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文檔簡介

斑點印跡雜交

掌握斑點印跡雜交的原理及方法

實驗目的雜交：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等）可按堿基互補原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。雜交的雙方是待測核酸及探針。斑點雜交：是指將待測的DNA變形后點加在硝酸纖維素膜（或尼龍膜）上，用已標記的探針進行雜交，洗膜（除去未結(jié)合的探針），放射自顯影，判斷是否有雜交或其雜交強度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測。根據(jù)點樣磨具不同，點樣形狀呈圓形稱為斑點雜交，呈狹縫形則稱為狹縫雜交。實驗原理

斑點印跡雜交不需要電泳和轉(zhuǎn)移，雜交過程包括點樣，變性，中和，干燥固定，預雜交，雜交，封閉，檢測雜交結(jié)果等步驟，相對southern印跡雜交和Northern印記雜交來說快，適合于同時分析多個樣品。實驗步驟：變性：按8:1將80ulddH2O加入至10ul待測DNA樣品中，稀釋樣品。100℃加熱10min后，立即置于冰中5min（使DNA變性），加入90ul20×SSC混勻。點樣：將上述變性后的樣品180ul點在尼龍膜的毛面上，真空抽濾，室溫下風干后，于烤箱中120℃烘烤15min。使變性的DNA與膜結(jié)合牢固預雜交：將膜封入15ml離心管中，做好剪角標記。加入預雜交液3ml。置42℃恒溫搖床上，輕輕振搖30min。封閉雜交膜上多余的非特異性DNA結(jié)合位點雜交：加入探針3ml（生物素-DNA），置42℃恒溫床上，輕輕振蕩1-2h。變性DNA與探針結(jié)合斑點

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