原位雜交技術(shù)

原位雜交實(shí)驗要求及步驟原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)（InsituHybridizationHistochemistry,ISHH）簡稱原位雜交（InSituHybridization），屬于固相分子雜交的范疇，它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。根據(jù)所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據(jù)探針的標(biāo)記物是否直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標(biāo)記的探針與靶核酸進(jìn)行雜交，雜交后分別通過放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)或成色酶促反應(yīng)直接顯示。間接法一般用半抗原標(biāo)記探針，最后通過免疫組織化學(xué)法對半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。原位雜交最初是以同位素標(biāo)記探針進(jìn)行的。盡管同位素標(biāo)記（如35S，3H，32P等）仍然廣泛使用，但非同位素標(biāo)記探針的迅速發(fā)展（尤其是生物素標(biāo)記探針和地高辛標(biāo)記探針），更引起科技工作者的極大興趣。一、基本要求組織取材：組織取材應(yīng)盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養(yǎng)細(xì)胞最好在30min內(nèi)固定。固定目的是：（1） 保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)；（2） 最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；（3） 使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。最常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細(xì)胞或組織。增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性：（1）稀酸處理和酸酐處理：為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結(jié)合，以降低背景，雜交前標(biāo)本可用0.25%乙酸酐處理10min，經(jīng)乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團(tuán)通過乙酰化而被阻斷。組織和細(xì)胞標(biāo)本亦可用0.2MHCl處理10min，稀酸能使堿性蛋白變性，結(jié)合蛋白酶消化，容易將堿性蛋白移除。

（2） 去污劑處理：去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進(jìn)入組織細(xì)胞，最常應(yīng)用的去污劑是TritonX-100。注意：過度的去污劑處理不僅影響組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且還會引起靶核酸的丟失。（3） 蛋白酶處理：蛋白酶消化能使經(jīng)固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探針對靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinaseK），還有鏈霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。雜交緩沖液孵育：雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2hr，以阻斷玻片和標(biāo)本中可能與探針產(chǎn)生非特異性結(jié)合的位點(diǎn)，達(dá)到減低背景的目的。防止污染：由于在手指皮膚及實(shí)驗室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗結(jié)果，在整個雜交前處理過程中都需要戴消毒手套，實(shí)驗所用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗前一日置高溫烘烤（180°C）以達(dá)到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時所用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。雙鏈DNA探針和靶DNA的變性：雜交反應(yīng)進(jìn)行時，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進(jìn)行雜交（包括檢測RNA時），雙鏈DNA探針在雜交前必須進(jìn)行變性。探針變性后要立即進(jìn)行雜交反應(yīng)，不然解鏈的探針又會重新復(fù)性。雜交液：雜交液內(nèi)除含一定濃度的標(biāo)記探針外，還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加，可以減低探針與組織標(biāo)本之間的靜電結(jié)合。甲酰胺可使Tm降低，雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的雜交溫度降低0.35C，0.5C和0.65C。所以，雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標(biāo)本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結(jié)合，從而減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度，以達(dá)到提高雜交率的目的（尤其對雙鏈核酸探針）。在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結(jié)構(gòu)成分之間的非特異性結(jié)合，以減低背景。探針的濃度:

探針濃度依其種類和實(shí)驗要求略有不同，一般為0.5~5.0pg/ml(0.5~5.0ng/p1)。最適宜的探針濃度要通過實(shí)驗才能確定。探針的長度：一般應(yīng)在50-300個堿基之間，最長不宜超過400個堿基。探針短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時間短。二、試劑準(zhǔn)備0.1MPBS(pH7.2):NaHPO-12HO61.6g、NaHPO-2HO5.6g、NaCl9g，TOC\o"1-5"\h\z. —、2,4 2 24 2加ddHO至2000ml，高壓滅菌。20.2MPB((pH7.2)：NaHPO-12HO61.6g、NaHPO-2HO5.6g加ddHO2 4 2 2 4 2 2至1000ml，高壓滅菌。0.1M甘氨酸：0.75g甘氨酸溶于0.1MPBS，定容至100ml，高壓滅菌。4%多聚甲醛：多聚甲醛40g加ddHO400ml，加熱至70°C左右，用1MNaOH一 一 、、一 2_. 一，倜pH至7.0，用ddHO定容至500ml，再加0.2MPBS500ml，總體積為10002ml。16XDenhardt溶液：聚乙烯毗咯酮0.4g、小牛血清白蛋白(BSA)0.4g、聚蔗糖0.4g，加ddHO至10ml，無菌抽濾、分裝，-20C保存?zhèn)溆谩?預(yù)雜交液：去離子甲酰胺10ml、50%硫酸葡聚糖4ml，于50C促溶后，再依次加入16XDenhardt液0.2ml、1MTris-HCl(pH8.0)0.2ml、5MNaCl1.2ml、0.5MEDTA(pH8.0)0.04ml、0.1M二硫蘇糖醇2ml、ddHO2.21ml，2總體積為10ml。無菌抽濾、分裝，-20C保存?zhèn)溆?。臨用前加入50mg/ml變性鮭魚精DNA75pl/ml。20XSSC:NaCl175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加水至800ml，用2NNaOH調(diào)pH至7.0，再用ddHO定容至1000ml。2抗體稀釋液：TritonX-10080pl、BSA0.2g，以0.05MPBS定容至20ml。TSM1：1MTris-HCl(pH8.0)10ml、5MNaCl2ml、1MMgCl1ml，加ddHO100ml。 22

TSM2（新鮮配制）：1MTris-HCl（pH9.5）10ml、5MNaCl2ml1MMgCl1r 一 2ml,加ddHO至100ml。,、 -2、. - ,、,、 、.-顯色液（臨用前現(xiàn)配）：5mlTSM2加顯色液原液（NBT/BCIP）150pl,并加適量左旋咪唑使其終濃度為0.24pg/ml,避光。三、操作步驟（一） 取材、冰凍切片：將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1MPBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入30%蔗糖/0.1MPBS液（4°C），1-2天后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交專用玻片上，切片厚度為15-20pm。（二） 探針制備與檢測（定量）：隨機(jī)引物制備cDNA核酸探針以DIGDNA標(biāo)記檢測試劑盒為例：（1） 探針制備：模板DNA（0.5-3pg）15pl，100C變性10min，冰浴5min。在冰浴中加：Hexanucleotidemix2pl，dNTPmix2pl，KlenowEnzyme1pl，反應(yīng)總體積為20pl。37C孵育過夜。在上述20pl的標(biāo)記產(chǎn)物中加4MLiCl2.5pl，75pl（無水乙醇預(yù)冷，輕輕混勻，-20C放置2hr。4C離心12000gX15min，棄上清。70%乙醇（預(yù)冷）50pl洗滌，7500gX5min，棄上清，晾干沉淀，加TE50pl溶解沉淀，-20C保存?zhèn)溆?。?） 探針敏感性檢測：樣品稀釋：取dig-標(biāo)記探針1pl用ddHO以1：10、1：100、1：1000、1：…、? 21000、1：10000梯度稀釋。取一張與點(diǎn)樣器大小相近的尼龍膜，標(biāo)記方向，ddHO中浸泡1min，6XSSC.、一… _-… - .一 2中浸泡10min，置點(diǎn)樣器上，負(fù)壓抽吸5min。將上述樣品點(diǎn)于尼龍膜上，繼續(xù)抽吸10min。取下尼龍膜，置紫外燈下10cm處照射5min，晾干。將膜置于適量預(yù)雜交液（5-10ml）中，37C預(yù)雜交10min。加入Anti-dig抗體（1：5000），37C雜交30min。洗膜：2XSSC/0.1%SDS室溫洗10minX2次。

顯色：15mlTSM2中加300pl顯色液(NBT/BCIP),37°C避光顯色30min。PCR法制備cDNA核酸探針：探針制備：以PCRDIGProbeSynthesisKit為例：在0.5ml離心管中，依次加入：PCR引物1(10pM)2pl；PCR引物1(10pM)2pl；質(zhì)粒DNA模板(10-100pg)2pl；PCRDIGmix2pl(含dNTP和DIG-11-dUTP)；dNTPmix2pl；10XPCRbuffer5pl；Taq酶(2u/pl)1pl；加入適量ddH0使總體積達(dá)50pl。2將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93C預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93C45s一58C45s一72C60s，循環(huán)30-35次，最后在72C保溫7min。在上述PCR產(chǎn)物中加入4MLiCl12.5pl、預(yù)冷無水乙醇375pl，輕輕混合后置于-20C2h，12000gX15min，棄上清。70%乙醇(預(yù)冷)120pl洗滌沉淀，離心7500gX5min，棄上清，晾干沉淀，加TE50pl溶解，-20C保存?zhèn)溆?。探針檢測：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察DIG-DNA探針含量(采用目測法)。原位雜交反應(yīng)(以DIG-cDNA探針為例)：0.1MPBS(pH7.2)浸5-10min。0.1M甘氨酸/0.1MPBS浸5min。0.3%TritonX-100/0.1MPBS浸10-15min。0.1MPBS洗5minX3次，加蛋白酶K(1pg/ml)，37C孵育30min。4%多聚甲醛浸5min。

0.1MPBS洗5minX2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。預(yù)雜交：滴加適量預(yù)雜交液，42°C30min。雜交：傾去預(yù)雜交液，在每張切片上滴加10-20pl雜交液(將探針變性后稀釋在預(yù)雜交液中，0.5ng/pl)，覆以蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?2C過夜。洗片：4XSSC、2XSSC、1XSSC、0.5XSSC37C各洗20min；0.2XSSC37C洗10min；0.2XSSC與0.1MPBS各半洗10min；0.05MPBS洗5minX2次。3%BSA/0.05MPBS包被，37C3