抗體簡介課件

第一節(jié)概述

1．抗體

能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。

2．抗體產(chǎn)生過程3．抗體--丙種球蛋白

第三章抗體制藥

1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白

白蛋白

甲種（）球蛋白乙種（）球蛋白丙種（）球蛋白

并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分中（泳動(dòng)速度最快）。

丙種球蛋白--抗體

研究發(fā)現(xiàn)病人血清中含有同抗體分子結(jié)構(gòu)類似的球蛋白，統(tǒng)稱為免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig).1）Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)上的概念（結(jié)構(gòu)與抗體相似）2）抗體是生物學(xué)上功能的概念（與抗原反應(yīng)）3）所有抗體均是Ig（抗體---球蛋白Ig）4）并非所有Ig分子都具有抗體活性（結(jié)構(gòu)與抗體相似，但未必能與抗原結(jié)合）。5．單克隆抗體

一個(gè)抗原含有多個(gè)抗原決定族

例細(xì)菌：鞭毛、細(xì)胞壁多糖等。

血清中會(huì)產(chǎn)生多種抗體---多克隆

臨床診斷試驗(yàn)必須用單價(jià)血清（否則會(huì)發(fā)生非特異交叉反應(yīng)），需要進(jìn)行多次的吸收實(shí)驗(yàn)（不要的抗體被吸收）。

1975年Kohlker和Milstein等人首次利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（monoclonalantibody，McAb）。6．抗體制藥的應(yīng)用

1890年發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素（外毒素），并建立了血清療效，開創(chuàng)了抗體制藥領(lǐng)域。

1975年單克隆抗體的問世，使抗體作為疾病的診斷和治療的應(yīng)用范圍有了很大的擴(kuò)展。

第二節(jié)單克隆抗體2.1概念單克隆抗體將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋及克隆化，使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的抗體。一個(gè)B細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體一個(gè)B細(xì)胞只能與一個(gè)雜交瘤細(xì)胞融合2.細(xì)胞系與動(dòng)物

1）免疫動(dòng)物品系和骨髓瘤細(xì)胞在種系發(fā)生上距離越遠(yuǎn)，產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定。

例小鼠（BALB/c）骨髓瘤細(xì)胞用抗原免疫動(dòng)物最好也用小鼠（BALB/c）2）免疫應(yīng)答能力

要選擇對(duì)抗原免疫應(yīng)答強(qiáng)的動(dòng)物品系。

1.雜交瘤細(xì)胞選擇融合率，自身不分泌抗體，融合細(xì)胞穩(wěn)定性好。

2.在選擇培養(yǎng)基上（HAT）進(jìn)行融合細(xì)胞的篩選

H：次黃嘌呤，A：氨基喋呤（阻斷DNA合成），T：胸腺嘧啶例：次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）：為（HGPRT）陰性（缺陷）細(xì)胞株脾細(xì)胞：為（HGPRT）陽性細(xì)胞株

脾----脾增殖生長，死亡。

脾----瘤生長

瘤----瘤不能生長

瘤

不能生長

脾

生長，死亡。設(shè)計(jì)原理2．4篩選陽性克隆與克隆化

產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞只占所有脾細(xì)胞的5%,篩選工作量很大（上清的抗體活性）。

常用的方法1．免疫酶技術(shù)：可溶性或顆粒性抗原，簡便、大批樣本。2．免疫熒光技術(shù)：顆粒性抗原（細(xì)胞）的檢測。3．放射免疫技術(shù)：可溶性或顆粒性抗原，靈敏。

例ELISA方法篩選陽性克隆克隆化

指單個(gè)細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過程。這種細(xì)胞集團(tuán)的每個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能完全相同。

融合的雜交瘤細(xì)胞，需約3次克隆化，達(dá)抗體陽性細(xì)胞克隆為100%。（經(jīng)稀釋，每個(gè)孔在理論上只含一個(gè)細(xì)胞）

克隆化方法

有限稀釋法和軟瓊脂法。

1．體外培養(yǎng)法

產(chǎn)量10g/ml,Ab

2．動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)法

產(chǎn)量5-20mg/ml,Ab

雜交瘤細(xì)胞的兩個(gè)親本均來源于BALB/c小鼠，可選用BALB/c小鼠來制備單克隆抗體。2．6單克隆抗體大量制備

不同類或亞類的抗體純化方式不同1

體外診斷試劑

IgG：沉淀+親和層析（親和力強(qiáng)）

IgM：沉淀+凝膠過濾（分子量最大Mr=90萬）2

體內(nèi)診斷試劑或治療用藥

A；去除內(nèi)毒素、病毒、核酸等的污染物。

B．親和層析和離子交換層析

2．7單克隆抗體純化

動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體的純化方法

互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）

抗體分子和抗原分子發(fā)生特異性結(jié)合的關(guān)鍵部位。

Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的是V區(qū)中三個(gè)CDR區(qū)，其它為框架區(qū)。

3．2

改形抗體保留鼠源性單克隆抗體的CDR區(qū)結(jié)構(gòu)，抗體活性保持；CDR區(qū)以外的其它部分存在與否都不會(huì)影響抗體活性。

例用鼠源性單克隆抗體的CDR序列，替換人Ig分子中的CDR區(qū)，可使人的Ig分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性。在這種抗體分子中鼠源部分只占很小的比例，可基本消除免疫原性，稱之為改形抗體或CDR移植抗體。

基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源性單克隆抗體的V區(qū)，其片段相對(duì)分子質(zhì)量僅為原抗體的1/80---1/3。

例:最小的只表達(dá)CDR區(qū),Ig分子的C區(qū)不表達(dá)。

3．3

小分子抗體

1、Fab片段抗體

完整的輕鏈（VL+CL）和重鏈（VH+CH1）

---組成小分子抗體有以下幾種

2

FV抗體

VH+VL組成，天然FV片段中VH和VL為非共價(jià)結(jié)合。3

單鏈抗體(SCFV)

VH+VL組成，但VH和VL通過一段連接肽，連接而成的重組蛋白。4

單域抗體

由VH（或VL）單個(gè)可變區(qū)組成，只有抗體分子1/12，表面疏水性強(qiáng)。一般認(rèn)為在抗原結(jié)合部位VH比VL的作用更大。5

最小識(shí)別單位（MRU）

由單個(gè)CDR區(qū)構(gòu)成的小分子抗體。仍具有與抗原結(jié)合的能力。但親和力極低。

就是雙特異性抗體。它是一種非天然性抗體，其結(jié)合抗原的兩個(gè)臂具有不同的特異性。三種構(gòu)建方法

1．化學(xué)交聯(lián)法

化學(xué)試劑隨機(jī)交聯(lián)兩個(gè)Ig分子表面上的巰基，

構(gòu)建出雙功能抗體。

優(yōu)點(diǎn)：快速、簡便、高效。

缺點(diǎn)：定位性差、穩(wěn)定性差、無連續(xù)性。

3．4

雙功能抗體

2．生物學(xué)方法

優(yōu)點(diǎn)：具有嚴(yán)格的Ig結(jié)構(gòu)和功能，有連續(xù)性。

缺點(diǎn)：構(gòu)建過程復(fù)雜、周期長、產(chǎn)率低、

純化技術(shù)復(fù)雜、不穩(wěn)定。

3．基因工程方法

把兩個(gè)抗原結(jié)合特異性不同的Fab片段，通過二硫鍵連接起來，形成一種雙功能抗體。

構(gòu)建抗體融合蛋白的原則

第一個(gè)蛋白的終止子密碼子刪除（特異性抗體），再接上帶終止子密碼子的第二個(gè)蛋白基因，即實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因共表達(dá)。

3．5

抗體融合蛋白

例生物導(dǎo)彈優(yōu)點(diǎn)：抗體融合蛋白能特異定位于腫瘤的局部，并輸送高濃度的IL-2（高出6倍），減少IL-2對(duì)周身的副作用。

鼠源性抗體的改造，就是在保持其特異性抗原結(jié)合作用的前題下，盡可能的去除不利部分（免疫原性）。第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程

4．1抗體研究領(lǐng)域的發(fā)展

分三個(gè)階段1890年Behring白喉抗毒素的發(fā)現(xiàn)

特點(diǎn)：用抗原免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體1975年Kohler創(chuàng)建雜交瘤技術(shù)

特點(diǎn)：制備出單克隆抗體1994年Winter基因工程法制備抗體

特點(diǎn)：不用免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合技術(shù)，就可制備抗體。過程：不同的VH或VL基因重組，得到無數(shù)種抗體?？贵w文庫可達(dá)到或超過1011庫容,所以能包含B細(xì)胞全部克隆。

4．2噬菌體的抗體庫構(gòu)建抗體基因插入噬菌粒中,構(gòu)成噬菌體抗體庫。噬菌粒：具有噬菌體和質(zhì)粒的共同特點(diǎn)。大容量、高效。例pHEN1特點(diǎn)：含有一個(gè)琥珀終止密碼

E.coli(SupE+)：琥珀突變終止密碼子抑制菌株

E.coli(SupE-)：非琥珀突變終止密碼子抑制菌株

1．當(dāng)噬菌粒感染E.coli(SupE+)

琥珀終止密碼（UAG）被抑制，翻譯出谷氨酸，抗體和噬菌體外殼蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體的表面。

一般噬菌粒感染E.coli(SupE+)，使抗體蛋白在噬菌體表面，有利于鑒定?？贵w基因插入噬菌粒中,構(gòu)成噬菌體抗體庫。2．當(dāng)噬菌粒感染E.coli(SupE-)

琥珀終止密碼（UAG）解抑制，翻譯為終止密碼子，外源抗體蛋白，以可溶性蛋白形式表達(dá)。

確定了目的克隆抗體后，就可再感染E.coli

(SupE-)的菌株，進(jìn)行可溶性蛋白表達(dá)，用Westernblot分析確定，完成了文庫構(gòu)建的全過程。

Westernblot1．

抗體文庫容量大，可達(dá)到或超過1011

2．

避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)3．

親和力高

4．3

噬菌體抗體文庫特點(diǎn)

1．原核細(xì)胞表達(dá)融合表達(dá)、分泌表達(dá)2．真核細(xì)胞表達(dá)分泌型表達(dá)3．轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)4．轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)

4．4基因工程抗體表達(dá)

第五節(jié)

抗體診斷試劑

概念--抗體反應(yīng)特點(diǎn)

抗原抗體特異性結(jié)合，在體內(nèi)或體外均可呈現(xiàn)某種反應(yīng)。體內(nèi)：溶菌、殺菌、促進(jìn)吞噬、中和毒素（故抗體類藥物可用于治療）。體外：根據(jù)抗原特性，可發(fā)生凝集、沉淀反應(yīng)

（故用已知抗體來鑒定抗原，用于血清學(xué)鑒定)。

5．1血清學(xué)鑒定用的抗體制劑

1、乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)的反向被動(dòng)血凝診斷制劑

主要用于病原菌和血型鑒定（凝集反應(yīng)）

2、妊辰診斷制劑

凝集反應(yīng)3、抗ABO血型系統(tǒng)血清制劑

特點(diǎn)：提高靈敏度，微量測定。

免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)。

5．2免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體制劑

1．熒光抗體診斷制劑

2．免疫酶抗體診斷制劑1）

免疫酶染色（組化法）

2）酶免疫測定（EIA）一種在液相內(nèi)微量待檢抗原物質(zhì)的定量測定方法。

3．放射免疫用抗體診斷制劑

放射免疫技術(shù)：是把放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體的特異性兩大特點(diǎn)結(jié)合起來的技術(shù)。特點(diǎn)：靈敏度高，特異性強(qiáng)，能檢測出ng/ml或pg/ml。

（酶標(biāo)g/ml）5．3導(dǎo)向診斷藥物

借助于放射性核素標(biāo)記的抗體進(jìn)行。

優(yōu)點(diǎn)：1．在體內(nèi)有確切定位腫瘤的作用，準(zhǔn)確率為90%以上。2．體內(nèi)可檢測出0.5cm大小的病灶。3．小分子抗體容易到達(dá)腫瘤部位。4．抗體在腫瘤部位，可保留6-9天。5．能觀察抗體在血中的半衰期和可能的不良反應(yīng)。第六節(jié)抗體治療藥物

放射性核素131I、212Bi

優(yōu)點(diǎn)

1）放射性核素標(biāo)記的抗體有較大的殺傷范圍

2）放射性核素標(biāo)記的抗體分子量小，容易穿透到達(dá)腫瘤部位。

缺點(diǎn)

1）有些放射性核素來源困難。

2）需放射性保護(hù)。6．1放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物

1．常用的抗癌藥物

特點(diǎn)

1）體外實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)胞毒性提高2倍。

2）抗體偶聯(lián)藥物對(duì)化療有耐藥性的菌株仍有效。

6．2抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物

1）

耐藥性的產(chǎn)生

腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物可產(chǎn)生多種耐藥性（MDR）。

MDR是由基因調(diào)控，基因編碼一種P糖蛋白。

P糖蛋白是一種跨膜蛋白，在細(xì)胞內(nèi)折疊成6對(duì)，形成通道樣結(jié)構(gòu)并在胞漿一側(cè)有2個(gè)ATP結(jié)合區(qū)。

目前認(rèn)為P糖蛋白是ATP酶依賴性的藥泵

2．抗體類藥物逆轉(zhuǎn)耐藥性

作用方式藥物進(jìn)入細(xì)胞，與P糖蛋白結(jié)合，然后在ATP酶的作用下，利用ATP水解釋放能量將藥物泵出胞外，使胞內(nèi)藥物蓄積減少，因而產(chǎn)生耐藥性。

2）耐藥性的克服1985年

首次制備出與MDR相關(guān)的單克隆抗體C219，可與P糖蛋白結(jié)合。1990年構(gòu)建人—鼠嵌合抗體，MDR鼠的單克隆可變區(qū)加人Ig的C基因的結(jié)合，其效果強(qiáng)于單克隆抗體。

逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵：

A

取決于抗體能否識(shí)別P糖蛋白膜外的表位。

B

取決于腫瘤是否有P糖蛋白的表達(dá)。

盡管抗體的逆轉(zhuǎn)作用特異性強(qiáng)，但無直接的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，必須要與抗癌藥物偶聯(lián)，才能對(duì)腫瘤細(xì)胞有毒性作用。1．免疫毒素及其換代制品

在導(dǎo)向藥物中，毒素和抗體的交聯(lián)物稱為免疫毒素。

第一代免疫毒素

A、B鏈完整毒素和抗體的交聯(lián)物。

缺點(diǎn)：B鏈為非特異性結(jié)合，僅在體外有限使用。6．3毒素偶聯(lián)的抗體藥物第二代免疫毒素

抗體或抗體片段與毒素A鏈或與A鏈作用相似的單鏈核糖體失活蛋白的結(jié)合物。