在Lager酵母發(fā)酵產(chǎn)生二氧化硫過(guò)程中線粒體可能扮演的角色

在Lager酵母發(fā)酵產(chǎn)生二氧化硫過(guò)程中線粒體可能扮演的角色付臣譯自ASBCJ-2012-0828-01摘要：二氧化硫是釀造家尋求控制的Lager酵母主要的代謝產(chǎn)物之一，因?yàn)樗鼘?duì)Lager啤酒的質(zhì)量有多重復(fù)雜的影響。酵母細(xì)胞當(dāng)在高葡萄糖麥汁中發(fā)酵時(shí)，易受影響而產(chǎn)生較高的二氧化硫已經(jīng)被廣泛報(bào)道，但是確切的機(jī)理仍然沒(méi)有得到充分的了解，已知當(dāng)酵母細(xì)胞利用葡萄糖作為初始碳源作為生長(zhǎng)物質(zhì)時(shí)，這會(huì)對(duì)線粒體進(jìn)化產(chǎn)生負(fù)面影響，特別是在它的僅有的膜脂，雙磷脂酰甘油中。在本研究中，我們給出了一個(gè)用雙磷脂酰甘油合成促進(jìn)劑L-甲狀腺氨酸和甘油）和抑制劑（肌糖），來(lái)針對(duì)改變雙磷脂酰甘油的形成和線粒體進(jìn)化的培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，這些結(jié)果證實(shí)在促進(jìn)雙磷脂酰甘油形成的條件下以適應(yīng)乙醇產(chǎn)生，有明顯低的亞硫酸鹽含量（P<0.05），另外，用呼吸缺陷型突變菌株發(fā)酵與其親代菌株對(duì)比，通過(guò)測(cè)量亞硫酸鹽產(chǎn)量與攝入的硫酸鹽數(shù)量之比，也顯示出呼吸缺陷型突變菌株有明顯低的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率（P<0.05）。這些發(fā)現(xiàn)暗示，這種被忽略的細(xì)胞器對(duì)亞硫酸鹽產(chǎn)生可能有至關(guān)重要的作用，我們推測(cè)它與一個(gè)關(guān)鍵的酶復(fù)合體輔基，亞硫酸鹽還原酶有關(guān)。這個(gè)輔基，也就是[4Fe-4S]鐵硫簇，提供了亞硫酸鹽還原酶電子的催化部位，以減少二氧化硫變成其它硫化物。假設(shè)線粒體ATP水平的限制，影響了[4Fe-4S]的簇狀構(gòu)造或者由于胞液脫輔基蛋白的變化影響了簇的輸出。關(guān)鍵詞：雙磷脂酰甘油，鐵硫簇，線粒體，亞硫酸鹽還原酶，SO2導(dǎo)言二氧化硫（SO2）是酵母在發(fā)酵期間形成的一種重要的代謝物，它影響啤酒質(zhì)量的許多特性，它作為啤酒中一種抗氧化劑的角色已經(jīng)被證實(shí)，但是它在啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性方面的角色是引起爭(zhēng)議的，因?yàn)橐呀?jīng)證明在發(fā)酵期間二氧化硫?qū)㈡I合風(fēng)味活性羰基形成風(fēng)味中性的a-羥基磺酸鹽，Dufour先生暗示這些化合物在發(fā)酵期間不能被酵母還原，但在包裝的成品酒中會(huì)被釋放，如此導(dǎo)致早期的風(fēng)味敗壞。二氧化硫也提供了一個(gè)膠體穩(wěn)定性的角色，而且眾所周知在葡萄酒發(fā)酵中作為一個(gè)抗氧化劑的作用。但是，過(guò)了一個(gè)世紀(jì)后，知道通過(guò)人類挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)，二氧化硫的攝入能導(dǎo)致咽喉刺激、胃與腸刺激及嘔吐、頭痛、低色指數(shù)性貧血和其它方面的影響，因此許多國(guó)家的監(jiān)管機(jī)構(gòu)都制定了一個(gè)包裝產(chǎn)品中的SO2法定限量。再者，已經(jīng)報(bào)道二氧化硫與異味有關(guān)，因此懂得在釀造過(guò)程中二氧化硫形成的控制對(duì)釀造者來(lái)說(shuō)是很重要的。在發(fā)酵麥汁中二氧化硫的形成已經(jīng)被很好的描述過(guò)了。在硫的生物合成期間，包括氨基酸蛋氨酸和半胱氨酸，硫酸鹽被主動(dòng)運(yùn)輸穿過(guò)質(zhì)膜，硫酸鹽通過(guò)NADPH直接還原成亞硫酸鹽是不可能發(fā)生的，因?yàn)檫@個(gè)反應(yīng)要吸收很高的能量（△G°/=+45.2kJ/mol），但是這個(gè)反應(yīng)能夠通過(guò)ATP硫酸化酶，通過(guò)硫酸鹽的腺嘌呤基化，使它的電位降低而完成。圖1中給出了相應(yīng)的步驟，圖示說(shuō)明了酸性亞硫酸鹽（HSO3-）如何形成，哪一個(gè)是還原h(huán)so3-為硫化物的亞硫酸鹽還原酶（SiR）的底物。盡管酵母對(duì)細(xì)胞內(nèi)HSO3-的累積有一個(gè)基本的耐受性，但它可能是細(xì)胞毒素，因此通過(guò)SSU家族基因調(diào)節(jié)的防護(hù)機(jī)制存在以便向細(xì)胞外泵出有毒中間物。減少SIR活性將會(huì)使發(fā)酵麥汁中SO2含量提高已經(jīng)被提出，目標(biāo)對(duì)準(zhǔn)MET

基因，尤其是MET1、MET5、MET8和MET10基因的基因控制研究已經(jīng)證明對(duì)亞硫酸鹽產(chǎn)生有明顯的影響。釀酒酵母的SIR是一個(gè)604KDa的蛋白質(zhì)，它有一個(gè)a2P2構(gòu)造，也包含參與HSO3-還原的輔基，這些基團(tuán)的其中兩個(gè)與基于細(xì)菌亞硫酸鹽還原酶同化力的此反應(yīng)密切相關(guān)。siroheme（可能叫白亞鐵血紅素）分子（圖2A），一個(gè)包含四氫卟琳的鐵，和一個(gè)由一個(gè)［4Fe-4S］五環(huán)辛烷組成的硫簇鐵（ISC）（圖2B）合作，把推挽式的6個(gè)電子轉(zhuǎn)移到SIR催化部位的酸性亞硫酸鹽鍵上，這個(gè)所推薦的HSO3-完全還原是由Crane等人的研究提供的（圖3）,對(duì)于解釋一旦hso3-鍵合到催化部位上便沒(méi)有中間體被釋放出來(lái)是很重要的。因此，siroheme（可能叫白亞鐵血紅素）或ISC的效能和結(jié)構(gòu)的任何改變都能導(dǎo)致SIR活性的降低，似乎是合理的。SulphateTrutispifrienCellWall\LASTATPADPSulphateTrutispifrienCellWall\LASTATPADPPAPSN.ADPH.I'rjt(njd1PAFSReductasePAP+NADP+Snip/irtePumpHSRPAPSN.ADPH.I'rjt(njd1PAFSReductasePAP+NADP+Snip/irtePumpHSR；-SulphiteReductase6EI..OTowardcysandmetbiosynthesis,^<***圖1.釀造酵母在硫酸鹽同化途徑過(guò)程中，亞硫酸鹽的形成和排出。圖2.亞硫酸鹽還原酶復(fù)合體的輔基siroheme（可能叫白亞鐵血紅素）（a）和［4Fe-4S］硫簇鐵（b）。研究者已經(jīng)證明的一個(gè)現(xiàn)象是高葡萄糖含量麥汁的影響導(dǎo)致了亞硫酸鹽生成的增加，Gyllang等人建議，較高的亞硫酸鹽量是在糖酵解和酒精發(fā)酵期間，生成的乙醛和丙酮酸鹽在細(xì)胞內(nèi)積累的結(jié)果，兩者都與亞硫酸鹽鍵合，這就阻止了SIR酶使其減少。從另一個(gè)角度看，通過(guò)后來(lái)O'Conner-Cox先生及同事對(duì)于釀造過(guò)程中酵母線粒體角色的開(kāi)創(chuàng)性研究，知道了當(dāng)酵母利用葡萄糖作為碳源時(shí)，酵母線粒體的發(fā)育被束縛，線粒體是包含兩個(gè)膜的細(xì)胞器，內(nèi)膜和外膜，兩者都含有獨(dú)特的被稱作雙磷脂酰甘油（1,3-二［1',2'-二酰-3'磷酰基-sn-甘油］-sn-甘油;CL）的脂類（圖4）。雙磷脂酰甘油的生物合成與三個(gè)相繼的反應(yīng)有關(guān)（圖5），磷脂酰甘油磷酸（PGP）合成酶催化了通過(guò)核苷酸胞腚-5'-三磷酸-1,2-二脂酰甘油（CDP-DG）和甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化形成CL的關(guān)鍵步驟，通過(guò)PGP磷酸酯酶作用，PGP去磷酸作用形成磷脂酰甘油是中間步驟，最后的步驟與CL合成酶有關(guān)，在這個(gè)地方發(fā)生了磷脂酰基從CDP-DG轉(zhuǎn)移到PG上。一些最新的證據(jù)表明，葡萄糖抑制了雙磷脂酰甘油的形成，其它的研究也已經(jīng)證實(shí)肌糖抑制了PGP合成酶的活性，這對(duì)于雙磷脂酰甘油的形成是一個(gè)關(guān)鍵步驟。許多研究也顯示甘油可能通過(guò)增強(qiáng)CRD1（結(jié)構(gòu)基因編碼CL合成酶）的表達(dá)而提高了線粒體的發(fā)育，并且甲狀腺氨酸（甲狀線素）已經(jīng)顯示出在老鼠心臟線粒體中對(duì)這些酶的活性起促進(jìn)作用。CL和許多鍵合蛋白質(zhì)的線粒體膜相互作用，它與呼吸鏈酶復(fù)合儂、III,IV和V（ATP合成酶）及腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（AdN轉(zhuǎn)移酶）相關(guān)聯(lián)，它也在蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體過(guò)程中起了到關(guān)重要的作用。再者，CL的缺乏會(huì)導(dǎo)致線粒體DNA的不穩(wěn)定、活力減小及在高溫下能起作用的呼吸細(xì)胞減少。在最近的研究中，研究的焦點(diǎn)是用改變酵母中CL的含量，產(chǎn)生呼吸缺陷型

酵母細(xì)胞，評(píng)價(jià)對(duì)發(fā)酵的影響來(lái)確定線粒體與亞硫酸鹽產(chǎn)生的相關(guān)性，測(cè)定到線粒體起了一個(gè)作用，機(jī)制與前面提到的一個(gè)關(guān)鍵的SIR輔基有關(guān)。尺口匚皿T11rti圖3.Crane等人推薦的酸性亞硫酸鹽還原成硫化物的反應(yīng)。電子通過(guò)［4Fe-4S］簇被傳遞，siroheme（可能叫白亞鐵血紅素）鍵合到底物上，同時(shí)質(zhì)子被轉(zhuǎn)移到釋放出的H夕中，氧原子被轉(zhuǎn)移到酸性亞硫酸鹽還原的6個(gè)電子上形成硫化物。圖4.圖示說(shuō)明的4個(gè)不飽和?；糠值碾p磷脂酰甘油（心肌磷脂抗原，CL）結(jié)構(gòu)。圖5.CL生物合成途徑材料和方法實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵發(fā)酵用安裝有膠塞并頂部用石蠟?zāi)し饪诘?00ml無(wú)菌真空厄倫美厄燒瓶，在15℃冰箱中完成，為了把氧的進(jìn)入降到最低，橡膠管被連接到另一端浸入水中的真空口上，以允許CO2的逸出及阻止氧氣的進(jìn)入。所有發(fā)酵都是控制可發(fā)酵性糖90%是葡萄糖，10%是麥芽糖，沒(méi)有麥芽三糖的17°P麥汁。發(fā)酵10天后，取樣分析，所有樣品都立即在溫度4℃,3,300義g速度下離心30min以去除酵母。離心后，嫩啤酒樣品轉(zhuǎn)入另一容器立即冷藏直到分析，如果進(jìn)行H2s分析，樣品冷貯需要在24小時(shí)內(nèi)分析。呼吸缺陷型酵母培養(yǎng)呼吸缺陷型（RD）酵母突變菌株收集自我們的常規(guī)酵母質(zhì)量研究室RD平皿分析，一標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基用于在30℃下有氧培養(yǎng)酵母96小時(shí)，雙倍的帶有瓊脂的磷酸緩沖液（6.1g的NaH2PO4,5.8g的Na2HPO4,15.0g的瓊脂同500mL的DI水混合）和雙倍的顏色指示劑（1.0g的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）同500mlDI水混合）混合成等份的無(wú)菌混合物，傾倒在平皿上，平皿在室溫下面向上培養(yǎng)4小時(shí)，包含TTC（2.og/L）的溶化的軟瓊脂用做顏色指示劑覆蓋物。用無(wú)菌環(huán)從TTC覆蓋的與RD相關(guān)的顯示白色形態(tài)的兩個(gè)菌落中挑取酵母，接種到培養(yǎng)燒瓶中，用于培養(yǎng)的麥汁初始體積是50ml。麥汁和酵母被轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌的塑料厄倫美厄燒瓶中，放在一個(gè)軌道振蕩器中振蕩24小時(shí)，培養(yǎng)溫度要準(zhǔn)確控制在25℃,酵母要在同樣的條件下使用250ml和1000ml更大規(guī)模的分別培養(yǎng)48小時(shí)和72小時(shí)，一旦足夠的酵母數(shù)量產(chǎn)生，酵母就要再接種三次，以便增殖有氧生長(zhǎng)的突變體，從每三次培養(yǎng)中收集啤酒樣品，分析酒精、外觀發(fā)酵度、CO2和殘余的蛋氨酸和硫酸鹽。RD酵母實(shí)驗(yàn)在添加酵母之前，收自于生產(chǎn)初始狀態(tài)一系列控制發(fā)酵的健康新鮮酵母（活力97.2%）以與RD酵母進(jìn)行對(duì)比，RD酵母和控制酵母菌落的細(xì)胞濃度用血球計(jì)分析以測(cè)定接種比例，目標(biāo)是細(xì)胞濃度達(dá)到19.0義106個(gè)細(xì)胞/mL,麥汁用一個(gè)無(wú)菌氣體分散裝置充氣，使氧氣達(dá)到飽和度（8-10mg/L）,使用簡(jiǎn)單的完全隨機(jī)化的設(shè)計(jì)，使每一個(gè)酵母實(shí)驗(yàn)都被接種三次。CL變更實(shí)驗(yàn)為了改變CL的形成，酵母在三個(gè)不同條件下培養(yǎng)，酵母泥以7ml的等分部分用上述討論的各種處理方式在40ml的無(wú)菌水中培養(yǎng)18小時(shí)，以改變雙磷脂酰甘油的形成：肌糖（1mg/mL）、甘油（40%體積）、15.0Pg/mL的甲狀腺素、和無(wú)菌水。培養(yǎng)的酵母泥添加到氧氣含量為12.0mg/L的麥汁中。肌糖購(gòu)買于本地的小賣部，甘油從Sigma-Aldrich公司獲得（純度99.5%光譜測(cè)量級(jí)），甲狀腺素（左旋甲狀腺氨酸鈉）藥片從VirbacAH有限責(zé)任公司獲得，作為完全的隨機(jī)化設(shè)計(jì)，所有的實(shí)驗(yàn)都被接種三次。H2s分析啤酒中的硫化氫含量用氣相色譜（GC）（安捷倫6890A）測(cè)量，氣相色譜柱是一個(gè)MXT-1（100%二甲基聚硅氧烷交聯(lián)），60m,0.53mmID,7pm膜厚度，編目號(hào)#70193,一個(gè)安捷倫頂空自動(dòng)進(jìn)樣器（安捷倫G1888）用于凈化和分離樣品，一個(gè)Sievers355硫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器（SCD）用于區(qū)分硫種類，發(fā)酵結(jié)束后離心的樣品被冷貯（大約6℃）在干凈的40ml的玻璃小瓶中（安捷倫頂空螺旋蓋）直至分析。氣相色譜灶溫條件如下：初始溫度50℃,以10℃/min的升溫速率升到80℃,接著以10℃/min的升溫速率220℃,運(yùn)行9min。氨基酸用帶有可編程熒光檢測(cè)器和有柱前衍生化的四個(gè)一組泵的安捷倫1100系列的高效液相色譜儀（HPLC）測(cè)定氨基酸，首先用苯二醛和3-巰基丙酸控制伯氨基酸的衍生，然后仲氨基酸用9-熒光尼龍甲氧氯甲酸酯衍生，然后衍生物在一個(gè)反相ZorbaxEclipseAAA柱（安捷倫分析柱，4.6X150mm,3.5^m）上分離，并且用安捷倫1100系列可編程熒光檢測(cè)器進(jìn)行熒光檢測(cè)，蛋氨酸是令人感興趣的伯氨基酸，半胱氨酸不能用這個(gè)方法檢測(cè)。無(wú)機(jī)離子和有機(jī)酸在本實(shí)驗(yàn)中硫酸鹽是感興趣的主要無(wú)機(jī)離子，DionexCDMII電導(dǎo)檢測(cè)器，IonPacAS11柱，IonPacAS11加裝防護(hù)柱，和ATC-3前置柱及ASRSUltraII自回收干擾抑制器被使用。二氧化硫總二氧化硫用通過(guò)流動(dòng)進(jìn)樣分析改良的副品紅化學(xué)法測(cè)定，Skalar系列設(shè)備用于分析，包括SA1000自動(dòng)取樣器、SA5000化學(xué)裝置單元，及Skalar反應(yīng)器和控制器。比重、酒精、濃度和PH使用帶有AlcolyzerPlus酒精分析儀的安東帕DMA5000比重計(jì)和VarianCary50分光光度計(jì)測(cè)量麥汁和發(fā)酵樣品的比重、酒精、外觀濃度和實(shí)濃。PH測(cè)量用Altexm70pH計(jì)進(jìn)行。菌量在實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵期間生產(chǎn)的菌量總濕重，在嫩啤酒被輕輕從厄倫美厄發(fā)酵燒瓶中轉(zhuǎn)入另一容器之后被測(cè)定，在酵母再懸浮前，酵母和燒瓶中殘存的啤酒混合并補(bǔ)足去離子水，然后轉(zhuǎn)移到預(yù)先稱重的離心管中，酵母泥在4,000RPM下4℃離心30min,當(dāng)離心完，啤酒被轉(zhuǎn)入另一容器，讓酵母留在離心管中，測(cè)量此酵母和離心管的重量便是總濕重，用總濕重減去離心管的重量便是一共產(chǎn)生的生物量，再減去接種的量，以確定后形成的菌量。統(tǒng)計(jì)分析方差分析（ANOVA）法被使用來(lái)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，詳細(xì)方法可在別處找到，所有分析都用版本15的Minitab軟件來(lái)完成。結(jié)果和討論呼吸缺陷型酵母的培養(yǎng)在酵母轉(zhuǎn)移到隨后的燒瓶中期間，完成培養(yǎng)過(guò)程后，啤酒樣品就被收集以分析5。2、酒精、PH和殘存的蛋氨酸和硫酸鹽（表1）,每一個(gè)連續(xù)的培養(yǎng)都使用同樣的麥汁樣品，此麥汁樣品是無(wú)菌的、冷貯的（4℃）直到使用。數(shù)據(jù)檢測(cè)提示了一個(gè)有趣的情況，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，隨著蛋氨酸利用的降低和硫酸鹽攝入的增加，SO2含量升高，人們普遍認(rèn)為提高麥汁溶解氧將導(dǎo)致較低的亞硫酸鹽產(chǎn)生，在培養(yǎng)期間使用給定的有氧條件，這些亞硫酸鹽含量顯示出相當(dāng)高，并且硫酸鹽攝入的增加優(yōu)先于蛋氨酸的利用，暗示RD酵母細(xì)胞通過(guò)硫酸鹽的同化途徑正在合成S-氨基酸和其它的硫化合物。硫酸鹽的攝入被兩個(gè)硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（高親和力和低親和力硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，圖1）促進(jìn)，控制這些蛋白質(zhì)的基因表達(dá)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的S-腺苷蛋氨酸（SAM）含量緊密調(diào)節(jié)，這樣，SAM細(xì)胞內(nèi)的含量在硫酸鹽同化途徑中，在酵母繁殖期間能被耗盡，給出了升高的SO2含量，在亞硫酸鹽形成之后這種堵塞可能發(fā)生。RD酵母發(fā)酵實(shí)驗(yàn)終結(jié)發(fā)酵（EOF）的啤酒化學(xué)參數(shù)的結(jié)果提供在表2中，實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是評(píng)價(jià)如果RD突變體與它們的親代相比是否產(chǎn)生較高含量的SO2，這些研究結(jié)果與這個(gè)研究假說(shuō)相矛盾，但是值得注意的是RD酵母發(fā)酵甚至不比親代弱，在別處也報(bào)道過(guò)這樣的發(fā)現(xiàn)。再者，控制酵母比RD突變體利用了更多的硫酸鹽，對(duì)于解釋這些結(jié)果，一個(gè)非傳統(tǒng)的方式是比較亞硫酸鹽產(chǎn)生的水平與硫酸鹽利用的數(shù)量，它將在酵母同化硫酸鹽，生物合成生長(zhǎng)必須的S-氨基酸和SAM的效率程度方面提供一個(gè)尺度，從方差分析結(jié)果（表3）顯示，在轉(zhuǎn)化過(guò)程中RD酵母效率低（P<0.05）（圖.6）。為了定量在這個(gè)實(shí)驗(yàn)期間RD酵母增殖培養(yǎng)后的純度，買到了一個(gè)添加酵母泥的樣品以備呼吸缺陷型分析，標(biāo)準(zhǔn)的TTC覆蓋用于找出呼吸缺陷型和呼吸充足型酵母之間的微小差別（圖7）。基于這些結(jié)果，增殖培養(yǎng)產(chǎn)生了大約29%RD酵母的混合物，對(duì)于作者的了解，這是第一個(gè)與RD酵母影響SO2生成的相關(guān)報(bào)道。很清楚，額外的研究需要準(zhǔn)確地定量這個(gè)影響是什么，但是在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)RD酵母妨礙了硫酸鹽的同化效率，確切的機(jī)制是什么仍然需要被研究，但已經(jīng)證明crdlA突變體更易于有呼吸缺陷的傾向，因此可能這與唯一的線粒體脂質(zhì)，CL有關(guān)。雙磷脂酰甘油改變實(shí)驗(yàn)來(lái)自實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在表4中，此實(shí)驗(yàn)中CL的促進(jìn)物和抑制物都被用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中。SO2檢驗(yàn)的結(jié)果突出顯示了富含肌糖的培養(yǎng)酵母泥的影響，并且假定這些培養(yǎng)酵母細(xì)胞的雙磷脂酰甘油的發(fā)育被抑制，這就暗示了一個(gè)與線粒相關(guān)的作用。本來(lái)預(yù)計(jì)酵母用L-甲狀腺素培養(yǎng)的發(fā)酵，應(yīng)該產(chǎn)生較低的SO2含量，可是這些發(fā)酵有了一個(gè)更高程度的衰減，在這些發(fā)酵中，對(duì)于S-氨基酸和SAM的需求會(huì)更高是合乎邏輯的，所以要分析數(shù)據(jù)的另一種方法是使酒精發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的SO2標(biāo)準(zhǔn)化，這些對(duì)比顯示的表5中，證明了在肌糖和L-甲狀腺素培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之間處理方式上的明顯差別（P<0.05）（圖8），另外為了支撐增強(qiáng)CL發(fā)育將導(dǎo)致亞硫酸鹽形成的減少這個(gè)想法，通過(guò)了一個(gè)更有效的硫酸鹽同化途徑，我們能看到酵母細(xì)胞用甲狀腺素培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，蛋氨酸的充分利用（麥汁蛋氨酸是45.9mg/L）伴隨著硫酸鹽較高攝入的發(fā)生（表4）。酵母細(xì)胞用肌糖培養(yǎng)的發(fā)酵有較高的SO2含量，有適度的硫酸鹽攝入量和生物量形成（圖9）?？吹降牧硪粋€(gè)有趣的相關(guān)模式是在L-甲狀腺素實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了較高的H2s含量，可能意味著SO2形成后通過(guò)硫酸鹽同化途徑硫酸鹽流出的較多，硫酸鹽和蛋氨酸利用的相似模式在一個(gè)用缺乏脂質(zhì)和富含脂質(zhì)的對(duì)比發(fā)酵研究中也報(bào)道過(guò)。雙磷脂酰甘油也與另一個(gè)硫化合物，二甲基硫（DMS）通過(guò)線粒體蛋氨酸亞砜還原酶活性相關(guān)聯(lián)，Anness和Bamforth提出，在蛋氨酸亞砜和亞硫酸鹽還原酶之間，可能通過(guò)和硫氧還蛋白和它的酶的競(jìng)爭(zhēng)存在一個(gè)關(guān)系，但是酵母亞硫酸鹽還原酶復(fù)合體不含有也不和硫氧還蛋白相互作用，然而Samp等人證實(shí)基于目前的結(jié)果，如果雙磷脂酰甘油的形成被加強(qiáng)，DMS生成將增加，SO2的生成將減少，這個(gè)明顯的負(fù)相關(guān)將在以后詳細(xì)闡明。與SIR中ISC缺乏相關(guān)的可能機(jī)制已經(jīng)提出SIR的缺陷導(dǎo)致在發(fā)酵麥汁中亞硫酸鹽的積累，看一下酸性亞硫酸鹽是如何需要6個(gè)電子轉(zhuǎn)移到SIR催化腔內(nèi)的硫酸鹽鍵上（圖3），如果[4Fe-4S]輔基在siroheme（可能叫白亞鐵血紅素）末端的普羅米克斯（乙烯系單體與蛋白質(zhì)共聚物纖維）上失去，那么此反應(yīng)將被阻礙。盡管ISC的形成和脫輔基蛋白的成熟機(jī)制今天已被闡明，但這些［4Fe-4S］簇在線粒體內(nèi)合成的觀點(diǎn)已經(jīng)建立，也已知線粒體ATP被需要去執(zhí)行這些步驟，例如，已經(jīng)顯示不久后在線粒體內(nèi)形成的伴侶蛋白質(zhì)，Ssq1,與Fe-S簇密切相關(guān)，ATP耗盡將導(dǎo)致Fe-S蛋白質(zhì)形成的完全崩潰。人們認(rèn)為SIR是一種胞液蛋白，線粒體內(nèi)膜ATP鍵合轉(zhuǎn)運(yùn)體，Atm1蛋白質(zhì)與成熟的SIR輸出機(jī)構(gòu)有關(guān)，如此線粒體ATP對(duì)于完成ISC輸出到胞液是必須的。另外，來(lái)自Hausmann等人的結(jié)果證實(shí)，ISC胞液裝配蛋白例如Nbp35P的缺陷，導(dǎo)致SUL1基因2.7倍的誘發(fā)，并且證明通過(guò)減低成熟的SIR復(fù)合體的Fe-S簇，使亞硫酸鹽還原酶活性缺失，是硫酸鹽攝入量增加的原因。Seki等人證實(shí)siroheme（可能叫白亞鐵血紅素）自身能還原酸性亞硫酸鹽，但是速率較慢，所以在這種條件下，細(xì)胞內(nèi)酸性亞硫酸鹽的累積將發(fā)生。那么線粒體ATP來(lái)源于什么地方呢？通過(guò)F0-F1ATP合成酶復(fù)合體的氧化磷酸化作用不可能是厭氧條件下發(fā)酵的原因，再者，克勒勃屈利效應(yīng)（葡萄糖效應(yīng)）保證了在此研究中麥汁中較高的葡萄糖含量及有氧條件將不會(huì)形成線粒體ATP，因此胞液ATP只是能流的來(lái)源，而且必須通過(guò)AdN轉(zhuǎn)移酶遞交，已經(jīng)顯示CL以6：1的比率緊密地鍵合到AdN轉(zhuǎn)移酶上，并且知道CRDKCL合成酶）突變體有缺陷的AdN轉(zhuǎn)移酶。來(lái)自于RD酵母發(fā)酵，亞硫酸鹽與硫酸鹽的比率較高，意味著RD酵母缺乏CL的正常發(fā)育，于是線粒體ATP受到了限制。相反地，L-甲狀腺素實(shí)驗(yàn)顯示了較低的，正?；膩喠蛩猁}生成，這是提高了雙磷脂酰甘油形成量，導(dǎo)致較高數(shù)量的線粒體ATP的結(jié)果。已知甘油促進(jìn)了CRD1的表達(dá)，但是也證實(shí)在暴露在葡萄糖環(huán)境中，CRD1的表達(dá)幾乎完全被抑制。不幸的是，因?yàn)檫@些實(shí)驗(yàn)中的麥汁含有較高濃度的葡萄糖，在甘油培養(yǎng)酵母實(shí)驗(yàn)中，一旦細(xì)胞被接入富含葡萄糖的麥汁后，CRD1的表達(dá)可能立即被抑制。線粒體ATP的限制束縛了生長(zhǎng)，許多作者都已經(jīng)用圖解說(shuō)明了亞硫酸鹽形成和生物菌量形成的負(fù)相關(guān)，在相關(guān)的研究中都把目標(biāo)對(duì)準(zhǔn)了低含量的線粒體ATP上，O’Connor-Cox等人把細(xì)胞暴露于米酵菌酸中，抑制了AdN轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)亞硫酸鹽積累明顯升高，Lodoloetal等人指導(dǎo)的，用羰基氰化間氯苯腙（CCCP）做的相似實(shí)驗(yàn)也顯示減少了CL合成酶的活性，同時(shí)這些報(bào)告說(shuō)明遲緩發(fā)酵產(chǎn)生較高的SO2，遺憾的是在這些實(shí)驗(yàn)中SO2沒(méi)有被檢測(cè)。在發(fā)酵過(guò)程中DMS和SO2生成的負(fù)相關(guān)可能與CL形成有關(guān)，已經(jīng)提出很可能通過(guò)蛋白質(zhì)進(jìn)入功能影響線粒體內(nèi)部的蛋氨酸亞砜還原酶活性，由于雙磷脂酰甘油的形成被增強(qiáng)，線粒體ATP的有效性被提高，及亞硫酸鹽還原酶復(fù)合體的支撐物［4Fe-4S］成熟，因此硫酸鹽的有效轉(zhuǎn)化發(fā)生導(dǎo)致較低的SO2生成，同時(shí)蛋氨酸亞砜還原酶還原二甲亞砜為DMS似乎是合理的。結(jié)論有證據(jù)支持了在發(fā)酵期間線粒體在二氧化硫生成中的作用，如果酵母線粒體膜的CL含量被降低，那么膜有功能將被改變，由于CL緊密地鍵合到AdN轉(zhuǎn)移酶蛋白上，蛋白又牢牢地嵌入膜中（圖10），因此線粒體ATP的受限制將發(fā)生，由于［4Fe-4S］的合成，這些簇的形成（圖2B）需要ATP，于是一個(gè)SIR中的重要輔基將被限制。再者，通過(guò)Atm1蛋白進(jìn)行的伴侶ISC的輸出到胞液中由于需要ATP也會(huì)受到影響。也有一個(gè)可能性是CL能與Atm1蛋白相互作用，如此帶有［4Fe-4S］簇的細(xì)胞溶質(zhì)sir復(fù)合體將完全不成熟，因此當(dāng)電子轉(zhuǎn)移以還原酸性亞硫酸鹽時(shí)催化部位將不起作用。由于一旦HSO3-鍵合到SIR上，就沒(méi)有中間物被釋放，這使亞硫酸鹽還原形成堵塞，導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)積累，假定存在的亞硫酸鹽

泵由于細(xì)胞內(nèi)HSO3-累積會(huì)將HSO3-排出細(xì)胞外進(jìn)入發(fā)酵麥汁中，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)SAM的耗盡導(dǎo)致更多硫酸鹽的攝入。表1.每一個(gè)培養(yǎng)結(jié)束后的啤酒樣品的化學(xué)結(jié)果參數(shù)培養(yǎng)1培養(yǎng)2培養(yǎng)3總SO2(mg/L)11.828.638.1酒精(％w/w)3.476.126.74蛋氨酸(mg/L)14.519.025.2硫酸鹽(mg/L)92.168.952.7表2.RD酵母實(shí)驗(yàn)的EOF啤酒化學(xué)結(jié)果實(shí)驗(yàn)總SO2(mg/L)酒精(％wt/wt)濕濃度(mg/L)SO42■攝入(mg/L)AE(°P)EOFpHRD酵母23.55.0820.222.55.514.37RD酵母24.55.0919.617.05.284.37RD酵母22.65.1520.917.05.374.37控制酵母29.45.8424.341.53.994.49控制酵母32.36.0323.944.83.574.45控制酵母30.26.1324.942.33.334.47表3.RD酵母實(shí)驗(yàn)中亞硫酸鹽生成與硫酸鹽消耗比率的方差分析表變異來(lái)源Df平方和均方F-比P值酵母類型10.46440.464422.170.009誤差40.08380.0209總計(jì)50.5482

總SO2(mg/L)酒精(%wt/wt)濕濃度(mg/L)SO42-攝入(mg/L)生物量(g)EOFpHH2s(Mg/L)控制123.35.5930.341.16.714.494.5控制225.45.7333.345.77.454.463.1控制323.35.7229.141.58.864.4610.6甘油122.75.3333.043.28.504.463.2甘油221.8