH,ChenP,LiaoR,LiYW,YiY,WangJX,CaiXY,HeHW,JinJJ,ChengYF,FanJ,SunJ*,QiuSJ*.IntratumoralregulatoryTcellswithhigherprevalenceandmoresuppressiveactivityinhepatocellularcarcinomapatients.JGastroenterolHepatol.2013;28(9):1555-1564.WuH,ChenP,LiaoR,LiYW,YiY,WangJX,SunTW,ZhouJ,ShiYH,YangXR,JinJJ,ChengYF,FanJ*,QiuSJ*.Overexpressionofgalectin-1isassociatedwithpoorprognosisinhumanhepatocellularcarcinomafollowingresection.JGastroenterolHepatol.2012;27(8):1312-1319.LiaoR,WuH,YiY,WangJX,CaiXY,HeHW,ChengYF,ZhouJ,FanJ,SunJ*,QiuSJ*.ClinicalsignificanceandgeneexpressionstudyofhumanhepaticstellatecellsinHBVrelated-hepatocellularcarcinoma.JExpClinCancerRes.2013;32:22.YiY,WuH,GaoQ,HeHW,LiYW,CaiXY,WangJX,ZhouJ,ChengYF,JinJJ，F(xiàn)anJ*,QiuSJ*.Interferonregulatoryfactor(IRF)-1andIRF-2areassociatedwithprognosisandtumorinvasioninHCC.AnnSurgOncol.2013;20(1):267-276.ShenM,JiY,ZhangS,ShiH,ChenG,GuX*,DingF*.AproteomemapofprimaryculturedratSchwanncells.ProteomeSci.2012;10(1):20.JiY,ShenM,WangX,ZhangS,YuS,ChenG,GuX*,DingF*.ComparativeProteomicAnalysisofPrimarySchwannCellsandaSpontaneouslyImmortalizedSchwannCellLineRSC96:AComprehensiveOverviewwithaFocusonCellAdhesionandMigrationRelatedProteins.JProteomeRes.2012;11(6):3186-3198.LiM,YangX,ZhangJ,ShiH,HangQ,HuangX,LiuG,ZhuJ,HeS*,WangH*.EffectsofEHD2interferenceonmigrationofesophagealsquamouscellcarcinoma.MedOncol.2013;30(1):396.HangQ,FeiM,HouS,NiQ,LuC,ZhangG,GongP,GuanC,HuangX,HeS*.ExpressionofSp