絲狀真菌基因組DNA的提取

打開ClustalX軟件（對序列進行比對），點擊''文件〃一''載入序列〃；點擊''比對”一''輸出格式選項〃J'phylip格式〃前打勾；點擊''比對〃一''完全比對〃；比對完成后，關(guān)閉程序，并將生成的帶.phy后綴的文件拷貝至phylip軟件包的、'exe"文件夾下。打開seqboot軟件，按照路徑輸入所拷貝的、'.phy"文件，回車輸入、'r",回車一輸入1000,回車一輸入、'y",回車一輸入、5",回車一出現(xiàn)'pressentertoquit"字樣時，回車，退出程序，完成seqboot（上圖中的J選項代表評估方法,默認為bootstrap法進行評估,可更改選項;R選項默認多少次，輸入1000表示共進行1000次的republicate）。自動生成文件''outfile"，可用記事本打開。將剛剛生成的outfile文件更名為infile1，打開dnadist軟件（采用鄰位相連算法構(gòu)建進化樹，如采用其他算法，則用其他軟件），按照路徑輸入文件名infile1，回車輸入t,回車一輸入20,回車一輸入m,回車一輸入d,回車一輸入1000,回車一輸入y,回車一等待……等待……等待……時間長度視序列多寡長短及重復數(shù)多寡而不等，直到出現(xiàn)''pressentertoquit"字樣時，回車，退出程序（D選項為距離模式，默認為F84；T選項為點突變的''轉(zhuǎn)換/顛換比率〃，通常在15?30之間；M選項采用和原來一樣的重復數(shù)；輸入d,采用datasets）。自動生成文件outfile。將outfile重命名為infile2,打開neighnor軟件（采用鄰位算法），按照路徑輸入infile2,回車輸入選項m,回車一輸入1000,回車一輸入奇數(shù)5,回車一輸入y,回車一等待……一定時間后出現(xiàn)''pressentertoquit字樣時，回車，退出程序。生成兩個文件outfile和outtree。Outfile是分析結(jié)果的輸出報告，可用記事本打開，outtree可用treeview打開。8.將outfile更名為outfile1,outtree文件更名為intree1，打開consense軟件，按照路徑輸入intree1,回車9.輸入y,回車一等待......一定時間后出現(xiàn)''pressentertoquit"字樣時，回車，退出程序。生成兩個新文件outfile和outtree。Outtree就是最終結(jié)果，可用treeview軟件打開觀看絲狀真菌基因組DNA的提取（CTAB法）—取幼嫩的菌絲體，用液氮研成粉末，每0.8g裝入10mL的離心管中；一預熱1.5XCTAB到95°C,加2mL到裝有菌絲粉末的離心管中，混勻；一立即置于65C水浴30min,每分鐘，上下顛倒1次；一12000g離心5分鐘；一 吸取上清液，加等體積的氯仿，上下顛倒數(shù)次；12000 g離心 5分鐘；一 吸取上清液，加等體積的酚，上下顛倒數(shù)次；12000g 離心5 分鐘；一 吸取上清液，加等體積的氯仿，上下顛倒數(shù)次；12000 g離心 5分鐘；一取上清，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的10MNH4Ac，混勻，室溫放置10min；一12000g離心10分鐘，去上清，用75%乙醇洗沉淀，自然干燥；一加100uL的TE或無菌水。樓主，我也是做真菌轉(zhuǎn)化的，有好的東西一起分享哈O（G_G）O~中文有很多呀，微生物學報，菌物學報，微生物通報等！英文的有：Mycotaxon（0.5左右）、studiesinmycology（9.03左右）詳見如下：/sci2010/smallclass/真菌學.htmlITS區(qū)域，內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)間，是一段比較保守的區(qū)域，長度一般為700~800bp。一般PCR得到的ITS區(qū)域，測得序列在NCBI上BLAST后一般可以確定到屬一級，但是一般應輔助以形態(tài)學鑒定才較為可靠。用不用載體取決于你的實驗室得到純化后的真菌遺傳指針信息然后送交測序公司即可（但是像上海生工這樣的公司會要求你的DNA的濃度為OD260/OD280到1.8至2.0而且要你提供引物如果是經(jīng)典的比如18S等的則不要否則經(jīng)常會測不出信號如果實驗室錢多那就送到TaKaRa日本人的服務很全面而且質(zhì)量可靠但是價錢奇貴）如果你們實驗室做載體連接比較多那就連個載體再送出去測序同樣也要提供引物但這樣的話可能會便宜一點但是這樣就將測序的一部分風險轉(zhuǎn)嫁到你自己的因素上了所以這完全取決于你的選擇了祝你好運不用連接，讓測序公司電泳回收，直接把PCR產(chǎn)物送測，省時省力省錢，四天后能得到結(jié)果。這樣的帖子這幾天有三張，加上以前的就更多了，樓主發(fā)帖之前先站內(nèi)搜索一下就明白了，省力得多。不過樓主是昨天才加入的新人，以后會學會這招的。因為PCR可能有非特異性擴增，造成除了目的條帶之外還有干擾條帶產(chǎn)生，他們都是用同一對引物擴增得來的，所以在測定序列的時候會在同一個堿基的位置上出現(xiàn)兩個堿基反應同等強度，不知道正確的序列中應該是其中的哪一個，所以為了保證產(chǎn)物純度，最保險的方法就是將PCR產(chǎn)物跑電泳，回收預計大小的條帶。我以前是在有雜帶時就會回收才送測，現(xiàn)在是寫明目的條帶在哪里，直接將PCR產(chǎn)物送測，讓他們回收?；ㄙM是稍微多一點，但我的樣品有二十幾個，一個人回收要很久，公司人多，這樣我得到結(jié)果就快得多。問一下，我想構(gòu)建16srRNA基因文庫。DNA提取、PCR擴增（引物27f，1492r，產(chǎn)生片段約1500bp）純化都沒有問題，連接載體pMDT19，連接后轉(zhuǎn)化、涂布平板有單克隆出來，但做菌落PCR時最多只有200bp的結(jié)果出來，是什么原因呢？構(gòu)建另外一個目的基因克隆文庫，同樣的操作步驟，只是另外一對引物擴增出的是500bp產(chǎn)物，克隆后菌落pcr能夠成功。我們實驗室自行篩選了一株纖維素產(chǎn)生菌，經(jīng)過高靜水壓誘變后得到了一株纖維素產(chǎn)量極高的突變株（纖維素產(chǎn)量是出發(fā)株的3倍多，也是目前資料報道中最高產(chǎn)的）。我把突變株的形態(tài)學、生理生化指標和系統(tǒng)發(fā)育都做了，根據(jù)結(jié)果對菌株做了分類鑒定。應老師要求，我將材料整理出來寫成文章，沒想到投了許多期刊，都以“研究內(nèi)容不在本刊收錄范圍，建議另投他刊〃。很郁悶哪！我是第一次投SCI，沒有投稿經(jīng)驗，導師不懂微生物，更沒有投稿經(jīng)驗。在這里，求助各位高人給予指點，這類菌種描述和分類的文章該投哪些期刊？FungalDiversity/fdp/fdp.htmInternationalJournalofSystematicBacteriology分形態(tài)學鑒定和分子鑒定一般二者結(jié)合起來形態(tài)學一般都會參考一些資料，具體的圖片描述什么的分子鑒定要設(shè)計引物，進行PCR鑒定怎么純化霉菌？我從植物中篩菌，但挑去菌絲后劃線，一個平板中有3種菌落的樣子，最表面是白色鋪滿的一層，背面看，還有橘紅色和青色的塊狀物。我該怎么分離出這三種？還有一般的純化霉菌的方法是什么？（求詳解）非常感謝！無菌生理鹽水無菌沖洗平板，稀釋，取樣涂布平板形成單菌落鏡檢觀察即可！具體梯度可根據(jù)預實驗確定！真菌DNA提取的方法CTAB法提取步驟：⑴在7mL離心管中加入65°C預熱的抽提液2.5mL。⑵加入1g樣品液氮研磨，加入巰基乙醇50pL,上下震蕩，使蛋白質(zhì)變性沉淀，65C水浴1h,每隔10min顛倒混勻一次。⑶加入等體積（約3mL）的氯仿/異戊醇（24/1）混勻，除去蛋白質(zhì),4C平衡離心，lOOOOrpm,10min。（4） 取上清（約2.5mL）到7mL管，加1/5體積（約0.5mL）65C預熱的CTAB/NaCl混勻，加入2mL的氯仿/異戊醇（24/1）混勻，4C平衡離心，10000rpm,10min。（5） 取上清，加等體積（約3mL）的CTAB沉淀液，顛倒混勻。65C水浴30min至沉淀可見。4C平衡離心，10000rpm,10min后小心去上清。⑹沉淀用TE(0.5mL)溶解，加入等體積(約0.5mL)的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提，4°C平衡離心，lOOOOrpm,10min。⑺取上清加入2倍體積的無水乙醇(1mL),再加入1/10體積的NaAC(pH5.2)約0.1mL。⑻-20C冰箱1h,4C平衡離心，12000rpm,10min,棄上清，用70%酒精清洗2次，濾紙吸去多余水分，超凈臺吹干。(9)0.05mLTE溶解，-20C保存。我個人覺得SDS方法比較好，收集菌絲后加入鋼珠，加入抽提液等，在渦旋儀上振蕩，……，也能提取出不錯的DNA。CTAB、SDS法提都可以，我都提過，質(zhì)量很好加玻璃珠+酚：氯仿：異戊醇，震蕩五-十分鐘效果也不錯94C5min;94C30S，XXC30S，72C50S(660bp50S足以)(25-30cycles);72C7minMostStableCrossMostStableCrossDimeSG=-4.9[kcals-MDl]上圖是用primer5.0設(shè)計的上游引物出現(xiàn)的crossprimer的AG數(shù)值。請問這個引物能用嗎?能不能用只有試了才知道，不要迷信軟件，盡量選評分高的，數(shù)值不超過5一般還是可以的看文獻的聚類分析圖，不知道是如何作出來的?還有上面的數(shù)字是怎么標上去的?有序列，有軟件，但我就是做不出那個樣子的圖來。如《番茄葉霉菌拮抗放線菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究》這篇文章里的聚類分析圖，請問大蝦們這圖是怎么做出來的。先謝謝大家了。這個是如下：

一￡purpura曲MiQT.—S. BPS2.—S.cctnii^rtibidiliDSAf4&J43T.—Mci論翊tlMHtif1-C-A4&T.—工rtaeafiaviliATCC19910.-S.c^cniorlfSM^^一囂加諭hzjE鬧fJ腫卻.一￡如曲應郴諭￡）SMJQ^Sr—$r伽皿曲“怦肆gATCC 曲.—5.iongisporui7>Sj4JJfli66T.一匚沁邨氏站亍一-5.jn^UrriDSM4}?劉玖—&srtfwartiaii:￡>S）fJWJT-—5.助疔牠評H柑血RL2940T.—￡tnmkxicni^sDSM4Q22]T.-S,aibn^sMF^I-CJ.-眾鞠wm祈型和京￡刖Q馭—5； NRRLB-J223-iT^一S.ytu^txisDSM417^1T.taatrifspfirmDSM4S^^T.—￡ctadtys1CM492ST.—耳.thtrfittitintflfaxJl^'iVJJJj/I.■^Bncillifrsp.”圖34描抗菌BPS2的16SrDNA及其典型鏈霉菌同源基因聚數(shù)字不是標上去的大哥，數(shù)字是利用NJ法構(gòu)樹的時候自動生成的，其意義類似于置信區(qū)間這樣的一個概念，往往50%以下的部分都不要的。用幾個軟件結(jié)合起來做效果挺好的。先用DNAMAN比對修飾序列后，在用CLUSTER生成序列文件，最后在MEGA中生成系統(tǒng)樹。你所說的數(shù)字并不是自己標上去的，而是在MEGA中自舉檢驗你所做的系統(tǒng)樹的置信度后所反映的值。用MEGA軟件建樹時使用Bootstrap檢驗，可生成打分16srDNA怎么在ncbi上查詢細菌的16srDNA的全序列？/nucleotide搜索16s，再在右邊選擇bacteria本蟲做菌株鑒定方面，從形態(tài)學觀察是某種真菌，下面打算用基因方面鑒定，請問可否用真菌通用引物ITS1和ITS4的PCR擴增產(chǎn)物測序，之后BLAST比對確定該菌株種屬？我們從老鼠內(nèi)臟提取到細菌，我們要鑒定是什么細菌要做些什么過程呢？我是新人也查了些文獻，這菌是好氧的，桿菌，革蘭氏染為紅色，我們提取到的菌可能是混合菌，要進行純化（怎么純化比較好），測定16SRNA,設(shè)計引物（不知道序列怎么設(shè)計??？依據(jù)其他文獻的引物可以嗎？），謝謝各位，如果要知道的可以討論或者賜教，我剛觸及這方面的知識不是太了解，雖然自己也有看文獻，希望有經(jīng)驗的各位能給我點幫助，謝謝純化最好的方法是劃線分離，將你分離得到菌在平板上劃線，盡量劃得很開，是不是一種菌就一目了然了，你以后的操作就是挑取純培養(yǎng)的菌落提取16SrDNA之后測序，細菌有通用的16SrDNA引物，上網(wǎng)搜細菌通用引物估計就能搜到了，之后測序的結(jié)果到ncbi進行比對或構(gòu)建進化樹就好了先做形態(tài)學的觀察，再做生理生化實驗，最后測16SrDNA序列，比對數(shù)據(jù)庫。第一次發(fā)帖，好緊張自己篩了一株細菌，對其進行了誘變，拿到北京一個民營的菌種鑒定中心進行16srRNA的鑒定，結(jié)果出來后，去NCBI進行比對