動物繁殖學(xué)-華中農(nóng)業(yè)大學(xué)第20講課件

第八節(jié)胚胎嵌合第九節(jié)免疫去勢第十節(jié)激素免疫與基因免疫

第十章

2022/10/151華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院第八節(jié)嵌合體chimera2022/10/152華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院一、chimera概念

在生物學(xué)上系指同一個體中，基因型相異的細(xì)胞或組織混合存在的狀態(tài)把兩枚胚胎（同種或異種動物胚胎）的細(xì)胞嵌合，共同發(fā)育成為一個胚胎，稱為嵌合胚胎再將該胚胎移植給受體，妊娠產(chǎn)仔，如該仔畜具有以上兩種動物胚胎的細(xì)胞，則稱之為嵌合體動物

2022/10/153華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院人類中嵌合體非常普遍。在胎兒發(fā)育過程中，母體和胎兒也會發(fā)生細(xì)胞交流，如果一位母親生育了一個以上的孩子，那么，長子的細(xì)胞可能就會進(jìn)入次子的體內(nèi)，這些母親、子女都是嵌合體（許多人體內(nèi)都攜帶著他們的母親及同胞的某些細(xì)胞，多數(shù)母親體內(nèi)也攜帶著她們生下的子女的某些細(xì)胞——女性體內(nèi)即有從她們母親也有從她們孩子而來的細(xì)胞）孿生子在同一個子宮中發(fā)育特別是當(dāng)他們共享一個胎盤時會發(fā)生細(xì)胞交流，大多數(shù)孿生子體內(nèi)都攜帶著某些來自其同胞的細(xì)胞，是自然形成的嵌合體。隨著輸血及試管嬰兒的普及，許多人體內(nèi)都含有少量異體細(xì)胞，可謂輕度嵌合體。那些接受器官移植的人（如在心瓣手術(shù)中植入豬、牛細(xì)胞），可視為在制造人獸嵌合體。我們中的大多數(shù)不是由單一遺傳細(xì)胞系所組成的純血個體，我們的身體是細(xì)胞混血的，含有大量從我們母親甚至從我們的祖父母或同胞而來的大量細(xì)胞。2022/10/154華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院同一種類的黑鼠和白鼠胚胎嵌合，可生下黑白相間的花小鼠；不同種類的綿羊和山羊胚胎細(xì)胞嵌合，可生下綿山羊，它既有綿羊的特征，又有山羊的特征科研人員已經(jīng)嵌合成功的嵌合體動物有小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬和牛等；種間嵌合體動物有大鼠－小鼠嵌合體、綿羊－山羊嵌合體、馬－斑馬嵌合體、黃牛－水牛嵌合體等。2008年，英國人工授精與胚胎學(xué)管理局正式批準(zhǔn)兩個研究小組培育用于研究的人獸混合胚胎2022/10/155華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院猴鼠嵌合體（2006.6）昆明小鼠和BALB/C兩種小鼠通過激素注射人工排卵，然后將雌鼠和雄鼠合籠，讓雌鼠受精后，3—5天取出胚胎（囊胚期），在顯微鏡下看到的是由受精卵分裂出來的數(shù)十個細(xì)胞。恒河猴表皮干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。研究人員將恒河猴麻醉后，在其胸背取下一塊1平方厘米的皮膚，體外培養(yǎng)將恒河猴表皮干細(xì)胞注入小鼠囊胚腔內(nèi)，再移植到另一只代孕的母老鼠體內(nèi)，讓其生下幼鼠2022/10/157華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院世界首只人獸混種羊誕生為人提供器官美國內(nèi)華達(dá)大學(xué)教授伊斯梅爾·贊賈尼歷經(jīng)7年研究，最終利用向綿羊胚胎注射人體干細(xì)胞的技術(shù)，成功培育出一只含有15％人體細(xì)胞的綿羊。最終目的，是要在綿羊身上培育出可向人體移植的器官。2022/10/158華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院美國塔夫特大學(xué)的CharlotteKuperwasser創(chuàng)造了具有人類乳腺組織的小鼠，建立了研究人類乳腺癌癥的動物模型。耶魯大學(xué)的EugeneRedmond將人類神經(jīng)祖細(xì)胞注射入猴腦旨在探索治療帕金森病。

2022/10/1510華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院二、意義研究發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生理學(xué)和遺傳學(xué)研究治療遺傳病、疾病動物模型經(jīng)濟價值：不同花色科間嵌合體、毛皮動物嵌合體、生產(chǎn)移植器官、轉(zhuǎn)基因動物2022/10/1511華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院三、制作方法

1、聚合法將去除透明帶的兩枚8細(xì)胞至桑椹期胚胎，或來自兩個不同胚胎的卵裂球，或卵裂球與胚胎聚合在一起的方法裸胚聚合卵裂球聚合卵裂球與胚胎聚合2022/10/1512華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院六、應(yīng)用前景1、在發(fā)育及細(xì)胞生物學(xué)方面研究胚胎分化規(guī)律研究性分化機理孤雌生殖2、在免疫學(xué)與醫(yī)學(xué)方面用于免疫功能的分析建立遺傳病動物模型2022/10/1514華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院3、在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用人工制造有特殊經(jīng)濟價值的個體對水貂、狐貍、絨鼠等毛皮動物，利用胚胎嵌合體技術(shù)可以獲得用交配或雜交法不能獲得的毛皮花色類型種間移植用于分析胎兒與母體的相互關(guān)系，如將斑馬的受精卵，移植到馬體以生產(chǎn)斑馬可作為外源基因的導(dǎo)入方法把外源目的基因先導(dǎo)入干細(xì)胞，再通過胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法將目的基因轉(zhuǎn)入胚胎，這是轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)中基因?qū)氲囊环N重要手段六、應(yīng)用前景2022/10/1515華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院一、概念傳統(tǒng)的去勢概念，是指通過手術(shù)摘除或破壞動物的性腺、使其喪失繁殖機能現(xiàn)代的去勢概念，是通過抑制或消除性活動，以促進(jìn)動物生長和管理，改善畜產(chǎn)品質(zhì)量2022/10/1517華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院

通過激素免疫產(chǎn)生激素抗體，主動或被動地中和動物體內(nèi)相應(yīng)的激素，使該激素的生物活性全部或部分喪失，引起動物體內(nèi)內(nèi)分泌平衡的變化，達(dá)到去勢的目的免疫去勢2022/10/1518華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院二、用途

在性成熟前就已上市的動物，不去勢反而可以促進(jìn)生長，并提高瘦肉率；但對于性成熟后才上市的動物以及下列情況下需要進(jìn)行去勢：1、選育優(yōu)良品種，淘汰不良種畜2、使性情兇猛的動物變得溫順，便于飼養(yǎng)管理或使役2022/10/1519華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院3、提高肉用動物的利用價值，如：去勢的家畜體脂積累加速，肉質(zhì)變得柔嫩；公豬、公羊去勢后能消除肉中的膻味4、治療某些嚴(yán)重的性腺疾病，如睪丸炎、睪丸損傷、睪丸或卵巢腫瘤等5、避免伴侶動物因求偶、生育帶來的麻煩二、用途2022/10/1520華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院三、研究概況

1．垂體GTH免疫2．胎盤GTH免疫3．GnRH免疫2022/10/1521華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院四、原理

GnRH與適當(dāng)?shù)拇蠓肿虞d體物質(zhì)偶聯(lián)后免疫動→誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗GnRH的抗體→與內(nèi)源性GnRH形成的抗原抗體復(fù)合物可使大部分具有活性的該種激素分子失活→減少了對垂體靶細(xì)胞作用的程度→特異性引起LH、FSH等激素釋放水平降低→動物性腺發(fā)生退行性變化、甾體激素的合成與分泌降低、破壞下丘腦-垂體-性腺軸之間的正常反饋調(diào)節(jié)關(guān)系2022/10/1522華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院六、優(yōu)勢

1．具有較強的免疫原性，維持較長時間2．具有較好的安全性3．具備可逆性4．使用方便，基層獸醫(yī)人員能夠使用2022/10/1524華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院七、存在的問題1．抗體中和效應(yīng)有限而短暫激素免疫產(chǎn)生的抗體中和效應(yīng)，不僅是有限的，也是暫時的。被動免疫產(chǎn)生的中和效應(yīng)維持的時間短，隨抗體代謝清除而消失；主動免疫的抗體維持時間較長，適當(dāng)進(jìn)行加強免疫可使抗體的維持時間更長

2．個體差異對成年動物，因性腺已發(fā)育成熟，免疫效果較差

3．可能產(chǎn)生的副作用2022/10/1525華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院第十節(jié)激素免疫與基因免疫

2022/10/1527華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院一、激素免疫（一）概念激素免疫技術(shù)就是將激素作為抗原（激素疫苗），給動物進(jìn)行主動免疫，刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗激素抗體，或用激素抗體給動物進(jìn)行被動免疫，使其和動物體內(nèi)相應(yīng)的激素發(fā)生特異性結(jié)合，從而顯著地改變內(nèi)源性激素的有效濃度和生物學(xué)活性，使機體功能發(fā)生改變2022/10/1528華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院（二）途徑

一是主動或被動中和體內(nèi)性腺類固醇，降低類固醇激素對下丘腦GnRH的負(fù)反饋作用，從而促進(jìn)GTH的分泌.

(綿羊雙羔疫苗)二是主動或被動免疫Ibn，促進(jìn)促卵泡素的分泌,增加動物的排卵率或產(chǎn)仔數(shù)。Ibn免疫也在多種動物進(jìn)行了試驗，證明能提高動物的排卵率

種屬或個體之間存在差異2022/10/1529華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院（三）類固醇激素免疫

多胎素（Fecundin）雙羔素基本原理:卵泡的生長發(fā)育主要受垂體GTH的調(diào)節(jié)，優(yōu)勢卵泡分泌的雌激素能反饋作用于下丘腦和垂體雄烯二酮是合成雌激素的前體，用于免疫母羊，使母羊機體產(chǎn)生大量的雄烯二酮抗體抗體中和內(nèi)源性雄烯二酮，雌激素合成減少，解除對下丘腦和垂體的抑制作用，使垂體GTH分泌增加，刺激卵泡發(fā)育，最終導(dǎo)致排卵數(shù)增加2022/10/1530華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院多胎素（Fecundin）雙羔素免疫主動免疫先制備雄烯二酮-7α-羧乙基硫醚-人血清白蛋白復(fù)合物，將這種復(fù)合1.2mg溶于2.0mL含5％DEAE葡聚糖的生理鹽水中，在母羊配種前5周~7周作皮下注射，3周~5周后加強免疫一次，2~3周母羊發(fā)情后即可配種被動免疫應(yīng)用由免疫學(xué)方法獲得的激素抗體（抗血清）直接給母羊注射，產(chǎn)生被動免疫作用

2022/10/1531華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院（四）抑制素免疫

基本原理

因為Ibn對FSH合成和分泌有特異的抑制作用，所以以Ibn為抗原給動物免疫，使其產(chǎn)生特異性的Ibn抗體，中和體內(nèi)的Ibn，使循環(huán)Ibn水平降低，減少Ibn對FSH分泌的抑制作用，達(dá)到提高體內(nèi)FSH水平、促進(jìn)卵泡發(fā)育和增加排卵數(shù)的目的2022/10/1532華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院方法與效果

1．Ibn抗原的來源和類型從動物卵泡液或精液中提取的天然Ibn人工合成Ibn肽鏈片段分子生物技術(shù)重組的Ibn

2、免疫效果2022/10/1533華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院二、基因免疫用一定的方法將帶有目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到異種動物體內(nèi)，其表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)抗原遞呈，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體并引起相應(yīng)免疫應(yīng)答的技術(shù)又叫核酸免疫、RNA免疫或DNA免疫應(yīng)用該技術(shù)生產(chǎn)的疫苗稱為基因疫苗或裸基因疫苗（DNA疫苗、RNA疫苗）2022/10/1534華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院35基因疫苗是繼減毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，基因疫苗制備簡單，使用方便，并且免疫應(yīng)答持久，保護時間較長，特別是能夠交叉免疫防護，生產(chǎn)聯(lián)合疫苗2022/10/1535華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院（一）研究簡況始于1990年，Wolff等發(fā)現(xiàn)小鼠的骨胳肌細(xì)胞能捕獲含外源基因的質(zhì)粒并在體內(nèi)較長時間穩(wěn)定地表達(dá)外源基因Tang等（1992）將含GH基因的質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠表皮細(xì)胞，88%的小鼠產(chǎn)生了抗GH抗體；二次免疫后抗體水平顯著升高抗流感、艾滋病、結(jié)核病、肝炎、瘧疾、科什曼病、牛皰疹病毒、狂犬病、腦炎病毒、以及癌細(xì)胞等數(shù)十種華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楊利國教授領(lǐng)導(dǎo)的課題組率先進(jìn)行了抑制素基因、生長抑素（somatostatin，SS）基因及凋亡抑制基因的免疫研究2022/10/1536華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院（二）原理

基因免疫工作原理2022/10/1537華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院38激素類基因免疫原理模式圖激素（INHorSS）真核表達(dá)質(zhì)粒疫苗超數(shù)排卵，產(chǎn)雙胎；促進(jìn)生長；免疫中和抗原提呈

免疫動物抗體2022/10/1538華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院三、方法

1．基因疫苗的構(gòu)建2．基因疫苗的接種3．提高基因免疫效果的方法2022/10/1539華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院401、基因疫苗構(gòu)建基因疫苗由抗原基因（外源基因、目的基因）和載體質(zhì)粒兩部分組成主要包括候選基因的篩選與獲取、哺乳動物細(xì)胞真核表達(dá)載體的選擇、抗原基因與表達(dá)載體的連接與鑒定等。

2022/10/1540華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院41質(zhì)粒載體（1）2022/10/1541華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院42質(zhì)粒載體（2）2022/10/1542華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院43質(zhì)粒載體（3）2022/10/1543華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院442、基因疫苗的接種

免疫途徑可分為：基因槍、電擊法、肌肉注射、皮內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、表皮劃痕、口服、鼻腔內(nèi)接種、鞘膜內(nèi)接種、非侵入皮膚性接種。

2022/10/1544華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院45

基因槍導(dǎo)入的原理：用微米級的金或鎢顆粒包裹質(zhì)粒DNA，然后用微粒加速裝置打入靶細(xì)胞或組織?；驑?022/10/1545華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院46

DNA電轉(zhuǎn)：即用一定強度的電脈沖將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入體內(nèi)，其操作簡單，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的效果明顯。（無針頭注射）2022/10/1546華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院47肌肉注射操作簡便，經(jīng)濟快速注射前用普魯卡因和心肌毒素處理，使組織處于再生狀態(tài)，則可進(jìn)一步提高DNA的轉(zhuǎn)化效率，使表達(dá)抗原的肌肉細(xì)胞數(shù)增加10倍，并增強免疫反應(yīng)。DNA用脂質(zhì)體或其它物質(zhì)（PLGA）包被后再進(jìn)行注射可進(jìn)一步提高免疫效率。2022/10/1547華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院48免疫程序免疫劑量：50-100微克免疫次數(shù)：理論上只需一次免疫就可使機體獲得足夠的免疫保護作用。實際上加強免疫可有效提高疫苗的保護作用，尤其對大動物而言，因為大動物的結(jié)締組織比較豐富，大大影響了疫苗的轉(zhuǎn)染效率。免疫間隔：通常鼠的免疫周期為2~4周，免疫2~3次；牛的免疫周期為1個月以上。2022/10/1548華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院492022/10/1549華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院503增強基因免疫效應(yīng)的方法2022/10/1550華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院51（1）細(xì)胞因子佐劑細(xì)胞因子：GM-CSF、VP22、CpG基元

注射細(xì)胞因子，也可以注射編碼細(xì)胞因子的質(zhì)粒質(zhì)粒DNA經(jīng)細(xì)胞攝取后，表達(dá)的細(xì)胞因子能較長時間刺激免疫活性細(xì)胞，持續(xù)活化T細(xì)胞及B細(xì)胞，促進(jìn)抗原誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫。2022/10/1551華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院522022/10/1552華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院53（2）基因疫苗與基因重組疫苗聯(lián)合應(yīng)用2022/10/1553華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院542022/10/1554華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院55選擇強啟動子構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒，啟動子類型是影響外源基因表達(dá)的主要因素之一。目前多采用CMV、RSV的啟動子，可使外源基因得到較好的表達(dá)。除此之外，合適的增強子、內(nèi)含子、翻譯起始序列、mRNA的終止信號等因素都可影響外源基因的表達(dá)。2022/10/1555華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院56

3．載體的優(yōu)化

4．改變免疫途徑及接種方式

5．接種組織預(yù)處理

2022/10/1556華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院57四基因免疫的優(yōu)越性與安全性2022/10/1557華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院581.基因免疫的優(yōu)越性抗原性強：能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫無毒力回升的危險：相對減毒活疫苗價格便宜：制備成本較低，便于保存和運輸。改造方便：可以根據(jù)需要對目的基因進(jìn)行改造，選擇抗原決定簇，可以將多個目的基因重組于一個載體上，形成嵌合質(zhì)粒。2022/10/1558華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院*華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院592.基因免疫的安全性（1）質(zhì)粒整合使宿主細(xì)胞抑癌基因失活或癌基