發(fā)酵-糖、氮、磷檢測方法

總糖含量測定總糖:指在酸性條件下完全水解生成葡萄糖的糖的總和。1.操作程序原理:多糖經(jīng)酸水解后，生成的葡萄糖分子的醛基具有還原性,可在堿性條件下將二價銅離子還原成一價銅離子。二價銅離子在酸性條件下與碘化鉀作用析出游離碘，用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，據(jù)此可計(jì)算出溶液中二價銅離子的含量。通過檢測加入樣品后溶液中二價銅離子消耗量，可間接計(jì)算或查表得出樣品中總糖的含量。反應(yīng)式 酸性酸水解 (CHO)n+nHO=n(CHO)6105 2 6126堿性二價銅離子制備CuSO4+2NaOH=Cu(OH)2I+Na2SO4CHOHCOOKO—CHCOOKCHOHCOOK(3)CHOHCOONa+Cu(OH)=2+2HO2(3)CHOHCOONa+Cu(OH)=2+2HO2O—CHCOONaCHO/O—CHCOOK/COONaCHOHCOOK(4)葡萄糖還原反應(yīng)(CHOH)2+2C\+NaOH+H20 =(CHOH)4+CU2OI+2CHOHCOONaCHOH2O—CHCOONaCHOH2(5)碘化鉀還原溶液中剩余二價銅離子：酸性2CU2++4KI = CU2I2+4K++I2I硫代硫酸鈉滴定反應(yīng):酸性NaSO+2NaI246試劑:斐林混合液:6.0mol/l鹽酸,4.0mol/l鹽酸,0.5%淀粉指示劑,0.1mol/l硫代硫酸鈉滴定溶液。器具及儀器:0.05ml、1ml、5ml吸量管,25ml容量瓶,25ml酸式滴定管,25ml堿式滴定管,大試管H.H.S91-6電子恒溫水浴鍋，漏斗，試管。操作1.5.1.糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:準(zhǔn)確稱取0.6000g（±0.0005g）分析純葡萄糖于100ml容量瓶中，加水溶解、定容、搖勻。精密量取0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml、5.0ml上述溶液于大試管中，準(zhǔn)確加入10ml斐林混合液,100°C沸水浴10分鐘后，取出冷卻至室溫。用酸式滴定管加入6.0ml6.0mol/L鹽酸，邊加邊輕輕振蕩，使鹽酸與試管內(nèi)溶液充分接觸。用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液將顯乳白色時，加入1-2ml0.5%淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色剛好消失。以葡萄糖加入量為橫坐標(biāo)，滴定數(shù)為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出曲線圖,然后從中查出每間隔0.1ml滴定數(shù)所對應(yīng)的葡萄糖量，并繪制成表格。樣品測定：將發(fā)酵液過濾，精密量取續(xù)濾液1.00ml于25ml容量瓶中，加入4.0mol/1鹽酸5.0ml,沸水浴加熱10分鐘，取出冷卻至室溫，用純化水定容,搖勻。精密量取上述水解液2.5ml于大試管中，加入10.00ml斐林試劑，同時以10.00ml斐林試劑作空白，沸水浴加熱10分鐘，冷卻至室溫，加入6.0mol/l鹽酸6.0ml,用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液將顯乳白色時，加入1-2ml0.5%淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色剛好消失。計(jì)算：（V空白-V樣品）x5查表即可得樣品總糖含量（g/100ml）。還原糖樣品測定；將發(fā)酵液過濾，精密量取濾液0.5ml于裝有10ml斐林試劑的大試管中，沸水浴加熱10分鐘，冷卻至室溫，加入6.0mol/L鹽酸6.0ml，用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液將顯乳白色時，加入1-2ml0.5%的淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至蘭色剛好消失。同時，以10.00ml斐林試劑做空白.計(jì)算:（V空白-V樣品）查表即可得樣品還原糖含量（g/100ml注意事項(xiàng)沸水浴后要將樣品冷卻至室溫，加入鹽酸酸化時輕輕振蕩，使溶液酸化完全。滴定速度可稍快,滴定過程中不宜劇烈振蕩。淀粉指示劑不宜加入太早。（七）氨基氮含量測定1.檢測方法原理：銨離子或氨基與中性甲醛起反應(yīng)，生成酸或羧酸，用氫氧化鈉溶液滴定。試劑：18%中性甲醛溶液，0.1%甲基紅指示劑，0.5%酚酞指示劑，0.1mol/l鹽酸；0.03569mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。儀器及器具:250ml錐形瓶,5ml吸量管,25ml堿式滴定管，定量加液器,50ml量筒，漏斗,試管。操作:取發(fā)酵液過濾，精密量取濾液2.50ml至250ml錐形瓶中,加入20ml蒸餾水，搖勻，加甲基紅指示劑2-3滴,用0.1mol/l鹽酸調(diào)至紅色，放置3分鐘，用0.03569mol/L氫氧化鈉溶滴定液調(diào)至黃色。用定量加液器向錐形瓶內(nèi)加入5.0ml中性甲醛，搖勻放置5分鐘，再加入3滴酚酞指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定至微紅色即為終點(diǎn)，記錄所消耗標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的體積。計(jì)算：MXV1XmX100 0.03569XV1X14X100氨基氮含量（以氮計(jì),mg/100ml）= = ^20VV2 2.5式中：M:氫氧化鈉滴定溶液濃度， V］：滴定時消耗氫氧化鈉滴定溶液的體積,ml;V2：被測樣品的體積,ml; m：氮原子摩爾質(zhì)量,14mg/mmol。1.6.注意事項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液使用期限不得超過兩月。（八）溶磷含量的測定分光光度法：利用被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)對光的吸收，對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。1.檢測方法原理:酸性條件下，磷酸根與鉬酸銨作用生成的磷鉬酸銨經(jīng)米吐爾作用后，高價鉬被還原成低價鉬呈藍(lán)色，可根據(jù)朗伯-比爾定律于650nm處測其吸光值。反應(yīng)式：2HPO+24(NH)2MoO+21HSO—2(NH)PO?12MoO+21(NH)SO+24HO3 4 4 4 2 4 43 4 3 42 4 2米吐爾(NH)PO?12MoO (MoO?4MoO)?HPO43 4 3 2 32 3 4試劑:磷試劑I(鉬酸銨)，磷試劑11(米吐爾)，10%三氯醋酸。儀器及器具:25ml、50ml容量瓶，1ml、5ml、10ml吸量管，10ml量筒,試管,漏斗,H.H.S91-6電子恒溫水浴鍋，722型分光光度計(jì)。操作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：準(zhǔn)確稱取分析純磷酸二氫鉀0.4394g(+0.0005g)于1000ml容量瓶中,加入0.10mol/lH2SO420.0ml溶解，加水至刻度，搖勻。再吸取5.00ml于50ml容量瓶中，定容，搖勻，即得10.00ug/ml的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00ml于25ml容量瓶中，各加水至12ml,分別加入磷試劑I,II各1.0ml,沸水浴加熱30min,冷卻后，加水至刻度。用純化水作空白，使用722型分光光度計(jì)于650nm處比色。以吸光值(A)對濃度(c,ug/ml)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或線性回歸得出曲線方程。樣品測定:取發(fā)酵液過濾，精密吸取清液5ml于50ml容量瓶中，加入10%三氯醋酸10.0ml,平搖，靜置5min后，定容、搖勻、過濾，吸取5.00ml濾液于25ml容量瓶中，加磷試劑I,II各1.0ml，水7.0ml，沸水浴30min后,冷卻至室溫，用蒸餾水定容搖勻后，使用722型分光光度計(jì)于650nm處比色，由所得吸光值A(chǔ)查表或代入線性方程計(jì)算出樣品中溶磷含量。注意事項(xiàng)磷試劑I,II應(yīng)保存于棕色瓶中，使用期為兩周，如果變藍(lán)色應(yīng)不再使用。鉬藍(lán)產(chǎn)生與溫度，時間，酸度有密切關(guān)系，因此，要嚴(yán)格控制顯色條件。試劑I,II穩(wěn)定情況下，可以純化水為空白，否則，應(yīng)以試劑為空白。(八)試劑的配制和標(biāo)化：所用試劑均為分析純或相應(yīng)等級。1斐林試劑:1.1配制：稱取120g五水硫酸銅，用蒸餾水溶解加入濃硫酸5mL并稀釋至1600ml,制成A液；稱取250g氫氧化鈉和375g酒石酸鉀鈉，用蒸餾水溶解并稀釋至1600ml,制成B液；（注意:氫氧化鈉溶解時要緩緩加入）稱取300g碘化鉀，用蒸餾水溶解并稀釋至800ml,制成C液；將A和B混合后搖勻，加入C充分振蕩即可。1.2標(biāo)化：精密量取10ml新配斐林試劑至250ml錐形瓶中，加入6.0mol/l鹽酸溶液6ml,輕輕振蕩均勻后，用0.1000mol/l硫代硫酸鈉溶液滴定至溶液黃色剛好消失，加入1-2ml淀粉指示劑，用硫代硫酸鈉溶液滴定至溶液藍(lán)色剛好消失。記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液的體積，應(yīng)在8-12ml之間。6mol/1鹽酸溶液：配制:在盛有5000ml蒸餾水的10000ml試劑瓶中，緩緩加入5000ml濃鹽酸。待冷卻后,搖勻。標(biāo)化:精密量取1ml待標(biāo)液至50ml容量瓶中，定容。精密量取該稀釋液5ml于250ml錐形瓶中，加入20ml蒸餾水，滴加3滴0.5%酚酞指示劑，用0.03569mol/l氫氧化鈉溶液滴定至溶液由無色轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒓t色且30秒不消失即為終點(diǎn)。滴定體積應(yīng)在16.5-17.1ml之間。4mol/1鹽酸溶液：配制:在盛有667ml蒸餾水的1000ml試劑瓶中，緩緩加入333ml濃鹽酸。待冷卻后,搖勻。標(biāo)化:精密量取2ml待標(biāo)液至50ml容量瓶中，定容。精密量取該稀釋液5ml于250ml錐形瓶中，加入20ml蒸餾水，滴加3滴0.5%酚酞指示劑，用0.03569mol/l氫氧化鈉溶液滴定至溶液由無色轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒓t色且30秒不消失即為終點(diǎn)。滴定體積應(yīng)在21.8-23.0ml之間。2.0ml/L氫氧化鈉溶液配制:稱取80g氫氧化鈉，置于1000ml試劑瓶中，加入1000ml蒸餾水，搖勻，備用.18%中性甲醛配制：取36%的甲醛溶液，以等量蒸餾水稀釋。臨用前以0.5%酚酞為指示劑，用0.03569mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)至微紅色。標(biāo)化:用定量加液器在250ml錐形瓶中加入5ml18%中性甲醛溶液，再加入20ml蒸餾水,并滴加3滴0.5%酚酞作為指示劑，溶液應(yīng)為無色;用0.03569mol/L氫氧化鈉溶液進(jìn)行滴定，滴定數(shù)不得超過0.2。磷試劑I（鉬酸銨）配制:在500ml燒杯中加入57.5ml蒸餾水，然后向燒杯中慢慢加入85.7ml濃硫酸，邊加邊攪拌，放冷;稱取5.72g鉬酸銨置于100ml燒杯中，加入57ml蒸餾水使溶解將該溶液慢慢加入上述硫酸溶液中，攪拌均勻。冷卻后，轉(zhuǎn)移至200ml棕色試劑瓶中，放入冰箱儲備待用。標(biāo)化:每次更換新配制試劑前，參照《磷含量測定SOP》與舊試劑作對照試驗(yàn)，所選用樣品最終顯色吸光值應(yīng)在0.2-0.8之間，新舊試劑對比吸光值差異應(yīng)在0.01以內(nèi)。磷試劑11（米吐爾）配制:稱取1.70g米吐爾置于100ml燒杯中，再加入1.0g亞硫酸鈉，用50ml蒸餾水溶解；稱取44.0g亞硫酸氫鈉置于250ml燒杯中，加入150ml蒸