常見tag蛋白標簽介紹

時間：二時間：二O二一年七月二十九日時間：二O二一年七月二十九日卵白標簽(proteintag)是指利用DNA體外重組技術，與目的卵白一起融合表達的一種多肽或者卵白，以便于目的卵白的表達、檢測、示蹤和純化等.隨著技術的不竭發(fā)展，研究人員相繼開發(fā)出了具有各種分歧功能的卵白標簽.目前,這些卵白標簽已在基礎研究和商業(yè)化產物生產等方面獲得了廣泛的應用.美國GeneCopoeia(復能基因)為客戶提供50多種卵白標簽，可以滿足客戶的分歧需求,包括各種最新型的標簽,如：SNAP-Tag?、HaloTag?、AviTag?、Sumo等；也提供齊全的各種經常使用標簽,如eGFP、His、Flag等等標簽.以下是部份卵白標簽的特性介紹,更加詳細的介紹可在查詢克隆產物的結果列內外面看到各種推薦的卵白標簽和載體.TrxHISHis6是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽,可拔出在目的卵白的C末端或N末端.當某一個標簽的使用,一是能構成表位利于純化和檢測；二是構成共同的結構特征（結合配體）利于純化.組氨酸殘基側鏈與固態(tài)的鎳有強烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析（IMAC）,對重組卵白進行分離純化.使用His-tag有下面優(yōu)點：標簽的分子量小，只有?0.84KD,而GST和卵白A分別為?26KD和?30KD,一般不影響目標卵白的功能；His標簽融合卵白可以在非離子型概況活性劑存在的條件下或變性條件下純化,前者在純化疏水性強的卵白獲得應用，后者在純化包容體卵白時特別有用用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜卵白，使復性不受其它卵白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復性；His標簽融合卵白也被用于卵白質-卵白質、卵白質-DNA相互作用研究；His標簽免疫原性相對較低，可將純化的卵白直接注射植物進行免疫并制備抗體.可應用于多種表達系統(tǒng),純化的條件溫和；可以和其它的親和標簽一起構建雙親和標簽.Flag標簽卵白Flag標簽卵白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合卵白在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高.FLAG作為標簽卵白，其融合表達目的卵白后具有以下優(yōu)點：FLAG作為融合表達標簽，其通常不會與目的卵白相互作用而且通常不會影響目的卵白的功能、性質，這樣就有利用研究人員對融合卵白進行下游研究.融合FLAG的目的卵白，可以直接通過FLAG進行親和層析,此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合卵白，而且純化效率高.FLAG作為標簽卵白，其可以被抗FLAG的抗體識別,這樣就方便通過WesternBlot、ELISA等方法對含有FLAG的融合卵白進行檢測、鑒定.融合在N真?zhèn)€FLAG,其可以被腸激酶切除（DDDK），從而獲得特異的目的卵白.因此現FLAG標簽已廣泛的應用于卵白表達、純化、鑒定、功能研究及其卵白相互作用等相關領域.MBP（麥芽糖結合卵白）MBP（麥芽糖結合卵白）標簽卵白年夜小為40kDa,由年夜腸桿菌K12的malE基因編碼.MBP可增加在細菌中過量表達的融合卵白的溶解性,尤其是真核卵白.MBP標簽可通過免疫分析很方便地檢測.有需要用位點專一的卵白酶切割標簽.如果卵白在細菌中表達,MBP可以融合在卵白的N端或C端.純化：融合卵白可通過交聯(lián)淀粉親和層析一步純化.結合的融合卵白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進行洗脫.結合親和力在微摩爾范圍.一些融合卵白在0.2%TritonX-100或0.25%Tween20存在下不能有效結合，而其他融合卵白則不受影響.緩沖條件為PH7.0到8.5,鹽濃度可高達1M,但不能使用變性劑.如果要去除MBP融合部份,可用位點特異性卵白酶切除.檢測：可用MBP抗體或表達的目的卵白特異性抗體檢測.GST（谷胱甘肽巰基轉移酶）GST（谷胱甘肽巰基轉移酶）標簽卵白自己是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶,它的天然年夜小為26KD.將它應用在原核表達的原因年夜致有兩個,一個是因為它是一個高度可溶的卵白,希望可以利用它增加外源卵白的可溶性；另一個是它可以在年夜腸桿菌中年夜量表達,起到提高表達量的作用.GST融合表達系統(tǒng)廣泛應用于各種融合卵白的表達,可以在年夜腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達.結合的融合卵白在非變性條件下用10mM還原型谷胱甘肽洗脫.在年夜大都情況下,融合卵白在水溶液中是可溶的,并形成二體.651標簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測.標簽有助于呵護重組卵白免受胞外卵白酶的降解并提高其穩(wěn)定性.在年夜大都情況下GST融合卵白是完全或部份可溶的.純化：該表達系統(tǒng)表達的GST標簽卵白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠（Glutathionesepharose）親和樹脂進行純化.GST標簽卵白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保管了卵白的抗原性和生物活性.GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強變性劑如：鹽酸胍或尿素等.如果要去除GST融合部份,可用位點特異性卵白酶切除.檢測：可用GST抗體或表達的目的卵白特異性抗體檢測.HAHA標簽卵白，標簽序列YPYDVPDYA,源于流感病毒的紅細胞凝集素概況抗原決定簇,9個氨基酸,對外源靶卵白的空間結構影響小，容易構建成標簽卵白融合到N端或者C端.易于用Anti—HA抗體檢測和ELISA檢測.c-MycC-Myc標簽卵白，是一個含11個氨基酸的小標簽,標簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu,這11個氨基酸作為抗原表位表達在分歧的卵白質框架中仍可識別其相應抗體.5帆丫。tag已勝利應用在Western-blot雜交技術、免疫沉淀和流式細胞計量術中，可用于檢測重組卵白質在靶細胞中的表達.eGFPeGFP標簽卵白，是增強型綠色熒光卵白eGFP,激發(fā)波長為488nm,發(fā)射波長為507nm,其是由野生型綠色熒光卵白GFP通過氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來的.相對GFP,eGFP熒光強度更強、熒光性質更穩(wěn)定.同時載體中構建的Kozak序列使得含有eGFP的融合卵白在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高.eGFP作為標簽卵白,其融合表達目的卵白后具有以下優(yōu)點：不用破碎組織細胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發(fā)出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達情況，而且熒光性質穩(wěn)定被譽為活細胞探針其自發(fā)熒光,不需用目的基因的抗體或原位雜交技術就可推知目的基因在細胞中的定位等情況同時細胞內的其它產物不會干擾標簽卵白檢測，從而使其檢測更顯得快速、簡便、靈敏度高而且重現性.其低消耗、高靈敏度檢測，十分適用于高通量的藥物篩選.因此現eGFP表達標簽被廣泛地應用于基團表達調控、轉基因功能研究、卵白在細胞中的功能定位、遷移變動及藥物篩選等方面.另外由我公司提供的IRES雙順反子載體,可同目的基因共表達eGFP,用于目的基因的體內卵白示蹤研究.eYFPeYFP標簽卵白為增強型黃綠色熒光卵白eYFP,激發(fā)波長為513nm,發(fā)射波長為527nm,其是由野生型黃綠色熒光卵白YFP通過氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來的.相對YFP,eYFP熒光強度更強、熒光性質更穩(wěn)定.同時載體中構建的Kozak序列使得含有eYFP的融合卵白在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高.eYFP作為標簽卵白,其融合表達目的卵白后具有以下優(yōu)點：不用破碎組織細胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發(fā)出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達情況，而且熒光性質穩(wěn)定被譽為活細胞探針其自發(fā)熒光,不需用目的基因的抗體或原位雜交技術就可推知目的基因在細胞中的定位等情況同時細胞內的其它產物不會干擾標簽卵白檢測，從而使其檢測更顯得快速、簡便、靈敏度高而且重現性.其低消耗、高靈敏度檢測，十分適用于高通量的藥物篩選.因此現eYFP表達標簽被廣泛的應用與基團表達調控、轉基因功能研究、卵白在細胞中的功能定位、遷移變動及藥物篩選等方面.另外由我公司提供的IRES雙順反子載體,可同目的基因共表達eYFP,用于目的基因的體內卵白示蹤研究.eCFPeCFP標簽卵白為增強型青色熒光卵白eCFP,激發(fā)波長為433nm或453nm,發(fā)射波長為475nm或501nm,其是由野生型青色熒光卵白CFP通過氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來的.相對CFP,eCFP熒光強度更強、熒光性質更穩(wěn)定.同時載體中構建的Kozak序列使得含有eCFP的融合卵白在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高.eCFP作為標簽卵白，其融合表達目的卵白后具有以下優(yōu)點：不用破碎組織細胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發(fā)出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達情況，而且熒光性質穩(wěn)定被譽為活細胞探針其自發(fā)熒光,不需用目的基因的抗體或原位雜交技術就可推知目的基因在細胞中的定位等情況.同時細胞內的其它產物不會干擾標簽卵白檢測，從而使其檢測更顯得快速、簡便、靈敏度高而且重現性.其低消耗、高靈敏度檢測，十分適用于高通量的藥物篩選.因此現eCFP表達標簽被廣泛的應用與基團表達調控、轉基因功能研究、卵白在細胞中的功能定位、遷移變動及藥物篩選等方面.AviTagAviTag標簽卵白是一個15個氨基酸的短肽,具有一個單生物素化賴氨酸位點,與已知天然可生物素化序列完全分歧,可以加在目標卵白的N端和C端.融合表達后,可被生物素連接酶生物素化,為了純化重組卵白選用低親和性的單體抗生物素卵白或抗生物素卵白衍生物,除用于卵白質分離純化,還用于卵白質相互作用研究.AviTag標簽系統(tǒng)具有以下幾年夜優(yōu)點：無論在體外或者體內，幾乎所有的卵白都可以在一個共同的AviTag位點輕易且有效地被生物素化；生物素化是通過酶和底物的反應來實現,反應條件相當溫和而且標識表記標幟的專一性極高；生物素AviTag只有15個氨基酸,對卵白空間結構的影響非常小.SNAP-TagSNAP-Tag是新一代的卵白標簽技術,不單專一性極高而且穩(wěn)定,最年夜的優(yōu)點是適用于多種環(huán)境下的卵白質檢測與純化,如活細胞內、溶液中、或固態(tài)相^DSDSgels）等.SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）獲得.無論體內還是體外,SNAP-Tag都能與底物高特異性地共價結合，使卵白標識表記標幟上生物素或熒光基團（如熒光素和若丹明）.SNAP所帶的活性巰基位點接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側鏈苯甲基基團，釋放出了鳥嘌呤.這種新的硫醚鍵共價結合使SNAP所帶的目的卵白攜帶上了苯甲基基團所帶的標識表記標幟物.苯甲基鳥嘌呤在生化條件下穩(wěn)定,而且沒有其他卵白會和這類物質作用，所以SNAP標簽反應是高特異的.檢測：生物素或各種顏色熒光的底物（如熒光素、若丹明）可滲透進入細胞,方便快捷地進行活細胞內SNAP-Tag融合卵白的標識表記標幟與檢測.它們也可特異性地標識表記標幟年夜腸桿菌,酵母和哺乳植物等細胞抽提液或已經純化的卵白液中的SNAP-tag融合卵白.將純化的或未純化的SNAP-Tag融合卵白與概況固定了苯甲基鳥嘌呤的基質混合,卵白即可特異與底物作用，形成共價鍵,融合卵白間時間：二時間：二O二一年七月二十九日接被固定在了基質概況上,可以到達更方便快捷地研究卵白功能或純化卵白的目的.HaloTagHaloTag?標簽卵白是一種脫鹵素酶的遺傳修飾衍生物,可與多種合成的HaloTag?配基有效地共價結合.這個分子量為33KDa的單體卵白能融合在重組卵白的N端或C端,并在原核和真核系統(tǒng)中表達.HaloTag?配基是小分子化學物，能夠在體外或體內與HaloTag?卵白共價結合.這些配基由兩個關鍵組分組成：(1)一個通用的HaloTag?反應聯(lián)結子,結合HaloTag?卵白；(2)一個功能基團,例如熒光染料或親和媒介.能夠共價和特異性結合多種合成的陳說基團和親和配基的特性，使得HaloTag?卵白能夠用于檢測和親和結合或固相化固定目的卵白.SUMOSUMO標簽卵白是一種小分子泛素樣修飾卵白(Smallubiquitin-likemodifier)，是泛素(ubiquitin)類多肽鏈超家族的重要成員之一.在一級結構上,SUMO與泛素只有18%的同源性,然而兩者的三級結構及其生物學功能卻十分相似.研究發(fā)現SUMO可以作為重組卵白表達的融合標簽和分子伴侶,不單可以進一步提高融合卵白的表達量,且具有抗卵白酶水解以及增進靶卵白正確折疊,提高重組卵白可溶性等功能.另外SUMO還有一項重要的應用，就是可用于完整地切除標簽卵白，時間：二O二一年七月二十九日時間：二時間：二O二一年七月二十九日時間：二時間：二O二一年七月二十九日獲得天然卵白.因為SUMO卵白水解酶(我公司可提供)能識別完整的SUMO標簽卵白序列,并能高效地把SUMO從融合卵白上切割下來.切除SUMO后,經過親和層析,去除標簽卵白部份,就獲得和天然卵白一樣的重組卵白.所以SUMO標簽也經常使用于和其他標簽一起應用，作為特異酶切水解位點.熒光素酶