大鼠尿微量白蛋白(ALB)說(shuō)明書(shū)

大鼠尿微量白蛋白（酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書(shū)本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測(cè)定大鼠血清，細(xì)胞上清及相關(guān)液體樣本中尿微量白蛋白（的含量。實(shí)驗(yàn)原理：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠尿微量白蛋白（ALB）水平。用純化的大鼠尿微量白蛋白（ALB）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入尿微量白蛋白（ALB），再與HRP標(biāo)記的尿微量白蛋白（ALB）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的尿微量白蛋白（ALB）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠尿微量白蛋白（ALB）濃度。試劑盒組成：試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說(shuō)明書(shū)1份1份封板膜2片（48）2片(96)密封袋1個(gè)1個(gè)酶標(biāo)包被板1X481X962-8℃保存標(biāo)準(zhǔn)品：270^g/ml0.5mlX1瓶0.5mlX1瓶2-8℃保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5mlX1瓶1.5mlX1瓶2-8℃保存酶標(biāo)試劑3mlX1瓶6mlX1瓶2-8℃保存樣品稀釋液3mlX1瓶6mlX1瓶2-8℃保存顯色劑A液3mlX1瓶6mlX1瓶2-8℃保存顯色劑B液3mlX1瓶6mlX1瓶2-8℃保存終止液3mlX1瓶6mlX1瓶2-8℃保存濃縮洗滌液(20mlX20倍)X1瓶(20mlX30倍)X1瓶2-8℃保存樣本處理及要求：血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.不能檢測(cè)含的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟：標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品1001，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液501，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取1001分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液501，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取501棄掉，再各取501分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50u1，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取501分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液501，混勻后從第七、第八孔中分別取501加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液501，混勻后從第九第十孔中各取501棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為501，濃度分別為180g/m1，120g/m1，60g/m1，30g/m1，15g/m1）。加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液401，然后再加待測(cè)樣品101（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑501，空白孔除外。溫育：操作同3。洗滌：操作同5。顯色：每孔先加入顯色劑A501，再加入顯色劑B501，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.終止：每孔加終止液501，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。注意事項(xiàng)：試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好

控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（XX）。封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。底物請(qǐng)避光保存。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。本試劑不同批號(hào)組分不得混用。如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。試劑盒性能：.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。.批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于9%和11%檢測(cè)范圍：5g/ml-200g/ml保存條件及有效期：.試劑盒保存：；2-8℃。.有效期：6個(gè)月FORRESEARCHUSEONLYRatALBDrugNamesGenericName.RatALBELISAKit.PurposeThiskitallowsforthedeterminationofALBconcentrationsinRatserum,cellculturesupernatantandotherbiologicalfluids.PrincipleoftheassayThekitassayRatALBlevelinthesample-usePurifiedRatALBantibodytocoatmicrotiterplatewells,makesolid-phaseantibody,thenaddALBtowells,CombinedALBantibodywhichWithHRPlabeled,becomeantibody-antigen-enzyme-antibodycomplex,afterwashingCompletely,AddTMBsubstratesolution,TMBsubstratebecomesbluecolorAtHRPenzyme-catalyzed,reactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyatawavelengthof450nm.TheconcentrationofALBinthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothestandardcurve.MaterialsprovidedwiththekitMaterialsprovidedwiththekit48determinations96determinationsStorageUsermanual11Closureplatemembrane22Sealedbags11Microelisastripplate112-8℃Standard：270^g/mi0.5mlx1bottle0.5mlx1bottle2-8℃Standarddiluent1.5mlx1bottle1.5mlx1bottle2-8℃HRP-Conjugatereagent3mlx1bottle6mlx1bottle2-8℃Samplediluent3mlx1bottle6mlx1bottle2-8℃ChromogenSolutionA3mlx1bottle6mlx1bottle2-8℃ChromogenSolutionB3mlx1bottle6mlx1bottle2-8℃StopSolution3mlx1bottle6mlx1bottle2-8℃washsolution(20mlX20fold)x1bottle(20mlX30fold)X1bottle2-8℃Specimenrequirementsserum-coagulationatroomtemperature10-20mins，centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.plasma-usesuitedEDTAorcitrateplasmaasananticoagulant,mix10-20mins,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.Urine-collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.TheOperationofHydrothoraxandcerebrospinalfluidReferencetoit.cellculturesupernatant-detectsecretorycomponents,collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,detectthecompositionofcells,DilutcellsuspensionwithPBS(PH7.2-7.4),Cellconcentrationreached1million/ml,repeatedfreeze-thawcycles,damagecellsandreleaseofintracellularcomponents,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.Tissuesamples-Aftercuttingsamples,checktheweight,addPBS(PH7.2-7.4),Rapidlyfrozenwithliquidnitrogen,maintainsamplesat2-8℃aftermelting,addPBS(PH7.4),HomogenizedbyhandorGrinders,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant.extractassoonaspossibleafterSpecimencollection,andaccordingtotherelevantliterature,andshouldbeexperimentassoonaspossibleaftertheextraction.Ifitcan’t,specimencanbekeptin-20■topreserve,Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.Can’tdetectthesamplewhichcontaNinaN3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.Assayprocedure.DiluteandaddsampletoStandard:set10StandardwellsontheELISAplatescoated,addStandard100ltothefirstandthesecondwell,thenaddStandarddilutionsltothefirstandthesecondwell,mixtakeout100lformthefirstandthesecondwellthenaddittothethirdandtheforthwellseparately.thenaddStandarddilution50tothethirdandtheforthwell,mixthentakeout50lfromthethirdandtheforthwelldiscard,add50ltothefifthandthesixthwell,thenaddStandarddilution50ltothefifthandthesixthwell,mixtakeout50lfromthefifthandthesixthwellandaddtotheseventhandtheeighthwell,thenaddStandarddilution50ltotheseventhandtheeighthwell,mixtakeout50lfromtheseventhandtheeighthwellandaddtotheninthandthetenthwell,addStandarddilution50ltotheninthandthetenthwell,mix,takeout501fmtheninthandthetenthwelldiscard(addSample50ltoeachwellafterDiluting)(density:180g/mi,120g/mi,60g/mi,30g/mi,15g/mi).addsample：Setblankwellsseparately(blankcomparisonwellsdon’atddsampleandHRP-Conjugatereagent,othereachstepoperationissame).testingsamplewell.addSampledilution40totestingsamplewell,thenaddtestingsample10(samplefinaldilutionis5-fold),addsampletowells,don’ttouchthewellwallasfaraspossleib,andGentlymix..Incubate:AfterclosingplatewithClosureplatemembrane,incubatefor30minat37℃.4.Configurateliquid:30-fold(or20-fold)washsolutiondiluted30-fold(or20-fold)withdistilledwaterandreserve..washing：UncoverClosureplatemembrane,discardLiquid,drybyswing,addwashingbuffertoeverywell,stillfor30sthendrain,repeat5times,drybypat..addenzyme：AddHRP-Conjugatereagent50ltoeachwell,exceptblankwell.7.incubate：Operationwith3.8.washing：Operationwith5.9.color：AddChromogenSolutionA50ulandChromogenSolutionBtoeachwell,evadethelightpreservationfor15minat37℃10.Stopthereaction:AddStopSolution50toeachwell,Stopthereaction(thebluecolorchangetoyellowcolor).11.assay:takeblankwellaszero,Readabsorbanceat450nmafterAddingStopSolutionandwithin15min.ImportantnotesThekittakesoutfromtherefrigerationenvironmentshouldbebalanced15-30minutesintheroomtemperature,ELISAplatescoatedifhasnotuseupafteropened,theplateshouldbestoredinSealedbag.washingbufferwillCrystallizationseparation,itcanbeheatedthewaterhelpsdissolvewhendilute.Washingdoesnotaffecttheresult.addSamplewithsamplerEachstep,Andproofreaditsaccuracyfrequently,avoidstheexperimentalerror.addsamplewithin5mins,ifthenumberofsampleismuch,recommendtouseVolley.ifthetestingmaterialcontentisexcessivelyhigher(ThesampleODisbiggerthanthefirststandardwell),pleasediluteSample(n-fold),Pleasediluenteandmultipliedbythedilutionfac