細(xì)胞免疫檢測技術(shù)

關(guān)于細(xì)胞免疫檢測技術(shù)第1頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五背景知識免疫檢測技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容課程內(nèi)容第2頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五細(xì)胞免疫Cell-mediatedimmunityisanimmuneresponsethatdoesnotinvolveantibodiesbutratherinvolvestheactivationofphagocytes,naturalkillercells(NK),antigen-specificcytotoxicT-lymphocytes,andthereleaseofvariouscytokinesinresponsetoanantigen.細(xì)胞免疫（cellularimmunity）T細(xì)胞受到抗原刺激后，增殖、分化、轉(zhuǎn)化為致敏T細(xì)胞(也叫效應(yīng)T細(xì)胞)，當(dāng)相同抗原再次進(jìn)入機(jī)體的細(xì)胞中時(shí)，致敏T細(xì)胞（效應(yīng)T細(xì)胞）對抗原的直接殺傷作用及致敏T細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子的協(xié)同殺傷作用，統(tǒng)稱為細(xì)胞免疫。第3頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五第4頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五檢測對象免疫細(xì)胞數(shù)量（E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)）T細(xì)胞亞群（間接免疫熒光法，流式細(xì)胞術(shù),免疫磁珠）細(xì)胞因子檢測技術(shù)（ELISA，定量PCR,Elispot）免疫細(xì)胞活性(淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn))第5頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五應(yīng)用范圍1、測定患病個(gè)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)與水平，以分析其發(fā)病機(jī)制；2、測定動(dòng)物疫苗免疫或抗原注射后機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)3、篩選免疫增強(qiáng)劑或免疫抑制劑藥物，或研究化學(xué)藥物、營養(yǎng)成分以及物理療法對機(jī)體免疫功能的影響4、在研制細(xì)胞因子制劑過程中，測定其活性及效價(jià)第6頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五T細(xì)胞表面受體一、T細(xì)胞抗原受體二、細(xì)胞因子受體三、綿羊紅細(xì)胞受體四、有絲分裂原受體第7頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五T細(xì)胞亞群輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4+）、抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD3+CD8+）、CD4+T細(xì)胞純真亞群（CD4+CD45RA+/CD4+CD45RA+62L+）和記憶亞群（CD4+CD45RA-/CD4+CD45RO+）、功能亞群（CD28+）、激活亞群（CD38+、HLA-DR+）、凋亡亞群（CD95+）第8頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五1.E玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)erythocyterosettetest實(shí)驗(yàn)原理：人和動(dòng)物外周血中T細(xì)胞表面有紅細(xì)胞受體（即CD2分子），在體外能直接和異種或同種動(dòng)物紅細(xì)胞（SRBC）結(jié)合形成玫瑰花樣細(xì)胞團(tuán)，以此來區(qū)分T、B。TTBSRBCCD2檢測技術(shù)第9頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五左:（甲紫染色，800×）：可見2個(gè)被綿羊紅細(xì)胞包圍而形成玫瑰環(huán)的T淋巴細(xì)胞；右:（吖啶橙染色）：圖中可見3個(gè)染成橙黃色熒光的T淋巴細(xì)胞被綿羊紅細(xì)胞所包圍。第10頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五B細(xì)胞沒有紅細(xì)胞受體，但有免疫球蛋白Fc受體和補(bǔ)體C3受體，故可用抗紅細(xì)胞抗體（A）或者補(bǔ)體（C）搭橋，形成EA玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)和EAC玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)。第11頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五2.流式細(xì)胞術(shù)定義：流式細(xì)胞術(shù)(Flow

Cytometry,

FCM)是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體,

同時(shí)具有分析和分選細(xì)胞功能。它不僅可測量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等,可對群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析,

在短時(shí)間內(nèi)檢測分析大量細(xì)胞,并收集、儲存和處理數(shù)據(jù),進(jìn)行多參數(shù)定量分析;

能夠分類收集(分選)某一亞群細(xì)胞,分選純度＞95%。在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。一種細(xì)胞分選或分析技術(shù)。即以熒光素標(biāo)記抗體結(jié)合相應(yīng)細(xì)胞，用激光束激發(fā)單行流動(dòng)的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞所攜帶熒光(強(qiáng)度或類別)進(jìn)行分選或分析。檢測技術(shù)第12頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五第13頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五將待測細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動(dòng)室，不含細(xì)胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。第14頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五流式細(xì)胞術(shù)---T細(xì)胞亞群具有CD3抗原的T細(xì)胞：外周血成熟的T細(xì)胞具有CD4抗原的T細(xì)胞：TH（機(jī)體免疫應(yīng)答的啟動(dòng)細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞免疫應(yīng)答，活化的TH細(xì)胞可釋放IL-2及IFN-r）具有CD8抗原的T細(xì)胞：Tc（在TH輔助下特異性殺傷或溶解靶細(xì)胞）第15頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五第16頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五3.間接免疫熒光法檢測淋巴細(xì)胞CD抗原免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。檢測技術(shù)第17頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五4.免疫磁珠分離法

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免疫磁珠分離法：將針對細(xì)胞某種表面標(biāo)記的特異性抗體包被在磁性微珠上，與磁珠交聯(lián)的抗體能夠特異性結(jié)合具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞，然后用強(qiáng)磁場可將具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞分離出來。磁珠(microbead)標(biāo)記細(xì)胞上的磁珠在掃描電鏡下也幾乎看不到檢測技術(shù)第18頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五磁珠分離策略：一.陽性分選磁珠標(biāo)記目的細(xì)胞未標(biāo)記細(xì)胞先行流出移出磁場后收集目的細(xì)胞CD4+T細(xì)胞分離柱CD4-T細(xì)胞第19頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五磁珠標(biāo)記非目的細(xì)胞目的細(xì)胞先行流出二.陰性分選第20頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五5.固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)ELISPOT細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果.檢測技術(shù)第21頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五與ELISA的區(qū)別

1、ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出定量的可溶性蛋白總量。

2、ELISPOT通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)活性細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白或者細(xì)胞因子的細(xì)胞的頻率

3、由于是單細(xì)胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。

4、捕獲抗體不會影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。第22頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五圖注：ELISPOT法在檢測低頻率產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞時(shí)具有獨(dú)一無二的敏感性。將指定數(shù)目的能產(chǎn)生IFN-的T細(xì)胞與一百萬個(gè)抗原呈現(xiàn)細(xì)胞（AntigenPresentingCells，APC）混合后，使用ELISPOT法（上圖）、胞質(zhì)內(nèi)染法（中圖）和ELISA法（下圖）分別測量產(chǎn)生IFN-的細(xì)胞的數(shù)目。第23頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五第24頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五

6.T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)T細(xì)胞、B細(xì)胞表面具有識別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應(yīng)淋巴細(xì)胞克隆發(fā)生增殖。檢測技術(shù)第25頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3McAb作為多克隆刺激劑可選擇性地刺激T細(xì)胞增殖；抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌體（SAC）、脂多糖（LPS，對小鼠有作用）則刺激B細(xì)胞發(fā)生增殖；美洲商陸（PWM）、腫瘤刺激劑PMA對T、B細(xì)胞的增殖均有刺激作用。第26頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法形態(tài)計(jì)數(shù)法MTT法同位素?fù)饺敕ǖ?7頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五形態(tài)計(jì)數(shù)法加分裂原共同培養(yǎng)后，觀察形態(tài)學(xué)變化，計(jì)算轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)細(xì)胞體積增大，代謝旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。第28頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五MTT法MTT法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。MTT是一種噻唑鹽，化學(xué)名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。細(xì)胞受到ConA作用后發(fā)生增殖活化，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應(yīng)升高，MTT作為其底物參與反應(yīng)，形成藍(lán)色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，經(jīng)溶劑溶解后為藍(lán)色溶液，可用酶標(biāo)測定儀測定細(xì)胞培養(yǎng)物的OD值，測定波長570nm。根據(jù)OD值的大小計(jì)算反應(yīng)體系中細(xì)胞增殖程度。

第29頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五同位素法3H-TdR摻入法：細(xì)胞增殖的基本條件或前提為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的復(fù)制，這是正常細(xì)胞增殖過程缺一不可的前提。3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前體。加入細(xì)胞培養(yǎng)液中后被細(xì)胞攝取作為DNA合成的原料。細(xì)胞合成的DNA越多，則所摻入的3H-TdR就越多，因此，檢測所摻入的3H-TdR就可反映細(xì)胞增殖的程度。因該方法有同位素污染問題，故我們實(shí)習(xí)中仍用MTT法。

第30頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五同位素法優(yōu)勢3H-TdR=增殖細(xì)胞數(shù)；MTT=總細(xì)胞數(shù)。所以前者更能反映細(xì)胞增殖指數(shù)。例，培養(yǎng)10個(gè)細(xì)胞，3天后A組為17個(gè)，B組為13個(gè)，此為MTT的結(jié)果；3H-TdR的結(jié)果則為7：3，A組細(xì)胞的增殖是B組的2.3倍。第31頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五實(shí)驗(yàn)步驟1、雞脾淋巴細(xì)胞懸液制備淋巴細(xì)胞的分離用1640培養(yǎng)液配成106細(xì)胞/ml第32頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五2、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)將脾細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，200μL/孔，每一份脾細(xì)胞懸液分裝6個(gè)孔，3孔加ConA（5ug/mL），另3個(gè)孔不加ConA作為對照。置5%CO2，37℃培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前6h，每孔加入3H-TdR20μL，使其終濃度為（3.7-18.5）×104Bq/mL。用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測量瓶中，加入7mL閃爍液，用液閃儀測定每分鐘脈沖數(shù)（cpm）。3、數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定以每分鐘脈沖數(shù)（cpm）表示增殖程度，用刺激指數(shù)（SI）來表示

實(shí)驗(yàn)孔cpm

SI=

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對照孔cpm受試樣品組的SI值顯著高于對照組的SI值，即可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。第33頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五原兒茶酸對SPF雞的免疫刺激試驗(yàn)PoultryScience,2012,91:1604–1609第34頁，共39頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)57分，星期五淋巴細(xì)胞分離液的原理外周血中各種血細(xì)胞的密度不同，其中紅細(xì)胞密度為1.093，粒細(xì)胞密度為1.092