分子生物學(xué)-DNA復(fù)制與修復(fù)

第五章DNA復(fù)制與修復(fù)

DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型后，1958年，Crick提出了“中心法則”(Centraldogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。中心法則總結(jié)了生物體內(nèi)遺傳信息的流動(dòng)規(guī)律，揭示遺傳的分子基礎(chǔ)，不僅使人們對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認(rèn)識(shí)，而且以這方面的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展了基因工程，給人類(lèi)的生產(chǎn)和生活帶來(lái)了深刻的革命。遺傳信息傳遞的中心法則

生物的遺傳信息以密碼的形式儲(chǔ)存在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。在細(xì)胞分裂的過(guò)程中，通過(guò)DNA復(fù)制把親代細(xì)胞所含的遺傳信息忠實(shí)地傳遞給兩個(gè)子代細(xì)胞。在子代細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，這些遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，再由RNA通過(guò)翻譯轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的蛋白質(zhì)多肽鏈上的氨基酸排列順序，由蛋白質(zhì)執(zhí)行各種各樣的生物學(xué)功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳特征。后來(lái)人們又發(fā)現(xiàn)，在宿主細(xì)胞中一些RNA病毒能以自己的RNA為模板復(fù)制出新的病毒RNA，還有一些RNA病毒能以其RNA為模板合成DNA，稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄這是中心法則的補(bǔ)充。蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNADNA的半保留復(fù)制第一節(jié)一、復(fù)制的規(guī)律半保留復(fù)制復(fù)制起始點(diǎn)/復(fù)制終止點(diǎn)/復(fù)制子/復(fù)制叉復(fù)制方向：?jiǎn)蜗驈?fù)制、雙向復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制模式：眼型復(fù)制、θ型復(fù)制、σ型復(fù)制、D型復(fù)制DNA半保留復(fù)制的概念

DNA在復(fù)制時(shí)，兩條鏈解開(kāi)分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補(bǔ)的原則合成兩條與模板鏈互補(bǔ)的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來(lái)自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種復(fù)制方式稱(chēng)為半保留復(fù)制。以3‘→5’方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)?‘→3’，這一條鏈被稱(chēng)為前導(dǎo)鏈(leadingstrand)。而以5‘→3’方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)其鏈的聚合方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相反，這條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)合成的，稱(chēng)為隨后鏈(laggingstrand)。半不連續(xù)復(fù)制：岡崎片段：

由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開(kāi)的，因此，隨后鏈的合成也是一段一段的。

DNA在復(fù)制時(shí)，由隨后鏈先形成的一些短DNA片段稱(chēng)為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase):兼具內(nèi)切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。

(3）DNA解鏈酶(DNAhelicase)（4）單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：結(jié)合在解開(kāi)的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。(5）引物酶(peimase)和引發(fā)體(primosome)：?jiǎn)?dòng)RNA引物鏈的合成。

(6）DNA連接酶（DNAligase）二、原核生物DNA復(fù)制有關(guān)的酶類(lèi)解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物DNA聚合酶Ⅱ分子量每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比較項(xiàng)目DNA聚合酶Ⅲ切除引物修復(fù)修復(fù)復(fù)制功能

1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶和，它們涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)（erroounerepair）DNA聚合酶的功能：5’->3’聚合酶活性與延伸能力3’->5’外切酶活性與校對(duì)功能（保真性）5’->3’外切酶活性與切口平移切口平移法(nicktranslation)

：當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí),E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3‘羥基末端。同時(shí)該酶具有從5‘→3’的核酸外切酶活性,能從切口的5‘端除去核苷酸。切口平移的意義：切除RNA引物，并利用聚合酶活性填補(bǔ)缺口DNA修復(fù)中發(fā)揮重要作用DNA探針標(biāo)記拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ可使DNA雙鏈中的一條鏈切斷，松開(kāi)雙螺旋后再將DNA鏈連接起來(lái)，從而避免出現(xiàn)鏈的纏繞。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ可切斷DNA雙鏈，使DNA的超螺旋松解后，再將其連接起來(lái)。大腸桿菌拓樸異構(gòu)酶Ⅰ的結(jié)構(gòu)DNA解鏈酶解鏈酶或rep蛋白，是用于解開(kāi)DNA雙鏈的酶蛋白，每解開(kāi)一對(duì)堿基，需消耗兩分子ATP。目前發(fā)現(xiàn)存在至少存在兩種解鏈酶。單鏈DNA結(jié)合蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱(chēng)螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。這是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。其作用為：①使解開(kāi)雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復(fù)制子代DNA；②保護(hù)單鏈DNA，避免核酸酶的降解。

DNA連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈復(fù)制的起始：由下列兩步構(gòu)成（一）預(yù)引發(fā)

1．解旋解鏈，形成復(fù)制叉由蛋白因子（如dnaB等）識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)，拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。三、DNA生物合成過(guò)程2．引發(fā)體組裝其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。（二）引發(fā)在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

復(fù)制的延長(zhǎng)

階段（一）聚合子代DNA由DNA聚合酶催化，以3'→5'方向的親代DNA鏈為模板，從5'→3'方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中，參與DNA復(fù)制延長(zhǎng)的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延長(zhǎng)隨從鏈)和δ（延長(zhǎng)領(lǐng)頭鏈）復(fù)制的終止

階段（一）去除引物，填補(bǔ)缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ水解去除RNA引物，并由該酶催化延長(zhǎng)引物缺口處的DNA，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一種特殊的核酸酶來(lái)水解，而岡崎片段仍由DNA聚合酶來(lái)延長(zhǎng)。（二）連接岡崎片段：在DNA連接酶的催化下，形成最后一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來(lái)，形成完整的DNA長(zhǎng)鏈。

復(fù)制的忠實(shí)性

DNA復(fù)制過(guò)程是一個(gè)高度精確的過(guò)程，據(jù)估計(jì)，大腸桿菌DNA復(fù)制5109堿基對(duì)僅出現(xiàn)一個(gè)誤差，保證復(fù)制忠實(shí)性的原因主要有以下三點(diǎn):DNA聚合酶的高度專(zhuān)一性（嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則，但錯(cuò)配率為710-6

）DNA聚合酶的校對(duì)功能（錯(cuò)配堿基被3’-5’外切酶切除）起始時(shí)以RNA為引物DNA復(fù)制為什么要合成一個(gè)RNA引物，而后又把這個(gè)引物消除呢？這是保證DNA聚合過(guò)程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校對(duì)復(fù)制過(guò)程中的核苷酸，也就是說(shuō)聚合酶在開(kāi)始形成一個(gè)新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個(gè)堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開(kāi)始合成。因此先合成一條低忠實(shí)性的多核苷酸來(lái)開(kāi)始DNA的合成，并以核糖核苷酸來(lái)表示是“暫時(shí)”的，當(dāng)DNA開(kāi)始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠實(shí)性的脫氧核苷酸取而代之，確保復(fù)制的忠實(shí)性。起始時(shí)以RNA作為引物的作用

DNA聚合酶分子量亞基數(shù)細(xì)胞內(nèi)分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶110-23，000多個(gè)細(xì)胞核～80%無(wú)120，000一個(gè)細(xì)胞核和線(xiàn)粒體2～15%無(wú)-400，000一個(gè)細(xì)胞核+10～25%5-3外切酶DNA聚合酶DNA聚合酶45，000一個(gè)細(xì)胞核10～15%無(wú)真核生物的DNA聚合酶端粒DNA的復(fù)制第二節(jié)一、真核生物端粒的結(jié)構(gòu)端粒（telomere）是指真核生物染色體線(xiàn)性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富含G、C的短重復(fù)序列構(gòu)成，可重復(fù)數(shù)十次至數(shù)百次。人類(lèi)端粒由5′TTAGGG3′的重復(fù)單位構(gòu)成，長(zhǎng)度在5～15kb范圍。端粒和端粒結(jié)合蛋白組成核蛋白復(fù)合物。

端粒結(jié)合蛋白有兩種：一種與單鏈富含G的端粒DNA結(jié)合；另一種與雙鏈的端粒DNA結(jié)合。前者在端粒末端提供帽狀結(jié)構(gòu)以穩(wěn)定端粒；后者可能直接參與端粒長(zhǎng)度平衡的維持，是端粒延伸的負(fù)調(diào)節(jié)因子。二、端粒的功能保護(hù)染色體末端：免于被修飾、降解和端粒酶的無(wú)限延伸防止染色體復(fù)制時(shí)末端丟失或形成不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)決定細(xì)胞的壽命、起“生命的時(shí)鐘”作用固定染色體位置：與核膜或核基質(zhì)結(jié)合三、端粒的長(zhǎng)度及末端復(fù)制問(wèn)題端粒的長(zhǎng)度在不同的細(xì)胞之間存在著差異胚胎細(xì)胞和生殖細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度大于體細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度隨著細(xì)胞逐代相傳而縮短，每復(fù)制一代即有50～200nt的DNA丟失端粒丟失到一定程度即失去對(duì)染色體的保護(hù)作用，細(xì)胞隨之發(fā)生衰老和死亡人體細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度不一，存在著個(gè)體差異隨著年齡的增長(zhǎng)，端粒每年減少約15～40nt，最終細(xì)胞衰老。胚胎細(xì)胞和生殖細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度不隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而縮短，具有無(wú)限分裂的能力四、端粒酶問(wèn)題：生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞具有無(wú)限增值能力，端粒是如何維持其長(zhǎng)度的？體細(xì)胞為何會(huì)衰老死亡？端粒酶（telomerase）端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它以其自身RNA為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程對(duì)末端DNA鏈進(jìn)行延長(zhǎng)。

5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶結(jié)構(gòu)端粒酶RNA人類(lèi)端粒酶RNA(hTR)在長(zhǎng)約450個(gè)堿基的序列中，有一段長(zhǎng)11個(gè)核苷酸的區(qū)域(5′-CUAACCCUAAC-3′)，與人端粒序列(TTAGGG)n互補(bǔ)端粒酶蛋白人類(lèi)端粒酶蛋白有兩種：TP1和TP2。其中TP1能與端粒酶RNA特異性結(jié)合；TP2和逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)相似，是端粒酶的催化亞單位，在腫瘤細(xì)胞端粒酶的激活中起關(guān)鍵作用。端粒合成的一種模型3′5′TTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3′5′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3′5′AATTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和雜交移位和再雜交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5′3′nAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTCCCCTnAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn進(jìn)一步加工繼續(xù)延伸DNA突變第四節(jié)

一、突變的概念指基因結(jié)構(gòu)的任何改變不能恢復(fù)到損傷前的狀態(tài)，形成了可以通過(guò)遺傳的永久性改變，致使基因作用改變、表達(dá)產(chǎn)物改變、個(gè)體表型改變。二、突變的方式

分為：自發(fā)突變、誘發(fā)突變?cè)谧匀粭l件下發(fā)生的突變叫自發(fā)突變由人工利用物理因素或化學(xué)藥劑誘發(fā)的突變叫誘發(fā)突變。誘變劑的種類(lèi)：堿基類(lèi)似物(baseanalog)堿基修飾劑(basemodifier)嵌入染料(intercalationdye)

紫外線(xiàn)(ultraviolet)和電離輻射(ionizingradiation)

三、突變的類(lèi)型根據(jù)基因結(jié)構(gòu)的改變方式：可分為點(diǎn)突變和移碼突變兩種類(lèi)型。

根據(jù)遺傳信息的改變：可以分為同義突變、錯(cuò)義突變和無(wú)義突變?nèi)N類(lèi)型。突變型基因轉(zhuǎn)變成野生型基因的過(guò)程叫回復(fù)突變。某一突變基因的表型