ISO11737 1評估產(chǎn)品中的微生物數(shù)量中文版

國際標(biāo)準第一版ISO11737-11995-12-01醫(yī)療器械的滅菌——微生物學(xué)的方法——第1部分：評估產(chǎn)品中的微生物數(shù)量目錄頁數(shù)1范圍………12參考標(biāo)準…………………13定義………24概述………24.1證明文件………………24.2人員……………………24.3設(shè)備……………………24.4培養(yǎng)基和材料…………25產(chǎn)品單位的選擇…………35.1產(chǎn)品單位的選擇………35.2取樣項目份額…………36技術(shù)的選擇………………37技術(shù)的驗證………………38技術(shù)的運用………………3附錄A評估產(chǎn)品中微生物數(shù)量的指導(dǎo)…………515微生物技術(shù)驗證方法的指導(dǎo)……………BC參考文獻…………………19前言ISO（國際標(biāo)準化組織）是各國標(biāo)準部門（ISO成員國）的廣泛聯(lián)合。國際標(biāo)準的制定工作一般是通過ISO技術(shù)委員會來實施的。任何成員體對已經(jīng)建立有關(guān)課題的技術(shù)委員會有興趣，都有權(quán)力作為該技術(shù)委員會的代表。與ISO有聯(lián)系的國際組織、政府和非政府，也可參加此項工作。ISO與國際電工委員會密切合作，共同參與國際電子技術(shù)標(biāo)準的制定。由技術(shù)委員會采納的國際標(biāo)準草案在各成員體之間流轉(zhuǎn)，以便大家投票。作為國際標(biāo)準的出版社，必須得到至少75％的成員國的投票同意。國家標(biāo)準ISO11737-1是技術(shù)委員會ISO/TC198（“保健護理產(chǎn)品滅菌”組織名稱）制定的。它建立在CEN技術(shù)委員會204（醫(yī)療器械滅菌）第五工作小組制定的三個歐洲標(biāo)準的基礎(chǔ)之上的。．ISO11737-1由以下幾部分組成。總標(biāo)題是：醫(yī)療器械的滅菌——微生物學(xué)方法——第1部分：產(chǎn)品中微生物數(shù)量的估算——第2部分：在滅菌過程驗證中實施的滅菌效果測試附加部分以后發(fā)表。ISO11737中的附錄A、B、C部分僅提供信息。簡介無菌產(chǎn)品是沒有活體細菌的產(chǎn)品。國標(biāo)標(biāo)準對于保健護理類產(chǎn)品的滅菌要求是當(dāng)它需要提供滅菌產(chǎn)品時，產(chǎn)品外觀已通過所有實踐手段，使該保健護理產(chǎn)品的微生物污染源減至最小。即使如此，在按照質(zhì)量體系標(biāo)準要求條件下生產(chǎn)的保健產(chǎn)品，在滅菌以前就已經(jīng)有細菌了－盡管數(shù)量很少。像這樣的產(chǎn)品就屬于未滅菌的。而滅菌的過程就是抑止微生物的污染，并將未滅菌產(chǎn)品轉(zhuǎn)化為滅菌產(chǎn)品的過程。．通過采用物理和/或化學(xué)試劑的方法對保健護理產(chǎn)品進行滅菌，常常是一種近于指數(shù)的關(guān)系；這種方法不可避免的總有一些細菌不管作了何種消毒或是滅菌處理都有存活的可能性。對于給定的處理方法，細菌存活的可能性決定于細菌的數(shù)量、抵抗能力和在滅菌過程中細菌所生存的環(huán)境。經(jīng)過滅菌后的產(chǎn)品中的任何一個產(chǎn)品的滅菌情況都是無法保證的，而一定數(shù)量產(chǎn)品的滅菌情況必須根據(jù)這些產(chǎn)品中含有細菌的產(chǎn)品的可能性決定。參照ISO90001和ISO9002,保健護理的產(chǎn)品的質(zhì)量體系要求包括設(shè)計/開發(fā)、生產(chǎn)、安裝和保養(yǎng)等。在ISO9000系列標(biāo)準中指出：如果有些結(jié)果無法在產(chǎn)品檢驗和測試中得到驗證，那么這些生產(chǎn)過程就被稱為“特殊”。因為滅菌處理的有效性沒有通過產(chǎn)品的檢驗和測試得到驗證，因而滅菌也稱為“特殊”過程。因此，滅菌過程必須在使用之前確定其有效性，每一次的滅菌處理要按常規(guī)操作，并且設(shè)備要進行適當(dāng)?shù)木S護。國際標(biāo)準已對保健護理產(chǎn)品滅菌過程的日常監(jiān)控作了規(guī)定（見ISO11134、ISO11135、ISO11137），并提供了明確的處理步驟。然而，必須清醒地認識到，在適當(dāng)?shù)尿炞C和有效控制之下的滅菌處理，不僅關(guān)系到產(chǎn)品滅菌的有效驗證和日常監(jiān)控，也關(guān)系到產(chǎn)品的預(yù)期用途。的確，對于滅菌過程的有效驗證和常規(guī)控制，還應(yīng)重視微生物方面的挑戰(zhàn)，如微生物的數(shù)量、識別及其性質(zhì)。預(yù)滅菌的微生物污染源途徑眾多，因此，必須注重給出的一系列要素，包括原材料或成分的微生物狀態(tài)，它們的存儲情況，以及產(chǎn)品在生產(chǎn)、安裝和包裝環(huán)境中的控制。術(shù)語“生物負荷”通常用于說明存在于材料或產(chǎn)品中的存活微生物的數(shù)量。確一般使用已規(guī)定的技術(shù)來確因此在實際操作中，定正確的生物負荷是不可能的。．定存活的數(shù)量。評估正確因素的應(yīng)用是通過存活數(shù)量和在材料和產(chǎn)品中的生物負荷相聯(lián)系來實施驗證的。對生物負荷的了解來源于對微生物污染物水平的調(diào)查。生物負荷評估是以若干分散情況的一部分執(zhí)行的：a)對滅菌過程的評估和再評估，生物負荷評估與滅菌條件下的范圍直接有關(guān)；b)對滅菌過程的評估和再評估，不僅與生物負荷評估直接有關(guān)，也與相應(yīng)的生物負荷知識有關(guān)；c)無菌產(chǎn)品生產(chǎn)過程的日?？刂?，滅菌評估如a)所示；d)無菌產(chǎn)品生產(chǎn)過程的日?？刂疲瑴缇u估如b)所示；生物負荷評估可作為生產(chǎn)保健護理產(chǎn)品的質(zhì)量體系的組成部分：e)全面的環(huán)境監(jiān)控程序；f)在去除微生物過程中潔凈處理的有效性的評估；g)對非滅菌但微生物潔凈產(chǎn)品處理的監(jiān)控；h)對原材料、組成部分和包裝的監(jiān)控。醫(yī)療器械的生物負荷評估一般由四個部分組成：——從醫(yī)療器械中去除微生物；——獨立的微生物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)狀態(tài)；——在生物負荷研究中因素的正確應(yīng)用，決定于從已滅菌數(shù)量計算生物負荷的評估。規(guī)定一種在所有情況下都能去除微生物的方法是不可能的。因為保健護理產(chǎn)品設(shè)計范圍和材料構(gòu)成的廣泛。而且，列舉的狀態(tài)也受到不同污染物的影響。．ISO11737的這部分規(guī)定了應(yīng)用于生物負荷評估的一般準則。ISO11737的部分附錄提供了額外的指導(dǎo)（附錄A）和用于該技術(shù)的方法（附錄B）。醫(yī)療器械的滅菌——微生物學(xué)的方法第1部分：產(chǎn)品中微生物數(shù)量的評估1范圍1.1ISO11737這部分專門規(guī)定了應(yīng)用于醫(yī)療器械及其部件、原材料或包裝上微生物的評估。此評估列舉微生物的數(shù)量和特征兩部分。注：1在常規(guī)操作前，應(yīng)先驗證產(chǎn)品上微生物數(shù)量的評估技術(shù)。在特征化期間識別其技術(shù)水平是必要的，取決于數(shù)據(jù)產(chǎn)生的使用。2ISO11737的附錄提供用于驗證所選擇技術(shù)的概要方法的指導(dǎo)。1.2ISO11737這部分不適用于病毒（細菌）污染的計數(shù)或鑒定。ISO11737這部分不適用于生產(chǎn)醫(yī)療器械環(huán)境的微生物的監(jiān)控。注3：應(yīng)關(guān)注與質(zhì)量體系有關(guān)的國際標(biāo)準（見ISO9001和ISO9002），其中介紹了生產(chǎn)各個階段的監(jiān)控，也包括滅菌的過程。ISO11737這部分并不要求在生產(chǎn)且在本標(biāo)準的適當(dāng)?shù)氐谠擉w系的某些部分有要求，期間具備完善的質(zhì)量體系，方引用了一些。2參考文獻以下標(biāo)準中包含的條款，不僅在本標(biāo)準中作為參考標(biāo)準，也是構(gòu)成ISO11737這部分的條款。公布出版后，本版本即時生效。所有的條款都能作進一步修改，我們鼓勵在基于ISO11737這部分條款下達成協(xié)議的各方調(diào)查、應(yīng)用標(biāo)準最新版本的可能性。ISO和IEC的成員保留當(dāng)前有效的國際標(biāo)準的注冊登記。ISO9001:1994——質(zhì)量體系，在產(chǎn)品設(shè)計、開發(fā)、生產(chǎn)、安裝和服務(wù)方面的質(zhì)量保證體系。3定義以下的條款和定義應(yīng)用于ISO11737的這部分。3.1生物負荷：在產(chǎn)品和/或包裝上存活的微生物數(shù)量。3.2生物負荷評估：對于微生物數(shù)量所建立的值，通過一種應(yīng)用于可存活的計算方法或滅菌前的計算，來獲取有效因素的補償。3.3特征：微生物構(gòu)成廣泛分類中的一般過程。注4：依照菌落、細胞形態(tài)、染色性和其他特性分類。3.4校正因素：應(yīng)用可存活計算方法或滅菌前計數(shù)的數(shù)值，以補償從產(chǎn)品或因生產(chǎn)而產(chǎn)生生物負荷的微生物的不完全去除的評估方法。3.5培養(yǎng)條件：列舉組合的條件，包括用于促進微生物生長和繁殖的隨著時間生產(chǎn)的培養(yǎng)基和孵化溫度。．3.6醫(yī)療器械：單獨或組合使用的任何儀器、設(shè)備、器具、材料或其他物品，包括適合應(yīng)用的軟件，預(yù)期用于人體的目的：——疾病的診斷、預(yù)防、監(jiān)護、治療或緩解；——對損傷或殘疾的診斷、監(jiān)護、治療、緩解或補償；——對解剖或生理過程的研究、替代或修正；——妊娠控制；這些并不能通過生理學(xué)、輻照免疫效應(yīng)或新陳代謝的方法達到人體體表或體內(nèi)的主要預(yù)期作用，但能通過這些方法來加強人體的功能。3.7滅菌前的計算：在滅菌前的可存活計算。3.8產(chǎn)品：用于描述原材料、中間產(chǎn)品、組合配件和最終醫(yī)療器械的通用術(shù)語。3.9提取效率：從產(chǎn)品去除微生物的特定技術(shù)能力的測量方法。3.10重新評估：確定已建立的一系列程序文件的驗證。3.11取樣項目份額：規(guī)定測試的保健護理產(chǎn)品單位的份額。3.12驗證：用獲取、記錄和解釋其結(jié)果的程序證明產(chǎn)品的生產(chǎn)符合預(yù)先確定的技術(shù)規(guī)格。注5：在評估生物負荷的條文中，“過程”是測試的方法，“產(chǎn)品”是測試的結(jié)果。對生物負荷評估技術(shù)的有效性是由一系列有效性調(diào)研和測試方法的再現(xiàn)性組成。3.13可存活的計算：在既定的培養(yǎng)條件下，根據(jù)離散的菌群的生產(chǎn)來估計微生物的數(shù)量。注6：一個離散的菌群并不來源于一個單獨的存活微生物。概要44.1證明文件4.1.1對于已使用的測試技術(shù)的文件程序和說明所有有關(guān)設(shè)備的使用和運用應(yīng)當(dāng)是有效的。這些程序和指導(dǎo)文件應(yīng)如同在ISO9001中規(guī)定的受到控制和批準。4.1.2ISO11737這部分要求的程序和說明應(yīng)當(dāng)有效地執(zhí)行。4.1.3計算和數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)化過程應(yīng)當(dāng)適當(dāng)?shù)貦z查。注7：如果用電子數(shù)據(jù)處理技術(shù)進行計算，應(yīng)在使用前驗證該軟件的有效性，并保留相關(guān)記錄。4.1.4所有原始的觀察、計算、衍生的數(shù)據(jù)和最終報告的記錄應(yīng)如同ISO9001規(guī)定的保留。記錄包括所有涉及取樣、制備和測試人員的身份。4.2人員4.2.1負責(zé)生物負荷評估的專業(yè)人員應(yīng)符合ISO9001規(guī)定要求。4.2.2評估人員的培訓(xùn)必須按文件程序規(guī)定執(zhí)行。有關(guān)的技術(shù)人員的資格、培訓(xùn)和經(jīng)歷的記錄必須保留。4.3設(shè)備4.3.1進行專門測試和測量的正確性的所有設(shè)備必須是有效的。4.3.2應(yīng)按文件規(guī)定對所有要求有計劃的設(shè)備進行維護保養(yǎng)，且保養(yǎng)記錄必須保留。4.3.3應(yīng)建立并保持一個有效的設(shè)備的標(biāo)準體系以使設(shè)備滿足測量和控制的功能。該標(biāo)準體系必須符合ISO9001規(guī)定。4.4培養(yǎng)基和材料對于用于生物負荷評估的材料的制備和滅菌，應(yīng)當(dāng)采用建立和形成文件的方法，包括進行適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量測試。．注8：適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量測試包括對成批培養(yǎng)基/每批培養(yǎng)基的生長情況的測試。5產(chǎn)品單位的選擇5.1產(chǎn)品單位的選擇接受測試的產(chǎn)品的選擇和獲取必須建立在確保該產(chǎn)品是日常生產(chǎn)中具代表性的基礎(chǔ)之上的。5.2取樣產(chǎn)品份額（SIP）如果取樣產(chǎn)品份額少于整個的產(chǎn)品單位，那么應(yīng)當(dāng)選擇整個產(chǎn)品單位中具代表性的微生物。如果證明微生物是均勻分布在產(chǎn)品上的，那么取樣份額就可從任何部分選擇。如不能證明這點，那么取樣份額應(yīng)從產(chǎn)品的若干部分中選擇。注9：對于滅菌過程的驗證和日常控制的要求所定的標(biāo)準應(yīng)當(dāng)規(guī)定SIP的適當(dāng)準則。6技術(shù)選擇6.1對于一個已確認的產(chǎn)品，如果去除可存活的微生物是技術(shù)的一部分，那應(yīng)考慮和記錄產(chǎn)品中與其有效性有關(guān)的因素。這些因素包括：a)去除微生物污染物的能力；b)污染微生物的可能種類及其所處產(chǎn)品上的位置；c)去除微生物污染物存活能力方法的有效性；d)已測試的產(chǎn)品的物理或化學(xué)性質(zhì)。6.2如果被測試產(chǎn)品的物理或化學(xué)性質(zhì)（見6.1條的d項）可能被釋放的物質(zhì)有去除此類物必須使用一種方法來中和、害地影響所檢測的微生物的數(shù)量或類型，質(zhì)的釋放。如果這種方法不可能，就應(yīng)使此類物質(zhì)的影響降至最低。這種方法的有效性必須得到驗證。注10：附錄B中說明了去除微生物或微生物固定物的評估方法。6.3在考慮可能出現(xiàn)的微生物種類的情況下，選擇培養(yǎng)基的條件。這種考慮的結(jié)果和決定的基本原理應(yīng)形成文件記錄。6.4選擇的技術(shù)應(yīng)符合條款7的規(guī)定。7技術(shù)的驗證7.1生物負荷評估的驗證的每個程序都應(yīng)形成文件。7.2驗證程序包括以下幾部分：a)如果去除產(chǎn)品中微生物是技術(shù)的一部分，應(yīng)包括這個技術(shù)有效性的評估；b)用于類據(jù)去除微生物的技術(shù)的有效性評估，包括微生物的計算技術(shù)和培養(yǎng)條件，以及；c)為計算校正因素所使用方法的提取率的建立。注11：附錄B說明了用于生物負荷評估技術(shù)的驗證方法。7.3在常規(guī)方法中的任何變化應(yīng)進行評估。這種評估包括：a)變化的評估；b)校正方法分提取率的建立。注12：此種變化的評估指出，之前的驗證和提取率仍然有效。7.4定期評審此驗證和任何之后的再驗證數(shù)據(jù)，并且確定再評審的范圍，且形成記錄文件。驗證和再驗證的程序應(yīng)當(dāng)記錄文件，并且保留再驗證的記錄。部門簽署。/驗證報告應(yīng)當(dāng)有制備、評審和接受該原始驗證報告的同一職務(wù)．8技術(shù)的運用8.1滅菌前的計算應(yīng)按照文件中的取樣計劃、規(guī)定的取樣頻率和取樣大小執(zhí)行。8.2如果在進行滅菌前計算時，隔離出一些不常遇見的污染物，應(yīng)當(dāng)記錄文件。污染物對生產(chǎn)過程的影響及其滅菌過程的有效性應(yīng)當(dāng)考慮并形成記錄文件。8.3對于滅菌前的計算或生物負荷評估可接受的限度，應(yīng)建立在之前的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上并形成文件。如果超過限度，那么應(yīng)按照ISO9001的規(guī)定，采取校正措施。注13：在應(yīng)用微生物學(xué)數(shù)據(jù)建立的輻射滅菌的滅菌劑量中（見ISO11737:1995中的附錄B和ISO13409），滅菌前的計算可用于選擇滅菌的驗證和劑量。8.6如果根據(jù)生物負荷評估來確定滅菌過程的處理范圍，則：a)如果超過可接受的限度，應(yīng)考慮滅菌保證的效果；b)不常見污染物的特征，包括污染物對滅菌過程的抗力的評估。因污染物對滅菌過程的強抗力而在產(chǎn)品上產(chǎn)生的后果，應(yīng)當(dāng)考慮滅菌保證的效果。所有這些考慮應(yīng)形成文件，包括確定校正行動。這些校正行動應(yīng)符合ISO9001的規(guī)定。8.7應(yīng)正式評審產(chǎn)品和/或處理的變更，以確定它們是否有可能導(dǎo)致生物負荷的變更（見8.3）。評審結(jié)果應(yīng)形成文件。如果生物負荷發(fā)生變化，就應(yīng)當(dāng)實施專門的生物負荷評估，以評價該變化的效果。附錄A(說明)產(chǎn)品中微生物數(shù)量的估計指南A.1引言本附錄包括執(zhí)行ISO11737在這部分中所規(guī)定要求的指南，其目的是為了人們更好地理解該要求。本指南沒有逐一解釋其中的每條內(nèi)容，但突出了需要注意的重點?？梢允褂帽靖戒浿袥]有提供的方法，但有明顯效果的修改方法必須符合ISO11737這部分的要求。本附錄不能用作評價是否符合ISO11737本部分要求的檢查表。A.2概述為使生物負荷評估獲得的數(shù)據(jù)是可靠的，可重視的，必須在控制條件下進行評估。無論是在醫(yī)療器械生產(chǎn)廠家，還是在邊遠地區(qū)采用的實驗室設(shè)備，都必須符合質(zhì)量體系的管理和操作。如果在醫(yī)療器械生產(chǎn)廠家的直屬實驗室中評估生物負荷，則該實驗室必須按照廠家的質(zhì)量體系操作。如果使用外部的實驗室，該實驗室最好要通過相應(yīng)的．ISO正式認證（如ISO/IEC指南25）。任何實驗室都應(yīng)提供質(zhì)量服務(wù)承諾，且這項承諾應(yīng)作為一項質(zhì)量政策形成文件。應(yīng)正式制定實驗室組織內(nèi)部的權(quán)力和職責(zé)并形成文件。任命負責(zé)建立實驗室質(zhì)量體系的專人，且其具有保證該體系實施的充分的權(quán)力。實驗室應(yīng)定期接受內(nèi)部審計。審計結(jié)果應(yīng)形成文件，供實驗室管理機構(gòu)評審。關(guān)于質(zhì)量體系的進一步信息可從ISO9004中獲得。ISO/IEC指南25概括了實驗室質(zhì)量體系要求。ISO13485和ISO13488提供了具體的醫(yī)療器械制造的質(zhì)量體系要求。A.3設(shè)備和材料A.3.1電子數(shù)據(jù)處理設(shè)備實驗室可采用計算機直接和間接采集、樹立和/或存貯數(shù)據(jù)。但必須對采用的硬件和軟件加以控制。應(yīng)鑒別所用計算機系統(tǒng)的硬件和軟件，對硬件和軟件進行的任何更改都應(yīng)形成文件，并得到相應(yīng)的批準。軟件應(yīng)編制如下文件：——計算機系統(tǒng)上運行的軟件；——操作軟件；——使用數(shù)據(jù)包。所有軟件在投入運行前，必須驗收（例如，參照ISO9000-3）如果購買了商用軟件包，這些軟件必須符合ISO9000-3規(guī)定的質(zhì)量體系編寫的。．如果計算機軟件是自身開發(fā)的，則應(yīng)制定適用的程序以保證：——保存開發(fā)文件，包括源代碼；——保存經(jīng)測試的記錄；——形成文件的程序修改；——交付使用前設(shè)備的變更應(yīng)形成文件并應(yīng)正式測試。這些控制措施適用于商用軟件包的任何修改或制定。應(yīng)建立檢測或阻止未經(jīng)授權(quán)的軟件程序變更的措施。組織、制表和管理統(tǒng)計數(shù)據(jù)或其他數(shù)學(xué)計算及處理或分析電子數(shù)據(jù)的軟件程序，應(yīng)允許從原始數(shù)據(jù)入口檢索。獲得計算機數(shù)據(jù)的專用程序，規(guī)定這些程序應(yīng)形成文件。A.3.2實驗室設(shè)備應(yīng)建立一套鑒別每種實驗室設(shè)備維護要求的體系。無需鑒別的設(shè)備應(yīng)明確標(biāo)明。任何在試驗期間接觸產(chǎn)品、洗滌液、培養(yǎng)基等的設(shè)備或零件，必須滅菌。A.3.3微生物培養(yǎng)基用于去除產(chǎn)品中微生物的所有微生物培養(yǎng)基和洗滌液，應(yīng)按照滅菌要求配置。應(yīng)建立支持微生物生長的微生物培養(yǎng)基的能力。通常采用的方法是，從每批培養(yǎng)基中選擇少量的微生物（在形成集群的10和100單位之間），對每批培養(yǎng)基進行促進生長試驗。促進生長試驗在藥典中有說明，其中詳細說明了適用的微生物。技術(shù)選擇A.4A.4.1概述微生物污染評估技術(shù)的主要程序如下：取樣采集測試產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到實驗室處理（按需）轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)和特征化（按需）數(shù)據(jù)解釋負責(zé)評估的人應(yīng)了解原料、成分、生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)過程、產(chǎn)品性質(zhì)，在上述各個階段選擇合適的方法。這部分引言所指出的，生物負荷評估可應(yīng)用于各類情況。負正如ISO11737應(yīng)考慮責(zé)人在確定取樣率、培養(yǎng)基范圍和培養(yǎng)條件及方法的制定和驗證過程中，以便對程序進行后續(xù)評具體的情況。將考慮因素以及采用決策的原理記錄文件，審。那么應(yīng)當(dāng)考慮包括包裝材如果生物負荷評估用于直接確立滅菌條件的范圍，料在內(nèi)的生物負荷評估的程序。當(dāng)生產(chǎn)的產(chǎn)品品種較多然而，理論上應(yīng)定期進行每種產(chǎn)品的生物負荷評估。而批量較小時，這種方法并非總是可行。在這種情況下，可按產(chǎn)品類型、生產(chǎn)環(huán)境、加工過程以及使用的原料，將產(chǎn)品分組歸類。產(chǎn)品分組的根據(jù)應(yīng)形成文件，并保證數(shù)據(jù)能代表該組中的所有產(chǎn)品。A.4.2生物負荷評估的要素概述A.4.2.1以避免有害污染和樣本中微生物數(shù)和性質(zhì)的重選擇采集和處理樣本的方法，大變化。抽樣體系必須連貫，以使一定時期內(nèi)的樣本具有可比性。漂洗或在洗滌液中溶解等手段從測試的產(chǎn)品或其中通常，微生物通過浸漬、洗滌液隨后可以通過置于培養(yǎng)基上的過濾膜具代表性的部分中轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上。（見大型的不可分離的產(chǎn)品可以通過表面取樣的方法測試或直接放在培養(yǎng)基上。．A.4.2.4.8,A.4.2.4.9,A.4.2.4.10）從產(chǎn)品中提取微生物時，可用在洗滌液中的表面活性劑，以及通過在洗滌液中產(chǎn)品受到的物理處理而獲得。常用洗滌液見A.4.2.5。A.4.2.2取樣A.4.2.2.1為滅菌前技術(shù)抽取產(chǎn)品有兩種可能：a)滅菌前隨機抽取產(chǎn)品；b)從不宜銷售產(chǎn)品的碎片或次品中抽取。抽樣取決于許多因素，但首要條件是樣本必須盡可能代表滅菌中的產(chǎn)品。如果決定選用次品，則抽取的產(chǎn)品必須經(jīng)過主要的生產(chǎn)階段，包括可能的凈化和包裝處理。按a)規(guī)定抽樣是比較合理的。在選擇用于不同目的的生物負荷評估時，可采用不同的方法，如驗證凈化和對生產(chǎn)過程的評估。A.4.2.2.2應(yīng)盡可能使用整個的產(chǎn)品進行生物負荷評估，雖然這種方法不一定可行，因為有些產(chǎn)品不能裝入實驗室的玻璃器皿內(nèi)。在后一種情況下，應(yīng)盡可能使用產(chǎn)品的大部分，而且使用產(chǎn)品的部分應(yīng)能估計整個產(chǎn)品的生物負荷。因此，當(dāng)產(chǎn)品過大時，如檢驗外科手術(shù)衣或外部引流配件，需謹慎選擇使用的產(chǎn)品部分。A.4.2.2.3在評估生物負荷而抽樣時，必須注意產(chǎn)品必須在標(biāo)準包裝內(nèi)。在抽取產(chǎn)品部分用于生物負荷評估時，操作應(yīng)小心。如果需要分割部分產(chǎn)品，應(yīng)當(dāng)在凈化條件下進行（如層流柜）內(nèi)進行，以免增加污染。A.4.2.3抽樣頻率應(yīng)根據(jù)以下各種因素確定生物負荷評估的頻率：之前的生物負荷評估數(shù)據(jù)；a)b)估計生物負荷評估的目的；c)所用的生產(chǎn)過程；d)批量大??；e)產(chǎn)品的生產(chǎn)頻率；f)使用的原料；g)生物負荷評估中的變化。抽樣頻率可以時間（如，每月）或產(chǎn)品產(chǎn)量（如交替的批量）為基礎(chǔ)確定。然而，為建立基準水平，通常的做法是在新產(chǎn)品投產(chǎn)初期按較高的頻率評估所剩無負荷。然后隨著對生物負荷的了解，逐漸降低頻率。生物負荷評估的頻率應(yīng)按照季節(jié)變化、生產(chǎn)過程變更或原料變更等因素的變化而變化。A.4.2.4處理A.4.2.4.1概述微生物對表面的粘附程度，取決于表面性質(zhì)、相關(guān)的微生物和其他材料（如潤滑劑）。污染源也影響粘附程度。為去除微生物，所采用的處理包括清洗于某些形式的物理力或直接的表面抽樣。表面活性劑能增強提取能力，但必須承認表面活性劑過高會抑制微生物（見A.4.2.5）.一些微生物會因某種特定材料形成生物薄膜，即微生物強烈地粘附在表面的基質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)。生物薄膜內(nèi)的微生物增加了滅菌過程的阻力。在醫(yī)療器械的生產(chǎn)過程中，一般不希望生物薄膜的形成，雖然在一定情況下可能會出現(xiàn)此種情況，例如來源于動物的某些原料。此類情況下，應(yīng)考慮形成生物薄膜的可能性，不能提供的處理方法能從生物薄膜中完全釋放出微生物。A.4.2.4.10至A.4.2.4.2認為如果在重復(fù)提取過程中，不斷記錄著高微生物數(shù)，則標(biāo)明驗證去除技術(shù)期間可能出現(xiàn)了生物薄膜。（見A.5.2.1.1）。生物負荷評估中采用的任何處理應(yīng)可以重復(fù)，并應(yīng)避免出現(xiàn)影響微生物存活能力的情況，如過度空蝕、剪切力、溫度的升高或滲透性沖擊。某些處理方法比其他方法較容易控制。在選擇一種方法和設(shè)計一種合適的變量組合時，應(yīng)考慮方法中的變量和控制變量的措施。例如，對于一種特定的方法，可以延長時間或變更機械的攪拌作用，以增強生物清除的能力。某些處理方法可能會在試驗條件下分解產(chǎn)品（如分解、消化、漩渦）。分解物質(zhì)的出現(xiàn)，增加了分類微生物的難度。對此，可采用其他的處理方法，如從洗滌液中分離出分解的物質(zhì)。必須保證獲得的計數(shù)具有代表性。應(yīng)盡可能快地將測試產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到實驗室。如果不得不延遲轉(zhuǎn)移，則應(yīng)選擇測試產(chǎn)品的儲存條件，以避免微生物的損失或微生物數(shù)量的改變。應(yīng)規(guī)定最大限度的儲存時間。脫水是導(dǎo)致微生物數(shù)量急劇減少的原因，必須在選擇儲存條件和儲存時間時加以考慮。A.4.2.4.2消化測試產(chǎn)品和已知的洗滌液是封閉在滅菌袋內(nèi)的。在滅菌袋上往復(fù)地攪，以迫使洗滌液通過該測試產(chǎn)品。這種方法特別適用于柔軟、纖維狀和/或吸收性材料，但不適用于有可能刺穿滅菌袋的材料，如帶針頭的裝置或超大測試產(chǎn)品。應(yīng)規(guī)定最大處理時間。由于采用的洗滌液量相對較大，因此獲得的懸置的微生物濃度較低。計數(shù)是。）A.4.2.6.3）或涂層法（見A.4.2.6.2可能采用其他方法，如過濾膜法（見．A.4.2.4.3超聲降解測試產(chǎn)品浸于已知容量的含有洗滌液的合適器皿內(nèi)。在超聲波浴中處理器皿和其中的溶液，或?qū)⒊暡ㄌ筋^浸于洗滌液中。確定超聲降解的標(biāo)稱頻率和處理時間。此外，還應(yīng)確定測試產(chǎn)品在超聲波浴中的位置。而且，還要限制同時處理的測試產(chǎn)品的數(shù)量，否則超聲降解的作用可能會被阻滯。這種方法特別適合于固體的不易滲透的產(chǎn)品和具有復(fù)雜形狀的產(chǎn)品。但可能損害某些醫(yī)療器械，特別是那些含有電子配件的產(chǎn)品，如永久性的心臟起博器。超聲降解的能量和處理時間不應(yīng)過大，否則會造成微生物的瓦解、死亡或者洗滌液過熱。A.4.2.4.3用或不用玻璃珠搖動測試產(chǎn)品浸于已知容量的含有洗滌液的合適器皿內(nèi)。并在機械搖動器（往復(fù)、環(huán)繞軌道或腕關(guān)節(jié)動作）上搖動，輔助清除微生物。也可手動搖動，但其效果取決于操作者。可增加規(guī)定尺寸的玻璃珠以增強表面摩擦，進而提高回收率。增加的玻璃珠的尺寸和搖動的時間、頻率，應(yīng)以不導(dǎo)致過熱和/或危及微生物為準。應(yīng)說明，添加的玻璃珠會增加微生物粘附的表面面積。應(yīng)規(guī)定搖動的時間和頻率。A.4.2.4.5旋渦混合測試產(chǎn)品浸于已知容量的洗滌液的封閉器皿內(nèi)。容器壓在旋渦混合器的轉(zhuǎn)動墊板上，使其產(chǎn)生旋渦。應(yīng)規(guī)定使用的容器、混合的時間和混合器的工作速度。產(chǎn)生的旋渦也取決于手工施加的壓力，也可能會有變化。這種方法簡便、快速，但僅適合于表面規(guī)則．的小件。A.4.2.4.6沖洗洗滌液通過測試產(chǎn)品的內(nèi)腔。液流受重力或者泵送的影響。也可以將產(chǎn)品充滿洗滌液，蓋嚴并攪動。應(yīng)規(guī)定器械與洗滌液的接觸時間、沖洗率和液體的流量。A.4.2.4.7混合（裂解）測試產(chǎn)品浸于已知容量的洗滌液的合適的器皿內(nèi)。按規(guī)定時間混合或分解測試產(chǎn)品，但時間不能過長，否則會導(dǎo)致洗滌液過熱而損壞微生物。這種方法是將測試產(chǎn)品分為足夠小的部分，以便能按相應(yīng)的方法統(tǒng)計微生物數(shù)。A.4.2.4.8擦拭擦拭是采用通常安裝在某種形式的棒或柄上的材料吸收。吸收材料可以是溶解性的，也可以是非溶解性的。通常的方法是用緩沖劑或液體介質(zhì)濕潤藥簽，并擦拭預(yù)先確定的取樣表面面積。有時先以濕潤的藥簽擦拭，然后再以干藥簽擦拭，以次提高吸收效率。然后放入緩沖溶液或液體介質(zhì)中，并攪動，使微生物從藥簽上脫落。另一種方法是采用可溶解的藥簽，使藥簽溶于緩沖溶液或液體介質(zhì)中。通過過濾、平板計數(shù)或其他適當(dāng)手段分析獲得的懸置物。擦拭是抽取不規(guī)則形狀或不可接近區(qū)域抽樣有用的方法。也適用于在大面積取樣。由于擦拭方法難以操作，因此這種方法特別容易出現(xiàn)誤差。此外，藥簽不見得能采集到樣本上的所有微生物。還有一部分微生物會留在藥簽的孔隙中，檢測不到。．藥簽上不應(yīng)有殺滅微生物和微生物的固定劑。A.4.2.4.9瓊脂涂層在產(chǎn)品表面涂上（在45℃最高溫度下）熔化的瓊脂培養(yǎng)基并進行培養(yǎng)，以產(chǎn)生可見的集群。適用于生物負荷較低和產(chǎn)品結(jié)構(gòu)合適時。在產(chǎn)品表面的細胞群體、瓊脂界面散步的集群、瓊脂的干燥和厭氧，都屬于不利因素。A.4.2.4.10接觸板電鍍接觸板或墊板通過固化培養(yǎng)基的手段涂敷在介質(zhì)表面，而可存活的微生物會粘附于培養(yǎng)基的表面。然后，接觸或墊板能產(chǎn)生出能計數(shù)的集群。這種方法具有易于使用的優(yōu)點。結(jié)果與固化培養(yǎng)基的接觸面積直接相關(guān)。由于一般使用效果較低，因此僅在其他方法不適用時使用此方法。接觸板和墊板通常只用于平面或者至少是規(guī)則表面。A.4.2.5洗滌液、稀釋劑和傳播介質(zhì)在生物負荷評估期間，洗滌液可用于從產(chǎn)品上去除微生物。傳播介質(zhì)可用于去除微生物進行計數(shù)，而稀釋劑則用于獲得含有可計數(shù)微生物的懸浮液。洗滌液和稀釋劑的性質(zhì)對所用方法的總體效率的影響很大。在選擇洗滌液和稀釋劑時，應(yīng)考慮它的成分（如成分、濃度、滲透性和PH值）。成分應(yīng)保證不出現(xiàn)微生物的增值或鈍化。當(dāng)采用液體從固體表面去除微生物時，應(yīng)考慮采用表面活性劑。表A.1常用的洗滌液和稀釋劑溶液在水中的濃度應(yīng)用林嘉氏溶液一般1/4濃度％～蛋白凍液1.0％一般0.1一般0.067M磷酸鹽緩沖蛋白凍液0.43％氯化鈉％蛋白凍0.1一般緩沖的磷酸鹽水0.02M磷酸鹽％氯化鈉0.9％～0.25氯化鈉0.9％一般海藻酸鈣溶液擦洗六偏磷酸納林嘉氏溶液1/4濃度濃度硫代硫酸鹽林嘉氏溶液1/4殘余氯的中和水樣本的稀釋；在計數(shù)前可溶水解材料等的滲溶液的制備）能加入90注：此清單并不包含所有的情況。表面活性劑如聚山梨酸酯（吐溫R％之間。由％和洗滌液和稀釋劑中。根據(jù)特定的要求，一般所用濃度在0.010.1仔細地選擇合適的表面活性劑的濃于會產(chǎn)生起跑現(xiàn)象，應(yīng)根據(jù)特殊的加工要求，度。A.4.2.6轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基A.4.2.6.1概述加工過程在洗滌液中會產(chǎn)生一種微生物懸浮物，這種洗滌液可同A4.2.6.2到A.2.6.7中介紹的方法之一測試存活微生物。在轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基之前，應(yīng)進行額外的但必須的加工來分裂微生物凝聚體，以降低變異。在某些情況下，用于去除微生物的方法也會分裂凝聚體，但在一些情況下，分離加工還是必要的。如果在洗滌液中存在殺滅微生物或微生物靜力的物質(zhì)，可以通過稀釋降低到無效的程度，也可以通過過濾或鈍化的方法去除。這些殺滅微生物或微生物靜力的物質(zhì)會影響計數(shù)方法的選擇。在采用集群計數(shù)的計數(shù)方法時，應(yīng)考慮在孵化中產(chǎn)生的集群數(shù)的上限。這種上限是變化的，每一個可存活的微生物以一種可見的集群方式出現(xiàn)，而不受周圍的集群的不利影響。此外，纖維也會影響離散集群的形成，從而造成計數(shù)的困難。A.4.2.6.2過濾器膜一般來說，通過利用適合生長的培養(yǎng)基對可見的集群進行過濾器的孵化，是評估污染物的有效手段。合適的孔隙大小的過濾器能去除洗滌液中的微生物?？紫洞笮?.45um的過濾器通常用于集群產(chǎn)品。孵化時，過濾器膜一般放置于瓊脂的表面或浸在營養(yǎng)液中的可吸收墊板上。可對過濾膜表面產(chǎn)生的集群進行計算，并分離出他們的特性。過濾膜特別適用于低濃度的微生物懸浮液。由于從洗滌液當(dāng)液體的底部包含可能有殺滅微生物或微生物靜力的物質(zhì)時，中去除了微生物或在孵化前通過過濾膜清洗了微生物，過濾將非常有效。然而，有些種類的膜會吸收或釋放抑制微生物生長的物質(zhì)，所以應(yīng)注意使用適合微生物計數(shù)的過濾器膜。過濾器膜和洗滌液應(yīng)相容。通常需要真空源，有些情況下可使用壓力源。為了避免引起過濾器膜的變形或損害的可能性，應(yīng)小心操作。注14：洗滌液中如含有纖維產(chǎn)品的剩余物，則操作較復(fù)雜。因為過濾器膜會堵塞。A.4.2.6.3灌注板培養(yǎng)通過灌注板的技術(shù)，懸浮物與熔化的瓊脂混合在一起，在不超過45℃的情況下，允許凝固在灌注板上，如皮氏培養(yǎng)皿。應(yīng)培養(yǎng)灌注板，并計算集群。灌注板不能從洗滌液中分離微生物，如果存在殺滅微生物或微生物靜力的物質(zhì)，可應(yīng)用A.4.2.6.1中的相關(guān)資料。A.4.2.6.4鋪展板通過使用鋪展板技術(shù)，懸浮物的部分可使用鋪展器，在固體表面鋪展開。懸浮物的部分應(yīng)在介質(zhì)表面鋪展開后被吸收，使得離散的集群得以發(fā)展。吸收的需要，確定了該部分的容積，可用鋪展板來測量。如果存在殺滅微生物或微生物靜力的物質(zhì)，可應(yīng)用A.4.2.6.1中的相關(guān)資料。A.4.2.6.5適合連續(xù)稀釋法的最大可能數(shù)（MPN）當(dāng)有足夠量的洗滌液時，稀釋液可接種入營養(yǎng)介質(zhì)，接種的介質(zhì)在之后的孵化中不會產(chǎn)生可見的生長。稀釋液量的數(shù)據(jù)評估能估計最初微生物的數(shù)量。例子Deman中的表格說明了使用正確數(shù)據(jù)評估的計算方法，使得能直接估算）14（出微生物的最大可能數(shù)。．最大可能數(shù)方法易于操作，但可能培養(yǎng)條件的范圍受到限制。這種方法的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)使得它比準確計算更適合于一般的評估。如果存在殺滅微生物或微生物靜力的物質(zhì)，可應(yīng)用A.4.2.6.1中的相關(guān)資料。A.4.2.6.6螺旋板培養(yǎng)微生物的懸浮部分能用自動器械在固體表面鋪展開來。懸浮物以遞減率，螺旋軌跡從培養(yǎng)板的中央向邊緣擴展。經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆趸螅褂锰囟ǖ挠嬎愀窕蛴嬎慵夹g(shù)，在最初的懸浮物中計算組織。整個板或某一部分的計數(shù)都是計算的基礎(chǔ)。如果存在殺滅微生物或微生物靜力的物質(zhì)，可應(yīng)用A.4.2.6.1中的相關(guān)資料。螺旋板培養(yǎng)計數(shù)能得出可再生的結(jié)果，這個結(jié)果與傳統(tǒng)的系列稀釋技術(shù)和表面擴展技術(shù)緊密關(guān)聯(lián)。通過儀器的設(shè)計和毛細管、小量管的使用，螺旋板能使接種的懸浮物質(zhì)化，不生成物質(zhì)的凝聚。A.4.2.6.7固體物質(zhì)的“最大可能數(shù)”方法最大可能數(shù)方法一般運用于小的離散的物質(zhì)。每個物質(zhì)中的生物負荷應(yīng)很少，且生物負荷的分布應(yīng)很均衡，因而物質(zhì)中一部分能直接進入培養(yǎng)介質(zhì)，并不再孵化時生長。A.2.6.5中具體評估了結(jié)果。對于有些產(chǎn)品，可以適合引入一種以上的物質(zhì)進入生產(chǎn)介質(zhì)的每個部分。如果存在殺滅微生物或微生物靜力的物質(zhì)，可應(yīng)用A.4.2.6.1中的相關(guān)資料。A.4.2.7檢測微生物的其他方法除了集群計算可用于評估生物負荷外，還有其他方法。包括：新陳代謝活動的評估（如：布內(nèi)測量或顯微鏡）。因其意義與之前定義的存活微生物的數(shù)量這些技術(shù)的因而這些方法都是間接方法。必須用集群計算的方法來校準，相關(guān)，局限性在于洗滌液樣本中懸浮微生物的數(shù)量要求相對較大。一般來說，測試出的數(shù)量下限應(yīng)超過100個集群單位。A.4.3培養(yǎng)基和孵化條件的選擇選擇培養(yǎng)基和孵化條件時，應(yīng)考慮以下：a)培養(yǎng)基和孵化條件的單獨組合不能使微生物生長。有些組合比其他結(jié)果更具代表性。b)驗證測試，應(yīng)比常規(guī)測試要求更廣范圍的培養(yǎng)基和孵化條件。c)在選擇性的培養(yǎng)基中直接培養(yǎng)，不容許在生理上被壓制或損害微生物的生長。d)培養(yǎng)條件的選擇應(yīng)根據(jù)被測試產(chǎn)品的理解而選擇，比如微生物的污染源和微生物的屬性。培養(yǎng)基和孵化條件見表A.2。酵母和霉菌應(yīng)按表A.2中引用的低溫在合適的培養(yǎng)基的需氧菌板上放置三至七天再孵化。此種方法需仔細評估。需要注意的是，所有選擇性厭氧培養(yǎng)方法允許兼容性的厭氧微生物的生長。表A.2——培養(yǎng)基和孵化條件的例子微生物種類固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)培養(yǎng)基孵化條件非選擇的需氧菌（大豆酪蛋白消化瓊（大豆酪蛋白消化瓊30℃～35℃脂）脂）天5～2胰蛋白胨大豆瓊脂胰蛋白胨大豆瓊脂營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)血液瓊脂．葡萄糖胰蛋白胨瓊脂酵母和霉菌Sabouraud葡萄糖瓊Sabouraud葡萄糖瓊20℃～25℃脂脂5～7天麥芽萃取瓊脂麥芽萃取瓊脂（大豆酪蛋白消化瓊二碘曙紅氯霉素瓊脂脂）（大豆酪蛋白消化瓊胰蛋白胨大豆瓊脂脂）胰蛋白胨大豆瓊脂厭氧菌強化的梭狀芽苞菌瓊Robertson烹調(diào)肉溶30℃～35℃脂液天5～3液體硫經(jīng)乙酸鹽溶液Sabouraud瓊脂預(yù)減的血液瓊脂難培養(yǎng)的厭氧菌瓊脂注：這張表不能窮盡1）列出的孵化條件一般使用于列出的微生物。2）在厭氧菌的條件下培養(yǎng)。A.5生物負荷技術(shù)的驗證A.5.1概述生物負荷評估方法的最終確認應(yīng)考慮存在于產(chǎn)品的微植物群。為了使生物ISO11737負荷評估更加可信，要求確認所有用于驗證的技術(shù)和回收效率。去除微生物技術(shù)的驗證A.5.2A.5.2.1方法從醫(yī)療器械中去除微生物的有效性驗證有兩種方法：a)樣本產(chǎn)品的重復(fù)處理；b)已知微生物等級的生物接種。第一種方法的優(yōu)勢在于使用自然發(fā)生的微生物污染物，但它需要相對高的初始生物負荷。后一種方法是建立了一種模式系統(tǒng)用于測試目的，但它的問題是關(guān)于在自然情況下的應(yīng)用。這種方法一般用于低級別的自然污染物。A.5.2.1.1重復(fù)提取法這種方法的原則是必須不斷重復(fù)生物負荷評估方法，直至被提取的微生物累計數(shù)沒有明顯的增加為止。在每次提取后，都應(yīng)從產(chǎn)品或產(chǎn)品的一部分中提取、列舉洗滌液。最后對連續(xù)提取的結(jié)果進行比較。應(yīng)當(dāng)注意：這種方法不一定準確。因為并不能證明從微生物的提取數(shù)和在產(chǎn)品中的微生物數(shù)之間的精確關(guān)系。A.5.2.1.2產(chǎn)品接種法人工的生物負荷能夠通過在產(chǎn)品上所選擇微生物的已知數(shù)目的接種而創(chuàng)造，以便計算提取效率。這些微生物可以是營養(yǎng)細胞或孢子。最普遍的是使用需氧菌的孢子。營養(yǎng)微生物很難實際操作，因為它們在干燥時會失去生存能力。用于驗證研究的微生物應(yīng)選擇自然發(fā)生的生物負荷。選擇的微生物應(yīng)有代表性：a)霉菌；b)適常溫的營養(yǎng)微生物（革蘭氏染色陽性和/或革蘭氏染色陰性）；c)由孢子組成的革蘭氏染色陽性孢子。使用用于驗證試驗的具代表性的厭氧菌孢子組成物，在實際操作上會有難度?？纱婊钣嬎阍诮臃N時得到驗證。在接種體干燥后，如果適合特定的產(chǎn)品，那么應(yīng)選擇從特定產(chǎn)品中去除微生物的方法。最初接種物的提取的滴定量比率建立于特定的方法和產(chǎn)品的提取效率。微生物接種的限制有：如沉積物、懸置物的粘附力，接種物結(jié)塊和接種物水平的變化，并在產(chǎn)品接種時應(yīng)考慮這些限制條件。產(chǎn)品的接種造成的吸收材料，可通過侵入進入到選擇的微生物中。此程序能使微生物在產(chǎn)品上均勻分布。A.5.2.2洗滌液洗滌液既不促進也不阻礙從產(chǎn)品中提取的微生物的生長。為了確定洗滌液的效果，已知的少量的微生物接種入產(chǎn)品中，并且留在洗滌液中一段較長的時間。生物負荷評估方法的使用是為了證明洗滌液可能的阻礙和促進效果A.5.2.3物理力可使用物理力從產(chǎn)品中去除微生物（見A.4.2.4）。應(yīng)評估生物負荷評估中物理力的效果。已知的少量產(chǎn)品（約100cfu）可使用物理力。微生物的計數(shù)給物理力的效果提供了測量方法。在測試中應(yīng)當(dāng)考慮，在產(chǎn)品去除微生物后，剩余的微生物會受到洗滌液的影響。A.5.3計數(shù)方法的確認A.5.3.1計數(shù)方法的確認應(yīng)考慮：a)涉及的微生物；b)預(yù)測的微生物污染物的個數(shù)，應(yīng)考慮到洗滌液的濃縮和稀釋；使用新陳代謝活動預(yù)測數(shù)量的可能性；c)A.5.3.2生物負荷評估的驗證的依據(jù)：a)用來支持生長的培養(yǎng)基的能力（確保微生物的提取包括生物負荷）；b)在已選培養(yǎng)基的條件下，選擇的溫度、孵化的時間。A.6技術(shù)的運用A.6.1概述通過滅菌過程，生物負荷評估可以用于建立處理范圍，，因而正確的評估很重要。在常規(guī)的控制生產(chǎn)過程中，應(yīng)采取正確的方法評估生物負荷，在達到一定等級以前就檢測出生物負荷評估的變化，否則滅菌過程的有效性就會受到影響。在了解生物負荷評估的知識后，確認已建立的滅菌過程的準確性時，準確的評估很重要。在最初驗證期間的生物負荷評估，為評估變化提供了基礎(chǔ)，為探測不利的變化或為確定生產(chǎn)過程或生產(chǎn)環(huán)境的變化提供了基礎(chǔ)。過程控制的限制和趨勢的分析都是測試生物負荷變化的敏銳方法。A.6.2過程控制的限度設(shè)置在過程控制時，對于生物負荷評估的限度選擇是建立在歷史的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上的。分析數(shù)據(jù)得出：他們是否是否適合于已確認的數(shù)學(xué)分布（如：正常、泊松、二項）。有經(jīng)驗的統(tǒng)計師可指導(dǎo)數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)化（如：提供取對數(shù)、根或整數(shù)的方法）來適合已確認的數(shù)學(xué)分布。如果這些能完成，就能計算出可信的評估限度。但是，如果轉(zhuǎn)化為已確認的數(shù)學(xué)分布過程不充分，就無法確認是否適合。如果不適合已確認的分布，最簡單和最適當(dāng)?shù)耐ǔＷ龇ㄊ菣z查歷史數(shù)據(jù)，并以下的等級。應(yīng)采取定期評審，要求％）99％或90％以下（也可選擇95找出在．見ISO11737中。A.6.3過程監(jiān)控的趨勢分析趨勢分析的目的是檢查過程的變化，即使評估是在已建立的限度下。通過檢測數(shù)據(jù)偏離一般分布的程度可得出分析的結(jié)果?？蓱?yīng)用數(shù)據(jù)過程控制的標(biāo)準原理。[如：CUSUM（累計總數(shù)的[15][17][18][21][20]分析方法）]偶然的偏差或已知的循環(huán)波動（例如季節(jié)變化）會產(chǎn)生逐漸的向上偏移，但這種偏移可能探測不到。如果合適的話，更適合于使用滾動的平均值。通常情況下，微生物的數(shù)據(jù)在一段時間內(nèi)會達到一個令人滿意的程度，然后有一個清晰的顛峰，但通常是一個很短的過程。應(yīng)監(jiān)控這些顛峰發(fā)生的頻率是否有變化，以確保調(diào)查研究。附錄B（說明）微生物技術(shù)驗證方法的指南B.1引言這些方法不同于那些在這里此附錄說明了可用于生物負荷評估的驗證方法。．可以使用的方法。經(jīng)過合適培訓(xùn)后的合格人員可應(yīng)用這些方法，特別是產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)情況，生物負荷評估中污染物的情況都應(yīng)考慮B.2從產(chǎn)品中去除微生物方法的驗證注15：附錄中說明了兩種從產(chǎn)品中去除微生物的驗證方法（見A.5.2），B.2.1說明了一個重復(fù)處理的方法（見A.5.2），B.2.2說明了用于已接種產(chǎn)品的方法（見A.5.2.1.2）。B.2.1使用重復(fù)處理的驗證注16：此方法適用于產(chǎn)品上有生物負荷的存在時使用。有時這種方法可稱為“徹底的提取”。B.2.1.1在開始確認去除微生物技術(shù)的過程之前，應(yīng)將這種方法定義和形成文件（歸檔）。注17：一旦驗證過程開始，此技術(shù)就不能再修改。因此，在定義該技術(shù)之前，有必要進行一些準備試驗以確認和優(yōu)化這種技術(shù)。B.2.1.2應(yīng)選擇一系列產(chǎn)品或部分產(chǎn)品來測試提取效率。每一個產(chǎn)品應(yīng)對應(yīng)一種技術(shù)（見B.2.1.1）。這種技術(shù)用于評估產(chǎn)品中微生物的個數(shù)。評估產(chǎn)品后，該技術(shù)可再次應(yīng)用于同一產(chǎn)品以確認是否需進一步去除微生物。應(yīng)用這種技術(shù)于同樣的產(chǎn)品，可重復(fù)使用多次。注18：重復(fù)的次數(shù)由一系列因素決定，包括產(chǎn)品的性質(zhì)、生物負荷中含有的微生物以及初始污染程度（見B.2.1.1）。預(yù)備的實驗可用于決定重復(fù)的次數(shù)。B.2.1.3對于某些產(chǎn)品，應(yīng)考慮如果經(jīng)過重復(fù)處理，產(chǎn)品上是否仍然存在可存活微生物?？赏ㄟ^以下任何一種方法：a)在產(chǎn)品表面涂上溶化的培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基凝固，然后把產(chǎn)品置于特定的培養(yǎng)條件下（見A.4.2.4.9），應(yīng)計算孵化上建立的集群。b)將產(chǎn)品浸入液態(tài)的培養(yǎng)基中，放置于特定的培養(yǎng)條件下，測試生長情況。如果在浸入一段時間后，部分產(chǎn)品顯示出可存活微生物，就可以使用最大可能數(shù)方法的計算（見A.2.6.7）。如果所有的結(jié)果都顯示生長，那么就不能使用最大可能數(shù)方法，應(yīng)重新考慮確認的方法。B.2.1.4在去除技術(shù)的最初使用后，集群的個數(shù)可以集群總數(shù)的一部分來表示（見B.2.1.2）。注19：集群總數(shù)的一部分可對每個產(chǎn)品進行計算，并建立提取效率。B.5.2.1.1就提供了一種可行的例子。B.2.2使用已接種產(chǎn)品的驗證B.2.2.1在開始確認去除微生物技術(shù)的過程之前，應(yīng)將這種方法定義和形成文件（歸檔）。注20：一旦驗證過程開始，此技術(shù)就不能再修改。因此，在定義該技術(shù)之前，有必要進行一些準備試驗以確認和優(yōu)化這種技術(shù)。B.2.2.2應(yīng)準備好微生物的懸置和已接種的產(chǎn)品，并確定其存活數(shù)量。注21：用于產(chǎn)品接種的微生物的選擇已在A.5.2.1.2中說明。選擇用于接種的微生物有防干燥能力，并且通常使用需氧菌的孢子。芽孢桿菌－尼日爾變種孢子，由于他們的可利用性已便于找到，芽孢桿菌的水懸置適用ISO11138-2。B.2.2.3應(yīng)準備懸浮物的適當(dāng)稀釋，并確定稀釋液中的可存活數(shù)。接種物應(yīng)和產(chǎn)品上的自然污染物有著相同的振幅。對于低生物負荷的產(chǎn)品，合適濃度的懸浮個可存活微生物比較合適。100物放置注22：有必要在進行合適的稀釋以前，進行準備的試驗（見B.2.2.1）。B.2.2.4確定提取效率前，可選擇一些滅菌產(chǎn)品或產(chǎn)品的一部分。每個產(chǎn)品接種一定量的微生物懸浮液（見B.2.2.3）。對于特定的產(chǎn)品，可允許在層流的氣流條件下干燥。注23：對產(chǎn)品進行環(huán)氧乙烷滅菌后，產(chǎn)品應(yīng)充分通風(fēng)以降低任何殘余物的影響。任何從產(chǎn)品中洗滌出的抑制效果應(yīng)在事前的試驗中調(diào)查（見B.2.2.1和B.4）懸浮物應(yīng)在產(chǎn)品上分布，最難去除部分產(chǎn)品中的自然污染物。B.2.2.5根據(jù)規(guī)定的技術(shù)（見B.2.2），可得出從產(chǎn)品中去除接種的微生物的個數(shù)。B.2.2.6去除的微生物的數(shù)目是接種入產(chǎn)品的部分數(shù)目。這部分可以通過每個產(chǎn)品來計算（見B.2.2.4），并可以用于確定提取效率。B.5提供了一個可行的例子。B.3培養(yǎng)條件的評估用于生物負荷評估的培養(yǎng)條件，即培養(yǎng)基和孵化條件，并不能測試出所有潛在的污染物。在實際操作中，生物負荷評估是不可避免的。雖然如此，我們?nèi)詰?yīng)確定合適的培養(yǎng)條件。ISO11737中的7.3的部分要求在技術(shù)評估時確定培養(yǎng)的條件。評估培養(yǎng)條件的方法包括：根據(jù)生產(chǎn)過程、環(huán)境、物質(zhì)選擇培養(yǎng)條件，然后比較在這些培養(yǎng)條件下的微生物計數(shù)和通過培養(yǎng)基和孵化條件綜合選擇探測出的微生物。那么建議重新考慮這個培如果這種方法顯示只存在很少的一部分生物負荷，養(yǎng)條件，從而優(yōu)化獲得的計算結(jié)果。B.4對于釋放影響生物負荷不利物質(zhì)的篩選篩選的目的是調(diào)查從產(chǎn)品中釋放出來進入懸浮液的可能影響微生物的物質(zhì)。它與ISO11737中的6.2一致，是評估技術(shù)的方法。也可參考A.4.2.6.1。B.4.1應(yīng)選擇滅菌的產(chǎn)品，每個產(chǎn)品都應(yīng)使用去除微生物的常用方法。如果去除的技術(shù)中包括一種洗滌液，那么應(yīng)使用B.4.2中的程序；如果產(chǎn)品直接進入培養(yǎng)基，那么使用B.4.3比較合適。B.4.2如果去除的技術(shù)中包括洗滌液（見A.4.2.5），那么一定數(shù)量的易碎的微生物就會進入洗滌液。這些微生物的數(shù)量大約為100。抑菌作用的測試一般見于藥典。注25：藥典中詳述了可使用的微生物，或選擇諸如假單細胞熒光也是適合的。生成的懸浮液應(yīng)放置一段時間，至少等于生物負荷評估的最大允許時間，并計算出可存活微生物。B.4.3如果產(chǎn)品是直接被引入提取的培養(yǎng)基（如:最大可能數(shù)的評估中，見A.4.2.6.7），可使用在藥典中說明的抑菌作用的測試。在此測試中，產(chǎn)品是以指定的時間引入培養(yǎng)基孵化。很少的微生物（見B.4.2）隨后被引入培養(yǎng)基，連續(xù)孵化。在指定時間之后，將觀察培養(yǎng)基可見的生長。B.4.4如果接種的微生物個數(shù)不同于B.4.2中得出的結(jié)論，或者在B.4.3中沒有觀察到微生物的生長，那么應(yīng)重新考慮生物負荷評估的方法?？赡苡斜匾M中和或過濾的方法以去除抑制作用的物質(zhì)。B.5校正因素的取樣計算B.5.1引言下面兩個例子將說明校正因素的計算方法。在進行確認測試時，得出的數(shù)值并不一定等同于引用的數(shù)值。B.5.2.1去除技術(shù)的驗證B.5.2.1重復(fù)處理B.5.2.1.1在這個例子中，將確認重復(fù)處理得出的較為理想的數(shù)據(jù)列于表B.1。這些數(shù)據(jù)代表了醫(yī)療器械的五個復(fù)制。表B1用于醫(yī)療器械復(fù)制的重復(fù)處理得出的集群計算復(fù)制計算處理平均集群數(shù)5213456150556070456.4210531230.63210000.44100105.6251027瓊脂覆蓋696151816884總集群計算B.5.2.1.2從表B1中的數(shù)據(jù)可以看出，去除比率計算如下：第一次處理6050705545總計8168846151去除％7474839088％90％－74范圍＝％81.8平均提?。阶?6：在計算中包括瓊脂覆蓋得到的理想化數(shù)據(jù)。某些醫(yī)療器械的使用可能會排斥瓊脂覆蓋的使用（見B.2.1.3a）B.5.2.1.3使用去除的平均百分比，提取效率的校正因素為：100/81.8=1.22注27：在某些情況下，可以使用去除物的百分比的最低值