病毒性肝炎血清學(xué)檢測的基礎(chǔ)與實踐

（優(yōu)選）病毒性肝炎血清學(xué)檢測的基礎(chǔ)與實踐第一頁，共六十四頁。為什么ELISA檢測抗體容易假陽性?抗體的粘附特性，特別是IgM抗體ELISA的高靈敏性抗體結(jié)合抗原的適應(yīng)性：Fab－CDR抗-HIV初篩試驗抗-HIV確診試驗第二頁，共六十四頁。CLVLVHCH1CH2CH3V區(qū)Fab段Fc段s-ss-ss-ss-sCDR1CDR3CDR2抗體結(jié)構(gòu)簡圖IgM是五聚體，與抗原具有5或10價結(jié)合力。Fab：fragmentantigen-bindingCDR：complementaritydeterminingregionFab段抗體結(jié)合抗原的適應(yīng)性：Fab－CDR第三頁，共六十四頁。抗體產(chǎn)生過程簡圖第四頁，共六十四頁。間接ELISA檢測抗體1.抗原包被2.封閉3.待測血清4.酶標二抗5.TMB顯色6.2MH2SO47.OD450EEEEEE+SubstrateTMB抗-IgG抗-IgA抗-IgMIgGIgAIgM第五頁，共六十四頁。抗體的粘附特性00.501.001.502.00原倍10100100010000血清稀釋倍數(shù)OD450間接ELISA，無抗原包被間接法ELISA檢測抗體，靈敏，但容易出現(xiàn)假陽性第六頁，共六十四頁。捕捉法ELISA檢測IgM抗體1.抗mu鏈抗體包被2.封閉3.待測血清4.酶標抗原（特異性）5.TMB顯色6.2MH2SO47.OD450CLVLVHCH1CH2CH3V區(qū)s-ss-ss-ss-s敏感性較間接法低，但特異性強第七頁，共六十四頁。ELISA檢測抗原1.抗體包被2.封閉3.待測血清4.酶標抗體5.TMB顯色6.2MH2SO47.OD450EEEEEE+SubstrateTMB包被抗體與酶標抗體識別的免疫表位必須不同第八頁，共六十四頁。病毒性肝炎甲型乙型丙型丁型戊型HepatitisAVirus,HAVHepatitisBVirus,HBVHepatitisCVirus,HCVHepatitisDVirus,HDVHepatitisEVirus,HEV消化道血液消化道感染途徑血液血液病原學(xué)病程分型急性急性,慢性急性,慢性急性,慢性急性GBV-C，所謂庚型肝炎病毒，不引起肝損，不是肝炎病毒EB病毒、巨細胞病毒等可引起肝損，但以臟器損傷為主，不稱肝炎病毒第九頁，共六十四頁。病毒性肝炎的病原診斷根據(jù)臨床表現(xiàn)無法確定病原診斷依賴實驗室檢查血清學(xué)方法：血清+免疫技術(shù)檢測抗原或抗體分子生物學(xué)：酶免疫測定：enzymeimmunoassay,EIA酶聯(lián)免疫吸附測定：enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA分子雜交：同位素或其他物質(zhì)標記已知DNA或cDNA，即探針，與待測標本中的核酸互補，特異性結(jié)合。－－淘汰聚合酶鏈反應(yīng)：polymerasechainreaction，PCR－－普遍使用第十頁，共六十四頁。甲型肝炎病毒HAV無包膜RNA病毒：抗原種類少正鏈RNA，7.4kbHAV抗原只有一種，即衣殼蛋白；難以測到，不開展特異性抗體：抗-HAVIgG,IgM，保護性抗體；常用HAVRNA：RT-PCR檢測，但陽性率低，僅用于研究第十一頁，共六十四頁。024681012抗甲肝抗體濃度感染后周數(shù)病毒血癥大便排病毒轉(zhuǎn)氨酶升高期癥狀期IgMIgGHAV感染后人體抗體應(yīng)答抗-HAVIgM：感染后～3周即可陽性，1-3月后轉(zhuǎn)陰，近期或急性感染?？?HAVIgG：IgM產(chǎn)生后數(shù)天即可陽性，存在數(shù)十年，單純陽性很可能是既往感染，故單獨檢測抗-HAVIgG通常不用于診斷。第十二頁，共六十四頁。甲型肝炎診斷流程同時檢測抗HAVIgM和IgG時：4種情況僅檢測抗-HAVIgM時甲型肝炎抗-HAVIgM陽性抗-HAVIgG陽性甲型肝炎1.2.既往感染，對甲肝有免疫力排除甲肝，而且為易感者抗-HAVIgM陰性抗-HAVIgG陽性抗-HAVIgM陰性抗-HAVIgG陰性3.陽性陰性排除第十三頁，共六十四頁。甲型肝炎診斷流程同時檢測抗HAVIgM和IgG時：4種情況甲型肝炎早期或IgM假陽性1-2周后復(fù)查甲型肝炎甲型肝炎IgM假陽性排除甲型肝炎抗-HAVIgM陽性抗-HAVIgG陰性IgM陽性IgG陽性IgM陰性IgG陽性IgM陽性IgG陰性4.第十四頁，共六十四頁。乙型肝炎病毒HBV顆粒完整HBV：

Daneparticle；球形，42nm，雙層殼膜結(jié)構(gòu)小球形顆粒：22nm，乙肝表面抗原（hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg）絲狀(管狀)顆粒：直徑22nm，長短不等，HBsAg18.7萬倍20萬倍25萬倍HBV雙層殼膜結(jié)構(gòu)，外層是HBsAg，內(nèi)層是HBcAg第十五頁，共六十四頁。HBV基因與基因產(chǎn)物pre-S1pre-S2ORFSORFPORFXORFCpre-C+-5’5’HBsAgPolymerase:DNApolymeraseRNaseHReversetranscriptaseothers

HBxAgHBcAgHBeAgpre-S1pre-S2第十六頁，共六十四頁。HBV主要結(jié)構(gòu)示意圖HBsAgHBcAgHBVDNAHBeAg不是病毒的結(jié)構(gòu)成份第十七頁，共六十四頁。HBVPreC/C基因序列1814atgcaactttttcacctctgcctaatcatctcttgttcatgtcctac1861tgttcaagcctccaagctgtgccttggggggctttgggacatggacattg1911accactataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgcct1961tttgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctctgctct2011ctatcgagaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacag2061cactcaggcaagctgttctgtgttggggtgagttgatgaatctggccacc2111tgggtgggaagtaatttggaagacccagcatccagggaattagtagtcgg2161ctatgtcaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactattggggtttc2211acatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttctagagtatttggtg2261tcttttggagtgtggattcgcactcctcccgcttacagaccaccaaatgc2311ccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttagacgacgaggca2361ggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcg2411ccgcgtcgcagaagatctaaatctcgggaatctcaatgttag第十八頁，共六十四頁。MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGGLWDM

DIDHYKEFGASVELLSFLPFDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAVLCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVGYVNVNMGLKIRQLLGFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSKSRESQC147-149HBVPreC/C編碼HBcAg/HBeAgHBcAg:21.5kDHBeAg:15.5kD第十九頁，共六十四頁。HBV抗原5’3’5’3’42nmHBsAgHBcAgHBVDNAHBeAg不是HBV本身的成分是HBcAg的裂解產(chǎn)物能釋放到細胞外外周血能測到能釋放到細胞外外周血能測到不能釋放到細胞外外周血不能測到外周血無游離HBVDNA檢測時先裂解HBVHBV示意圖第二十頁，共六十四頁。HBV抗原5’3’5’3’42nmHBsAgHBcAgHBVDNAHBeAg不是HBV本身的成分是HBcAg的裂解產(chǎn)物能釋放到細胞外外周血能測到能釋放到細胞外外周血能測到不能釋放到細胞外外周血不能測到外周血無游離HBVDNA檢測時先裂解HBVHBV示意圖第二十一頁，共六十四頁。HBV攜帶者肝臟每天釋放1010~12病毒血液HBsAg是HBV的1000~100000倍HBV編碼抗原特點第二十二頁，共六十四頁。HBsAg抗-HBsHBsAg+，有傳染性HBsAg+和HBeAg+，傳染性強HBsAg-，無傳染性，除隱匿性感染或變異外抗-HBs+，>10mIU/ml，有保護力HBeAg抗-HBe抗-HBc乙型肝炎病原學(xué)檢測HBVDNA有條件的開展抗病毒治療考核療效第二十三頁，共六十四頁。乙肝血清學(xué)檢測結(jié)果的意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義+-+-+感染、傳染性強+--++感染、有傳染性+--+-感染、有傳染性+---+感染、有傳染性+-+--感染、傳染性強+++/-+/-+/-感染、有傳染性、病毒可能變異+----感染潛伏期、有傳染性+----接種疫苗后、無傳染性第二十四頁，共六十四頁。HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義-+-++既往感染已恢復(fù)、有保護力-+--+既往感染已恢復(fù)、有保護力-+-+-既往感染已恢復(fù)、有保護力-+---接種疫苗或既往感染已恢復(fù)、有保護力---++既往感染已恢復(fù)、無保護力---+-既往感染已恢復(fù)、無保護力----+既往感染已恢復(fù)、無保護力-----既往無感染、易感人群乙肝血清學(xué)檢測結(jié)果的意義第二十五頁，共六十四頁。為什么可通過檢測外周血抗原診斷HBV感染？HBeAg能釋放到細胞外－－比較容易測到HBsAg能釋放到細胞外－－可測到HBV攜帶者肝臟每天釋放1010~12病毒血液HBsAg是HBV的1000~100000倍其他病毒復(fù)制過程中，缺乏類似特性，不釋放游離抗原，故通常不檢測抗原，而通過檢測特異性抗體而診斷。以上原因，決定了診斷HBV感染可通過檢測病毒抗原。容易測到第二十六頁，共六十四頁?？?HBc的意義抗-HBcIgG：長期存在，陽性時如HBsAg陰性，既往感染抗-HBcIgM：短期存在，陽性時，通常HBsAg也陽性；見于急性感染或慢性攜帶者急性發(fā)作實際工作中，抗-HBc陽性具有傳染性－－基本不正確－－抗-HBcIgM具有傳染性－－正確目前檢測的抗-HBc是總抗體，包括IgG、IgM等，只要IgG陽性，抗-HBc即陽性；多數(shù)情況下，抗-HBc陽性僅是IgG抗體陽性。正確－－HBsAg陽性具有傳染性第二十七頁，共六十四頁。HBsAg(－)HBeAg(+)陽性HBV攜帶者March2008October2008January2009HBsAg(IU/ml)--(0.01)-(0.00)抗-HBs(mIU/ml)++

(5356)+

(11578)

HBeAg++

(72.78)+

(72.89)抗-HBe--(4.33)-(4.28)抗-HBc++

(11.89)+

(15.91)抗-HBcIgMnotdone--ALT(U/L)21.024.221.5HBVDNA(copies/ml)notdone+

(491)+

(370)第二十八頁，共六十四頁。HBsAg(－)HBeAg(+)陽性攜帶者新的S基因變異PCR產(chǎn)物測序克隆后測序第二十九頁，共六十四頁。preS2geneHBsAg(－)HBeAg(+)陽性攜帶者前S2基因序列PCR產(chǎn)物測序克隆后測序第三十頁，共六十四頁。HBsAg(－)HBeAg(+)陽性HBV攜帶者IF3.124第三十一頁，共六十四頁。具有研究價值的HBV標本HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc研究內(nèi)容+++/-+/-+/-變異+----轉(zhuǎn)歸+-+--轉(zhuǎn)歸+--+-？抗c陰性-+-+-？抗c陰性-+---？抗c陰性*---+-？抗c陰性*未接種疫苗，即自然感染除外。第三十二頁，共六十四頁。丙型肝炎病毒HCVHCV30-60nm有包膜的RNA病毒，核心含有核心蛋白和RNA－－單鏈正義HBVHCV抵抗力弱，且RNA容易降解，檢測核酸時，標本需在30分鐘內(nèi)分離血清，-80oC保存。第三十三頁，共六十四頁。Lipidlayer脂質(zhì)層Core,核心蛋白E1,包膜蛋白1E2,包膜蛋白2RNA,病毒核酸直徑30-60nm結(jié)構(gòu)蛋白HCV結(jié)構(gòu)簡圖糖基化蛋白HCV示意圖第三十四頁，共六十四頁。HCV基因與基因產(chǎn)物hypervariableregion1,HVR1UntranslatedRegion,UTRNoncodingregion,NCR針對HCV所有抗原的抗體都沒有證實有中和作用第三十五頁，共六十四頁。HVR138clones15sequencesHCV高度變異HVR1第三十六頁，共六十四頁?？乖瓩z測HCVcore:僅用于研究抗-HCVIgM：一般不開展，陽性率低HCVRNA：有條件的開展；抗病毒治療考核療效抗-HCVIgG：開展，(+)通常表示有HCV感染HCV病原學(xué)診斷針對HCV所有抗原的抗體都沒有證實有中和作用第三十七頁，共六十四頁?？?HCVIgM：一般不開展抗-HCVIgG：開展，90-95％的(+)提示HCV感染HCV病原學(xué)診斷－－抗-HCV檢測包被抗原1st代3rd代2nd代50-75%90-95%95-99%陽性率第三十八頁，共六十四頁。丁型肝炎病毒HDVDeltavirusgenus中的唯一病毒HDV,36nmHDVRNA,1.7kb缺陷病毒，必須有HBsAg第三十九頁，共六十四頁。HDAg：僅用于研究抗-HDIgM：(＋)近期感染抗-HDIgG：(＋)感染HDVRNA：僅用于研究HDV病原學(xué)檢測僅在HBsAg陽性人群中檢測才有意義：第四十頁，共六十四頁。戊型肝炎病毒HEV屬于familyHepeviridae,genusHepevirusHEV,30-32nm無包膜：抗原種類少新的HEV發(fā)現(xiàn)：兔HEV－－王佑春等第四十一頁，共六十四頁。HEV基因及其蛋白ORF1ORF3？ORF25’3’核衣殼Capsid非結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白主要抗原決定簇中和免疫459607核酸：單鏈正義RNA，7.2kb第四十二頁，共六十四頁。02468101214轉(zhuǎn)氨酶升高期癥狀期IgMIgG病毒血癥大便排病毒抗戊肝抗體濃度感染后周數(shù)HEV感染后人體抗體應(yīng)答－－與HAV類似抗-HEVIgM：感染后～3周即可陽性，1-3月后轉(zhuǎn)陰，近期或急性感染?？?HEVIgG：IgM產(chǎn)生后數(shù)天即可陽性，存在數(shù)十年，單純陽性很可能是既往感染，故單獨檢測抗-HAVIgG通常不用于診斷。第四十三頁，共六十四頁。HEV抗原：一般不開展，僅用于研究HEV病原學(xué)檢測－－與甲肝類似抗-HEVIgM：(＋)近期感染抗-HEVIgG：雙份血清HEVRNA：一般不開展，僅用于研究第四十四頁，共六十四頁。HEV病原診斷－－抗-HEV同時檢測抗HAVIgM和IgG時：4種情況僅檢測抗-HEVIgM時戊型肝炎抗-HEVIgM陽性抗-HEVIgG陽性戊型肝炎1.2.既往感染，對戊肝有免疫力排除戊肝，而且為易感者抗-HEVIgM陰性抗-HEVIgG陽性抗-HEVIgM陰性抗-HEVIgG陰性3.陽性陰性排除第四十五頁，共六十四頁。同時檢測抗HAVIgM和IgG時：4種情況戊型肝炎早期或IgM假陽性1-2周后復(fù)查戊型肝炎戊型肝炎IgM假陽性排除戊型肝炎抗-HEVIgM陽性抗-HEVIgG陰性IgM陽性IgG陽性IgM陰性IgG陽性IgM陽性IgG陰性4.HEV病原診斷－－抗-HEV第四十六頁，共六十四頁?？?HEV檢測試劑質(zhì)量差異很大(國外)方法種類抗原ORF來源病毒+血<6月9例+血>6月20例-血清22例1EIAR2昆蟲巴基91802EIAR2昆蟲緬甸92003WBR2昆蟲緬甸9201[6]4WBR2,3大腸中國8190[1]5EIAR2大腸緬甸91906EIAR2,3大腸緬,墨51407EIAR2,3大腸緬,墨91708EIAR2,3大腸緬,墨614[1]09EIAS3－緬甸115[2]10EIAS2－緬甸7[1]3[6]011EIAS3－緬,墨22012EIAS2,3－緬,墨6100Hepatology1998;27:857-861.第四十七頁，共六十四頁。12種檢測方法早期康復(fù)期血清抗-HEV滴度Hepatology1998;27:857-861.WBWB昆蟲大腸桿菌合成肽第四十八頁，共六十四頁?？?HEVIgG診斷試劑陽性率比較(國內(nèi)外)廠商結(jié)果明確人群(符合率%)總符合率%230例普通人群(%)患者24例非患者30例萬泰+23(95.83)1(3.33)96.3073(31.74)-1(4.17)29(96.67)高達+21(87.50)094.4440(17.39)-3(12.50)30(100)華美+21(87.50)1(3.33)92.5955(23.91)-3(12.5)29(96.67)GeneLab+16(66.67)085.1818(7.83)-8(33.33)30(100)科華+11(45.83)075.938(3.48)-13(54.17)30(100)不同試劑檢測結(jié)果偏差很大，尤其在血清流行病學(xué)調(diào)查。中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志2007;21(1):59-61.第四十九頁，共六十四頁?？?HEVIgM抗-HEVIgG檢測方法存在一定假陽性和假陰性第五十頁，共六十四頁。607-660ORF21-111458-607ORF3-EORF3-S112391123ORF36601主要抗原決定簇GeneLabs試劑的抗原，間接法JVirolMethods1992;38(1):175–86.包被抗原ORF2ORF31和2型、合成肽和細菌表達靈敏度和特異性低第五十一頁，共六十四頁。ORF2衣殼蛋白，72kDa國產(chǎn)抗-HEV試劑盒所用抗原萬泰公司抗原：IgM，包被mu鏈，酶標抗原IgG，包被抗原，酶標二抗3946061660特異性高靈敏度較高458-607高達試劑：合成肽？同時包括了ORF2和ORF3多肽抗原，具體不詳？首都公共衛(wèi)生2007;1(4):168-170.華美公司和科華公司：第五十二頁，共六十四頁。靈長動物實驗感染后抗-HEVIgM和IgG應(yīng)答Yu,etal.CGLI2003第五十三頁，共六十四頁。急性戊肝病人抗-HEVIgM和IgG應(yīng)答Seriwatana,etal.CGLI2002第五十四頁，共六十四頁。如何提高戊型肝炎診斷的準確性？急性HEV感染，發(fā)病時抗-HEVIgM和IgG通常同時陽性確診同時檢測抗-HEVIgG和IgMIgG＋IgM＋IgG－IgM＋IgG＋IgM－IgG－IgM－1－2周后復(fù)查排除既往感染IgG＋IgM＋IgG－IgM＋IgG－IgM－確診假陽性假陽性第五十五頁，共六十四頁。Ch1374(Sar-55,I)A450Ch1375(Sar-55,1)458-6071660112-6070.00.53.03.50246810131517112-607458-607475-607475-607Ch1374(Sar-55,1)感染后周數(shù)感染后周數(shù)0.00.51.01.52.02.53.03.50246810131517112-607458-607475-607A4501.01.52.02.5利用抗原主要決定簇多肽的高反應(yīng)性檢測陽性標本利用抗原主要決定簇截短肽的無反應(yīng)性排除假陽性如何提高戊型肝炎診斷的準確性？第五十六頁，共六十四頁。表達載體HEVORF21660459459607594ORF2多肽的蛋白表達472607將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌第五十七頁，共六十四頁。123123123459-607459-594472-607kDa362216ORF2多肽大腸桿菌表達ORF2多肽SDS電泳結(jié)果第五十八頁，共六十四頁。459-607459-594472-607459-607459-594472-607kDa36221650二聚體單體SDS加樣緩沖液煮沸5min不加熱