細菌與噬菌體的遺傳重組分析

關于細菌與噬菌體的遺傳重組分析第1頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五

細菌和病毒在遺傳研究中的優(yōu)越性第2頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五

第3頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五

第4頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五第一節(jié)細菌的遺傳分析一、細菌遺傳的研究方法二、遺傳分析轉化（Transformation）接合（Conjunction）性導（Sexduction）轉導（Transduction）第5頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五一、細菌遺傳的研究方法

理化誘變：1、合成代謝功能的突變型（營養(yǎng)缺陷型）：

ade＋ade－

his

＋his－2、分解代謝功能的突變型：

lac＋lac－（乳糖）gal＋gal－（半乳糖）3、抗性突變型：3.1抗藥性：str＋str－(鏈霉素)azi＋azi－(疊氮化物)3.2抗噬菌體：T2s(+)T2r(-)tonAs

tonAr

(T1)第6頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五第7頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五細菌生活條件：基本培養(yǎng)基（BasalMedium）：無機鹽：SO42-、NO3-、

Ca2+、Mg2+

糖：葡萄糖、蔗糖維生素：生物素、Vbs

僅能滿足微生物野生型菌株生長需要的培養(yǎng)基

完全培養(yǎng)基：

BM＋全部營養(yǎng)物質凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或者半天然培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：

凡是只能滿足相應的營養(yǎng)缺陷型生長需要的組合培養(yǎng)基原養(yǎng)型、營養(yǎng)突變型、條件致死突變型p206

第8頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五

試驗方法：

Lederbergetal.1952

第9頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五二、遺傳分析（1）發(fā)現(xiàn)：

1928，Griffith：肺炎雙球菌轉化實驗

1944，Avery：轉化子－DNA

轉化是細菌基因重組的方法之一。（2）概念：

細菌吸附游離態(tài)的外源雙鏈DNA，將單鏈DNA分子吸收進入細胞后，不經(jīng)過復制整合到細菌染色體中，并發(fā)生遺傳重組的過程。

1、轉化（Transformation）p213第10頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（3）轉化DNA（轉化子）的特點：

a.DNA濃度與轉化子數(shù)目的關系飽和：50/cell,原因：在細菌的細胞壁或細胞膜上有固定數(shù)量的DNA接受座位，故一般細菌攝取的DNA分子數(shù)小于10個。

b.DNA片段大?。翰荒芴。悍窝纂p球菌轉化：DNA片斷至少有800個堿基對；枯草桿菌的轉化：DNA片斷至少有16000個堿基對。

c.雙鏈吸附：單鏈DNA不被轉化

d.單鏈進入細菌。DNA濃度轉化子數(shù)目第11頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（4）受體細胞的特點

a.感受態(tài)：

DNA合成剛剛停止、蛋白質合成繼續(xù)活躍，活躍合成的蛋白質可使細菌細胞壁易于接受轉化DNA。只有感受態(tài)的受體細胞才能攝取并轉化外源DNA，而這種感受態(tài)也只能發(fā)生在細菌生長周期的某一時間范圍內。

b.感受態(tài)的本質：部分原生質化：10/cell

酶受體：

第12頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（5）轉化過程：①．雙鏈結合與單鏈穿入：

雙鏈DNA分子結合在接受座位上。可逆，可被DNA酶降解，接受座位飽和性；單鏈DNA攝取，不可逆，不受DNA酶破壞。穿入后，由外切酶或DNA移位酶降解其中一條鏈。②．聯(lián)會：

DNA片段與細菌染色體部分聯(lián)會。親緣關系越遠，聯(lián)會越小、轉化可能性越小。③．整合(重組)：單鏈的轉化DNA與受體DNA對應位點的置換，從而穩(wěn)定地參入到受體DNA中。第13頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（6）轉化成功：感受態(tài)、吸附、整合。（7）轉化與基因重組作圖：

第14頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五2、接合（Conjugation）（1）概念：在原核生物中，遺傳物質從供體-“雄性”轉移到受體-“雌性”的過程。

♂

♀

DNA接觸（供體donor）（受體receptor）第15頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（2）發(fā)現(xiàn)與證實：a.發(fā)現(xiàn)：LederbergTatum（1946營養(yǎng)缺陷型）第16頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五b.證實轉化作用的排除：

A（殺死）＋B或者A＋B（殺死）（無）DavisU型管試驗（無）DNase處理（有）回復突變突變的排除：

單個基因回復突變頻率＝10-6

兩個基因同時回復突變的頻率＝10-6×10-6＝10-12<10-7兩個菌株間需要直接接觸才能形成原養(yǎng)型！

Lederberg和Tatum根據(jù)實驗作解釋，認為上述原養(yǎng)型是兩個親本品系基因的重組體。在E.coli中基因重組經(jīng)一系列步驟進行：（1）細胞融合；（2）親本細胞的遺傳物質經(jīng)過融合形成二倍體合子；（3）遺傳物質發(fā)生交換的合子經(jīng)過減數(shù)分裂產(chǎn)生了帶有重組基因的子代細菌。第17頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五

上述的解釋雖然比較正確，但其中有一點卻被Hayes的一個意外發(fā)現(xiàn)所否定。Lederbery和Tatum認為兩個親本細菌在基因重組過程中起著同等作用－E.coli的性系統(tǒng)是同宗配合（homothallic）。

Hayes則證明：E.coli遺傳物質的傳遞方式與具有典型減數(shù)分裂的生物不同。例如：兩個親本類型對后代的遺傳貢獻并不相等，有些親本基因的組合會在后代出現(xiàn)，有一些則不會出現(xiàn)，而且所有后代中出現(xiàn)的基因都是連鎖的，因此，E.coli的有性過程應該是異宗配合的（heterothallic）。c.本質（E.coli）遺傳物質的單方向（one-way）轉移

第18頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五Hayes做了一個雜交實驗，用的品系與Lederbery和Tatum用的相似，即：

品系A：met-thr+Leu+thi+

品系B：met+thr-Leu-thi-

在雜交前，將品系A用高劑量的鏈霉素處理（鏈霉素并不立即殺死它們，只是阻礙細胞的分裂）①Streptomycin處理A×B

基本培養(yǎng)基（BM）

原養(yǎng)型重組體②對照A×BBM

原養(yǎng)型重組體

③A×streptomycin處理BBM無原養(yǎng)型重組體第19頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（3）F因子：a.發(fā)現(xiàn)1952年：

W.Hayes試驗證明：接合過程中，遺傳物質單向轉移，供體（donor）－♂A菌株受體（receptor）－♀B菌株1953年：

Hayes，Leaderberg&Cavalli：♂有F因子♀無F因子第20頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五b.F因子的遺傳結構質粒：舊稱附加體，是指獨立于細菌染色體的可以獨立、整合、環(huán)出、丟失含有少量基因的雙鏈DNA環(huán)狀分子F

因子(致育因子、性因子)：是一種感染性質粒，由于F因子存在與否決定是否接合，又稱為致育因子。F因子的遺傳結構：圖7-12根據(jù)F因子存在的方式，E.Coli可以分為4種菌株第21頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五F＋HfrF＋整合準確環(huán)出配對、交換準確環(huán)出丟失不準確環(huán)出F’F－攜帶1個基因～半條染色體第22頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五c.接合過程F+×F－F++F+Hfr×F－Hfr+F－復制：滾環(huán)模式第23頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五d.部分二倍體、交換與遺傳重組cb+a+c+ba單交換I降解第24頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（4）高頻重組(highfrequenceyof

recombination,Hfr)第25頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五abdhgfce

1

2

3cdefghabI

1

2

3cdefghabefghabcdII

3

2

1ghabcdeffedcbahgF＋HfrIII第26頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五細菌基因重組的特點:(1)F-細胞得到的只是供體細胞染色體的一部分，而F因子并沒有發(fā)生轉移；

(2)細菌基因重組是在部分二倍體中進行，只有偶數(shù)交換才產(chǎn)生有活性的重組體;

(3)相反的重組體不出現(xiàn).第27頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（a）.E.coli染色體的中斷雜交和遺傳作圖Wollman和Jacob的中斷雜交試驗

Hfr細菌的基因是按一定時間順序依次地出現(xiàn)在受體細胞，因為基因位于染色體上，即Hfr染色體以線性方式進入細胞中。Hfr：thr+leu+azirtonrlac+gal+strsF-

：thr-leu-azistonslac-gal-strr每隔一段時間取樣，人為中斷雜交稀釋菌液，防止再度配對涂布在含有str的基本培養(yǎng)基上HfrF-通氣混合培養(yǎng)第28頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五將其影印培養(yǎng)到若干不同的選擇培養(yǎng)基上，以分析Hfr菌株染色體上非選擇標記基因進入F-細菌的順序和所需時間

時間（分鐘）基因頻率Thr+8100（選擇標記）leu+8100（選擇標記）azir990tonr1170lac+1840gal+2525

同一個Hfr菌株的轉移起始點和轉移順序在不同的雜交試驗中都是一樣的。該轉移起始點稱為原點（origin，O）第29頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五Oazitonlacgal09111825minO09111825120azitonlacgalFmin2、中斷雜交技術（interruptedmatingtechnique）

根據(jù)供體基因進入受體細胞的順序和時間繪制連鎖圖的技術。第30頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五

用不同的Hfr菌株進行中斷雜交實驗，都可做成連鎖圖，基因轉移的順序、轉移起點和轉移方向很不相同。

根據(jù)上圖，可以得到直線連鎖圖；Hfr菌株足夠多，可以獲得整個E.coli染色體連鎖圖。例子：O

thithrprolacpurgalhisglythithrprolacpurOOOO第31頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五小結（作圖步驟）：（1）作直線連鎖圖，確定基因間距離及其染色體全長（分鐘）。（2）畫圓，根據(jù)染色體全長標示刻度，按照基因間距離標示基因。（3）標示Hfr起點、終點、菌株號。HfrAB312第32頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五b.重組作圖法：

兩基因轉移時間間距小于2分鐘時，中斷雜交法的圖距不精確，應采用傳統(tǒng)的重組作圖法。

利用Hfr菌與F-菌株雜交后，在部分二倍體中，若兩基因相距越近，在重組體中同時出現(xiàn)的機會越多；兩基因相距越遠，在重組體中同時出現(xiàn)的機會越少。根據(jù)重組體中某一性狀單獨出現(xiàn)的頻率作為兩基因間的交換率，就可以進行基因定位。

例：緊密連鎖二基因:

lac-(乳糖不發(fā)酵)ade-(腺嘌呤缺陷型)第33頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五Hfr：lac+ade+

strsF-

：lac-ade-strr在含有str無ade的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)選擇ade+

strr的重組子HfrF-混合培養(yǎng)60min再在EMB培養(yǎng)基上選擇哪些ade+strr的重組子為lac+

，哪些為lac-為何不用lac作為選擇標記？第34頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五=交換型重組體數(shù)交換型重組體數(shù)+未交換型重組體數(shù)100%=lac-ade+

(lac+ade+)+(lac-ade+)100%請注意與計算真核生物重組值的區(qū)別某一性狀單獨出現(xiàn)的菌落數(shù)重組體總菌落數(shù)100%兩基因間的交換率=兩個位點間的時間約為1分鐘，大約相當于20%的重組值=20%第35頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五lac-ade間發(fā)生交換l-a+srl+a+a-l-srsslac-ade間未發(fā)生交換l+a+a-l-srl+a+sr1、Hfr片段不能獨立復制，未整合進入F-基因組中去則隨細胞分裂而丟失；2、無ade的完全培養(yǎng)基上篩選出的菌落為lac+ade+

和lac-ade+，其中前者為兩基因外雙交換產(chǎn)物，lac和ade

基因并未發(fā)生重組，后者為兩基因間重組產(chǎn)物；3、另一交換產(chǎn)物lac+ade-在上述培養(yǎng)基中不能篩選出，即便篩出也沒意義，因為lac基因先于ade基因進入，而ade基因未進入而形成的交換產(chǎn)物，不能真實反映兩基因間的交換頻率；這也是為何選擇ade為篩選基因的原因！4、只有在缺乏ade基因的完全培養(yǎng)基中篩選出的lac-ade+才是重組子；第36頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五第37頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五3.性導（Sexduction）概念：接合以F’因子為媒介將供體菌染色體DNA轉移到受體細菌，形成部分二倍體的過程。第38頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五F’菌株的突出特點：

⑴F’因子轉移基因的比率極高，如同F(xiàn)+因子的轉移比率；

⑵F’因子的自然整合率極高，但是整合不是隨機的，需要

經(jīng)過配對整合到特定的座位上。第39頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五應用：（1）確定基因的顯隱性關系（上圖）。（2）繪連鎖遺傳圖：原理：F+

不同的Hfr不同的F’距離近的基因容易環(huán)出到同一個F’因子上“并發(fā)性導”詳盡的連鎖圖.

方法：同“并發(fā)轉導”第40頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五性別細菌狀態(tài)F因子狀態(tài)♀F-無F因子♂F+F因子為游離狀態(tài)♂HfrF因子整合到宿主染色體上♂F帶有部分宿主染色體的F因子，為游離狀態(tài)1、細菌細胞的兩種性別、四種狀態(tài)：小結第41頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五2、F+、F-、Hfr、F'的關系轉變關系F+F-丟失雜交F+Hfr整合到E.coli

染色體規(guī)則脫離E.coli

染色體F'Hfr

回復到Hfr染色體不規(guī)則脫離E.coli

染色體第42頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五F+×F-

低頻重組Hfr×F+

高頻重組F′×F+

一般為低頻重組，但對所攜帶的基因是高頻重組。3、重組頻率區(qū)別第43頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五4.轉導（Transduction）（1）概念：轉導：是指以噬菌體為媒介將供體細菌DNA導入到受體細菌并發(fā)生遺傳重組的過程。1/1000第44頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五轉導顆粒：溶菌噬菌體末期，噬菌體裝配過程中，外殼蛋白識別一定長度的DNA分子，形成成熟的子代噬菌體時，把寄主細菌的DNA片段“錯誤”地組裝到外殼蛋白中而形成。由于感染細菌的能力決定于噬菌體外殼蛋白，所以轉導顆粒具有和正常噬菌體相同的侵染能力。轉導體：轉導顆粒將供體細菌的染色體片段轉移到受體細菌，重組后的受體細菌叫作轉導體。第45頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五

黎德伯格（Leaderburg）與津德（Zinder）（1951）發(fā)現(xiàn)：鼠傷寒沙門氏菌中轉導現(xiàn)象：將兩個沙門氏菌的營養(yǎng)缺陷型進行雜交：

phe-try-tyr-met+his+×phe+try+tyr+met-his-

混合培養(yǎng)

phe+try+tyr+met+his+

基本培養(yǎng)基（10－5）

證實：a.10－5>10－12

（10－6×10－6）排除回復突變。

b.戴維斯U型管試驗(防止細胞直接接觸)也獲得野生型重組體。排除由于接合或性導

c.DNase處理重組體。排除轉化。

推測：某種過濾性因子（FA）可以穿過DavisU型管濾片?？寡蹇梢砸种浦亟M體出現(xiàn)。P22噬菌體。（2）發(fā)現(xiàn)與證實：第46頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（3）普遍性轉導：概念供體細菌染色體組的任何部分都可以組裝到轉導顆粒中，從而可以轉移到受體細菌中。（P1）第47頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五b.并發(fā)性導（co-transduction）與細菌作圖合轉導（并發(fā)轉導、共轉導）：兩個基因同時被包裝到一個轉導顆粒，從而一起重組到受體細菌的染色體上。二因子作圖：供體受體合轉導頻率

a+

b+

a-

b-30%ab近

a+

c+

a-

c-35%ac近a在bc之間

b+

c+b-

c-3%bc遠三因子作圖：供體受體合轉導頻率

leu+

thr+

azi+

leu-

thr-

azi-第48頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五實驗1：

leuazithrazileuthr實驗2：

azileuthr實驗3：最大轉導片段p227第49頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五

根據(jù)合轉導頻率推導基因之間的物理距離d－基因之間的物理距離（bp，kbp）L－轉導DNA的平均長度（bp，kbp）X－兩個基因合轉導的頻率第50頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（4）特殊性轉導（局限性轉導）attatt溫和性噬菌體進行的轉導，只能轉導部分基因。第51頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五NRJANRAJNRRAJNRAJJARNJARNdgalbio+I

噬菌體DNA特異性整合到細菌染色體。II噬菌體DNA準確環(huán)出。III噬菌體DNA不準確環(huán)出特殊性轉導噬菌體的形成。

dgal/dbio第52頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五dgal＋E.coliUV50%+50%dgal（5）高頻轉導（HFT）NRAJNRJNRAJNRA第53頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五第二節(jié)噬菌體的遺傳分析一、噬菌體是一類病毒病毒（Virus）：超顯微、無細胞、活細胞專性寄生的大分子（微生物）特點：個體?。和ㄟ^Davis濾器專性寄生：脫離活體無生命，無代謝無細胞：蛋白質＋DNA（RNA）繁殖方式簡單第54頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五2.分類：動物：球形、卵圓形寄主：植物：桿狀、絲狀細菌：蝌蚪狀

雙鏈DNA：λ，T2、4、6

單鏈DNA：ΦX類，動物病毒、噬菌體

單鏈RNA

雙鏈RNA

植物病毒、艾滋病毒遺傳物質：第55頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五煙草花葉病毒腺病毒T4噬菌體愛滋病病毒

RNADNADANRNA第56頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五二、噬菌體分類概念：原指細菌為寄主，后來推廣到真菌的病毒。烈性噬菌體：P2、P4、P6、T系列（T1-T7）

2.溫和性噬菌體：λ和P1第57頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五1.烈性噬菌體（1）形態(tài)結構（T偶列）第58頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（2）.繁殖和感染周期

（營養(yǎng)繁殖：噬菌體DNA不整合；150噬菌體/Cell）吸附細菌裂解釋放出子代噬菌體顆粒細菌染色體降解蛋白質外殼包裝DNA成子代噬菌體顆粒第59頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五2.溫和噬菌體:（1）形態(tài)結構第60頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（2）繁殖和感染周期:吸附溶菌周期UV誘導細菌裂解溶源周期噬菌體（原噬菌體）P1噬菌體第61頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五幾個相關的概念溶原性：噬菌體外殼蛋白的合成以及溶菌功能受到抑制。溶原性細菌：“攜帶”原噬菌體的細菌。原噬菌體：溶原性細菌中的噬菌體DNA分子。無外殼；無侵染能力。第62頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五λ噬菌體DNA的插入attλ第63頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五三、噬菌體遺傳的研究方法獲得突變株：處理營養(yǎng)期細菌或者游離噬菌體四類突變株：

1）寄主范圍突變株（hostrangemutant）

2）噬菌斑（plaquemutant）

3）溫度敏感性：野生型：37C、43C

均可繁殖

突變型：43ts：僅37C

繁殖

4）溶菌酶：e＋e第64頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五1）寄主范圍突變株（hostrangemutant）寄主范圍：指噬菌體感染和裂解的菌株范圍。某種噬菌體只能侵染某一種菌的個別菌系，突變后寄主范圍變寬或變窄。

T2：h+

噬菌體：只侵染E.coli

B株；

h突變株：

E.coliB&B/2第65頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五2）噬菌斑突變株（plaquemutant）噬菌斑形狀：噬菌斑的大小、邊緣清晰度、透明程度。例如：T噬菌體

rAr1r＋r（rapidlysis）

rBr13（噬菌斑小、邊緣模糊）（速溶型，噬菌斑大、邊緣清晰）rCr7m＋m小型（minute）

c＋c透明（clear）

t＋t半透明（turbid）第66頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五2、雜交試驗－雙重感染

第67頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五（1）E.ColiBE.ColiB＋B/2

二點測驗第68頁，共84頁，2022年，5月20日，23點40分，星期五基因型噬菌斑h+r+半透明、小h-r-

透明、大h+r-

半透明、大h-r+透明、小重組值＝