噬菌體基因敲除

噬菌體侵染分支桿菌基因敲除實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料與試劑7H9、7H10培養(yǎng)基、TopAgar、牛血清白蛋白（BSA）、潮霉素、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、Tris、SDS、卡那霉素、西班牙瓊脂糖（Biowest）、GlodviewDNA染料Van91I、AlwNI、PflMI、PacI、Tween-80、T4DNA連接酶、EcoRI、Hindlll、BamHI、TransT叫HiFiDNA酶（含dNTPS）、Trans2KPlusDNAMarker、九DNA/HindIIIDNAMarker、DNAMarkerIII、普通質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、冰醋酸、氯仿、無水乙醇、甘油、乙二胺四乙酸⑴口1人）、CaCl2、MgCl2、HCl、NaCl、葡萄糖、異丙醇。主要試劑配置方法：①ADS：50gBSA,20g葡萄糖，8.5gNaCl定容到1L蒸餾水中，用0.22mmMillipore濾膜過濾后，放于4℃冰箱備用。②7H9液體培養(yǎng)基：4.7g7H9溶于900ml蒸餾水中，混勻，加入10ml50%（質(zhì)量體積比）甘油，120℃高壓滅菌20min，冷卻后加入100mlADS，放于4℃冰箱備用。使用時(shí)每40ml7H9培養(yǎng)基需加入100Ml20%Tween-80。③7H10固體培養(yǎng)基：19g7H10溶于900ml蒸餾水中，混勻，加入10ml50%（質(zhì)量體積比）甘油，120℃高壓滅菌20min，冷卻后加入100mlADS，到平板。TopAgar：0.4g7H9，0.75gagar溶于100ml蒸餾水中，120℃高壓滅菌20min，冷卻后加入1ml20%葡萄糖（0.22口mMillipore濾膜過濾），備用。MPbuffer：pH7.6Tris-Cl50mM，Nacl150mM，MgCl210mM，CaCl22mM。Extractbuffer：pH7.8Tris-HAc40mM，NaAc20mM，EDTA1mM,1%SDS。實(shí)驗(yàn)用菌株：恥垢分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（mc2155）、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌HB101。1重組打靶片段的構(gòu)建載體構(gòu)建載體p0004上具有四個(gè)Van91I酶切位點(diǎn)，且具有后期包裝噬菌體所需要的cos位點(diǎn)。用Van91I限制性內(nèi)切酶酶切p0004,回收1.6kb和3.6kb目的片段（即去除結(jié)構(gòu)圖上的LR兩片段）。目的基因克隆(1)PCR擴(kuò)增MSMEG_1804基因左右臂，引物如下：MSMEG_1804L(AlwNI，996bp)MSMEG_1804LFTTTTTTTTCAGAAACTGAAGACGACCCGTGAGGGTAMEMEG_1804LRTTTTTTTTCAGTTCCTGATGTCGAGAACGTCTGCGTMSMEG_1804R(AlwNI，1008bp)MSMEG_1804RFttttttttcagagactgTGCTGGCCAAGTCGCTMSMEG_1804RRTTTTTTTTCAGCTTCTGTGGGAACACGATGGAACCT(2)PCR擴(kuò)增MSMEG_2415基因左右臂，引物如下：MSMEG_2415L(PflMI，791bp)MSMEG_2415LLTTTTTTTTCCATAAATTGGTTCAACAGCGACCTCGTGACMSMEG_2415LRTTTTTTTTCCATTTCTTGGTGTGCTGATCGGTGAGAAACMSMEG_2415R(PflMI，996bp)MSMEG_2415RFTTTTTTTTCCATAGATTGGATCGGCTCGGCCCTGAAMSMEG_2415RRTTTTTTTTCCATCTTTTGGTTCGCATGCGTCGCCATA(3)通過切膠回收目的片段，步驟如下：i從瓊脂糖凝膠中將單一的目的DNA條帶膠切下放入干凈的離心管中，稱取膠塊質(zhì)量。正向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN。50℃水浴放置10min,其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。iii將上一步所得溶液加入吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置2min,12000rpm離心Imin,棄掉收集管中液體。次向吸附柱內(nèi)加入600pl漂洗液(使用前按要求加入適量無水乙醇)，室溫靜置2min,12000rpm離心1min,棄掉收集管中液體。▽向吸附柱內(nèi)再加入600Pl漂洗液，12000rpm離心1min,棄掉收集管中液體，再離心2min,棄掉收集管，將吸附柱放入ep管中，65℃烘干，防止殘留的漂洗液影響下一步洗脫效果。5向吸附柱中心加入30Pl蒸餾水，室溫放置2min,12000rpm離心2min,棄掉吸附柱，于ep管上做好標(biāo)記。(4)用限制性內(nèi)切酶AlwNI酶切MEMEG_1804LR,PflMI酶切MEMEG_2415LR,37℃3hr,然后用等體積異丙醇-20℃沉淀15min,12000rpm離心10min,棄上清，70%乙醇1ml洗一次，12000rpm離心10min,烘干，溶于15Pl蒸餾水中，用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目的片段回收效果。1.3敲除載體構(gòu)建（1）連接目的基因左右臂片段和p0004回收兩片段，連接產(chǎn)物經(jīng)熱轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞。由于p0004的3.6bp片段含有潮霉素抗性基因，故用含潮霉素（150口g/ml）的LB平板篩選單菌落。（2）提取篩選單菌落質(zhì)粒，步驟如下：i取4ml過夜培養(yǎng)的菌液于離心管中，12000rpm離心Imin,收集菌體，向菌體內(nèi)加入250Ml溶液P1（使用前加入規(guī)定量的RnaseA,重懸菌體并混勻。正向離心管中加入250Ml溶液P2,溫和的上下顛倒6-8次混勻，使菌體充分裂解。出向離心管中加入350Ml溶液P3,立即上下顛倒6-8次溫和混勻，12000rpm離心10min,取上清于吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），室溫靜置2min,12000rpm離心1min,棄掉收集管中液體。次向吸附柱內(nèi)加入600ml漂洗液（使用前按要求加入適量無水乙醇），室溫靜置2min,12000rpm離心1min,棄掉收集管中液體。▽向吸附柱內(nèi)再加入600Ml漂洗液，12000rpm離心1min,棄掉收集管中液體，再離心2min,棄掉收集管，將吸附柱放入ep管中，65℃烘干，防止殘留的漂洗液影響下一步洗脫效果。5向吸附柱中心加入50Ml蒸餾水，室溫放置2min,12000rpm離心2min,棄掉吸附柱，于ep管上做好標(biāo)記。（3）提取質(zhì)粒送出測(cè)序，驗(yàn)證目的基因左右臂是否正確插入到p0004載體中，完成敲除載體的構(gòu)建。噬菌體體外包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)本實(shí)驗(yàn)用phAE159質(zhì)粒含有分支桿菌噬菌體的編碼信息，用限制性內(nèi)切酶PacI分別酶切phAE159和測(cè)序質(zhì)粒，連接兩片段，通過噬菌體體外包裝步驟，轉(zhuǎn)化入HB101感受態(tài)，用含潮霉素（150Mg/ml）的LB平板篩選單菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切驗(yàn)證得到穿梭載體phasmid，經(jīng)由電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入mc2155感受態(tài)中，電轉(zhuǎn)后加入1ml7H9培養(yǎng)基（不含Tween-80）室溫復(fù)蘇1hr，與新鮮培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8的mc2155菌液混合，加入到3ml融化的TopAgar中，平鋪到7H10平板上，于30℃培養(yǎng)3天，挑選噬菌斑。擴(kuò)增噬菌體，利用同源重組進(jìn)行基因敲除噬菌體擴(kuò)增取噬菌斑溶于50微升MPBuffer，室溫1hr，放入4℃過夜。取300Mlmc2155與3mlTopAgar混勻，平鋪到7H10平板，待Agar凝固后，離心過夜溶于MPbuffer的噬菌斑，取3Ml上清點(diǎn)到上述平板上，30℃培養(yǎng)2天，由于噬菌體具有在30℃裂解生長的特點(diǎn)，通過裂解宿主細(xì)菌，達(dá)到擴(kuò)增噬菌體的目的。兩天后取擴(kuò)增后的噬菌斑溶于200MlMPbuffer，室溫1hr，4℃過夜，離心，取5Ml上清液，加入到300Mlmc2155中，再與3mlTopAgar混勻，平鋪到7H10平板，30℃培養(yǎng)2天，繼續(xù)擴(kuò)增噬菌體。兩天后加入4mlMPbuffer與上述平板中，4℃過夜溶出噬菌體，回收上清液用0.22Mm的Millipore濾膜過濾，梯度稀釋測(cè)定噬菌體的滴度，當(dāng)達(dá)到1010/ml時(shí)，可以用來進(jìn)行基因敲除。利用同源重組進(jìn)行基因敲除（1）從4℃冰箱的種子液中按1%接種量傳代培養(yǎng)mc2l55，至OD600為0.6-0.8（2）取2ml菌液，12000rpm離心1min，棄上清，用1mlMPbuffer清洗菌體兩次，12000rpm離心1min后棄上清液，菌體用200pl7H9培養(yǎng)基（不加Tween-80）重懸。（3）取100Pl滴度達(dá)1010/ml的噬菌體與100Pl上述處理菌液混勻，37℃靜置3hr后，全部涂布在含潮霉素（75pg/ml）的7H10