雙水相萃取技術(shù)

7/7雙水相萃取技術(shù)三、雙水相萃取

3.1雙水相萃取的原理及特點

3.1.1雙水相萃取的原理

雙水相萃取與水-有機相萃取的原理相似，都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配，但萃取體系的性質(zhì)不同。當物質(zhì)進入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的存在和環(huán)境因素的影響，使其在上、下相中的濃度不同。分配系數(shù)K等于物質(zhì)在兩相的濃度比，由于各種物質(zhì)的K值不同，可利用雙水相萃取體系對物質(zhì)進行分離。

3.1.2雙水相萃取的特點

雙水相體系萃取具有如下特點：(1)含水量高(70%~90%)，是在接近生理環(huán)境的溫度和體系中進行萃取，不會引起生物活性物質(zhì)失活或變性；(2)分相時間短，自然分相時間一般為5~15min；

(3)界面張力小(10-7~10-4mN/m)，有助于強化相際間的質(zhì)量傳遞；(4)不存在有機溶劑殘留問題；

(5)大量雜質(zhì)能與所有固體物質(zhì)一同除去，使分離過程更經(jīng)濟；(6)易于工程放大和連續(xù)操作。由于雙水相萃取具有上述優(yōu)點，因此，被廣泛用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取。

3.2雙水相萃取在分離和提取各種蛋白質(zhì)(酶)上的應(yīng)用

用聚乙二醇(PEG)/羥丙基淀粉酶(ReppalPEG)體系經(jīng)兩步法可從黃豆中分離磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。在黃豆勻漿中加入PEG4000，可絮凝細胞碎片及大部分雜蛋白。在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%)，PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。萃取過程的放大采用離心傾析機連續(xù)處理勻漿液，用離心萃取器完成雙水相體系的兩相分離，整個工藝具有處理量大、接觸時間短、酶收率高的特點。用PEG/(NH4)2SO4雙水相體系，經(jīng)一次萃取從A-淀粉酶發(fā)酵液中分離提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取最適宜條件為PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)，pH=8，α-淀粉酶收率為90%，分配系數(shù)為19.6，蛋白酶的分離系數(shù)高達15.1。比活率為原發(fā)酵液的1.5倍，蛋白酶在水相中的收率高于60%。通過向萃取相(上相)中加進適當濃度的(NH4)2SO4可達到反萃取。實驗結(jié)果表明，隨著(NH4)2SO4濃度的增加，雙水相體系兩相間固體物析出量也增加。固體沉淀物既可干燥后生產(chǎn)工業(yè)級酶制劑，也可將固體物加水溶解后用有機溶劑沉淀法制造食品級酶制劑.

Harris用雙水相體系從羊奶中純化蛋白，研究了牛血清清蛋白(OSA)、牛酪蛋白、β-乳球蛋白在PEG/磷酸鹽體系中的分配以及PEG相對分子質(zhì)量、pH值和鹽的加入對3種蛋白分配的影響。實驗結(jié)果表明。增加NaCl濃度，可提高分配系數(shù)，最佳pH為5。對OSA和牛酪蛋白，可得到更高的分配系數(shù)。在含有疏水基葡聚糖中，蛋白質(zhì)和類囊體薄膜泡囊的分配研究表明，苯甲?；暇厶呛臀祯；暇厶蔷哂惺杷浴Ｊ杷绊懓被?、蛋白質(zhì)和薄膜泡囊在雙水相體系中的分配，在只有磷酸鹽緩沖溶液的PEG8000/葡聚糖雙水相體系中，大部分β-半乳糖苷酶被分配在上相，但在下相中加入少量的苯甲?；暇厶?取代程度為0.054)或戊?；暇厶?取代程度為0.12)時，β-半乳糖苷酶的分配系數(shù)就降低了100倍。在對牛血清清蛋白、溶菌酶、脂肪酶和β-乳球蛋白的分配進行的觀察中發(fā)現(xiàn)具有相似的現(xiàn)象。類囊體薄膜泡囊的分配受疏水基的影響特別大，薄膜泡囊被分配在含有疏水基的一相中。在含有N，N-二甲基甲酰胺的聚合物雙水相中，利用逆流分配可對玉米醇溶蛋白進行分級分離。Miyuki在PEG/K3PO4雙水相體系中用兩步法對葡糖淀粉酶進行了萃取純化。用第一步萃取后含有酶的下相和PEG組成雙水相作為第二步萃取體系，稱作兩步法。葡糖淀粉酶的最佳分配條件是PEG4000(第一步)、PEG1500(第二步)，pH=7，純化系數(shù)提高了3倍。

液-液萃取技術(shù)是化學工業(yè)中普遍采用的分離技術(shù)之一,在生物化工中也有廣泛的應(yīng)用。然而,大部分生物物質(zhì)是有生物活性的,需要在低溫或室溫條件下進行分離純化,而采用傳統(tǒng)萃取技術(shù)無法完成。雙水相萃取就是考慮到這種現(xiàn)狀,基于液-液萃取理論并考慮保持生物活性所開發(fā)的一種新型液-液萃取分離技術(shù)。

與傳統(tǒng)的液-液分離方法相比,雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)具有以下優(yōu)勢:體系含水量高,可達80%以上;蛋白質(zhì)在其中不易變性;界面張力遠遠低于水-有機溶劑兩相體系的界面張力,有助于強化相際間的質(zhì)量傳遞;分相時間短,一般只需5～15min;易于放大和進行連續(xù)性操作;萃取環(huán)境溫和,生物相容性高;聚合物對

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定和保護作用等。正是由于雙水相萃取技術(shù)的諸多優(yōu)勢,現(xiàn)已被廣泛用于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多肽、細胞器等產(chǎn)品的分離和純化。

1雙水相萃取原理

雙水相體系是指某些高聚物之間或高聚物與無機鹽之間,在水中以適當?shù)臐舛热芙夂笮纬傻幕ゲ幌嗳艿膬上嗷蚨嘞嗨囿w系。高聚物-高聚物-水體系主要依靠高聚物之間的不容性,即高聚物分子的空間阻礙作用,促使其分相;高聚物-鹽-水體系一般認為是鹽析作用的結(jié)果。

雙水相萃取與水-有機相萃取的原理相似,都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配,不同之處在于萃取體系的性質(zhì)差異。當生物物質(zhì)進入雙水相體系后,由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的存在和環(huán)境的影響,使其在上、下相中的濃度不同。分配系數(shù)K等于兩相中生物物質(zhì)的濃度比,由于蛋白質(zhì)的K值不相同(大致在011～10之間),因而雙水相體系對各類蛋白質(zhì)的分配具有較好的選擇性。[/size]

1.2.1雙水相體系簡介（Aqueoustwophaseextraction,ATPE）

早在1896年,Beijerinck發(fā)現(xiàn),當明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液相混時,得到一個混濁不透明的溶液，隨之分為兩相,上相富含明膠,下相富含瓊脂(或淀粉),這種現(xiàn)象被稱為聚合物的不相溶性（incompatibility），從而產(chǎn)生了雙水相體系(Aqueoustwophasesystem,ATPS)。雙水相體系的形成主要是由于高聚物之間的不相溶性，即高聚物分子的空間阻礙作用，相互無法滲透，不能形成均一相，從而具有分離傾向，在一定條件下即可分為二相。一般認為只要兩聚合物水溶液的憎水程度有所差異，混合時就可發(fā)生相分離，且憎水程度相差越大，相分離的傾向也就越大。可形成雙水相體系的聚合物有很多，典型的聚合物雙水相體系有聚乙二醇(polyethyleneglycol，略作PEG)/葡聚糖(dextran),聚丙二醇(polypropyleneglycol)/聚乙二醇和甲基纖維素(methylcellulose)/葡聚糖等。另一類雙水相體系是由聚合物/鹽構(gòu)成的。此類雙水相體系一般采用聚乙二醇(polyethyleneglycol)作為其中一相成相物質(zhì)，而鹽相則多采用硫酸鹽或者磷酸鹽。

1.2.2萃取原理

雙水相萃取與水-有機相萃取的原理相似,都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。當萃取體系的性質(zhì)不同時,物質(zhì)進入雙水相體系后,由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的存在和環(huán)境因素的影響,使其在上、下相中的濃度不同。物質(zhì)在雙水相體系中分配系數(shù)K可用下式表示：

K=C上/C下

其中K為分配系數(shù)，C上和C下分別為被分離物質(zhì)在上、下相的濃度。

分配系數(shù)K等于物質(zhì)在兩相的濃度比,由于各種物質(zhì)的K值不同,可利用雙水相萃取體系對物質(zhì)進行分離。其分配情況服從分配定律，即，“在一定溫度一定壓強下，如果一個物質(zhì)溶解在兩個同時存在的互不相溶的液體里，達到平衡后，該物質(zhì)在兩相中濃度比等于常數(shù)”，分離效果由分配系數(shù)來表征。

由于溶質(zhì)在雙水相系統(tǒng)兩相間的分配時至少有四類物質(zhì)在兩個不同相系統(tǒng)共存，要分配的物質(zhì)和各相組分之間的相互作用是個復(fù)雜的現(xiàn)象，它涉及到氫鍵、電荷相互作用、范德華力、疏水性相互作用以及空間效應(yīng)等，因此，可以預(yù)料到溶質(zhì)在雙水相系統(tǒng)中兩相間的分配取決于許多因素，它既與構(gòu)成雙水相系統(tǒng)組成化合物的分子量和化學特性有關(guān)，也與要分配物質(zhì)的大小、化學特性和生物特性相關(guān)。

大量研究表明，生物分子在雙水相系統(tǒng)中的實際分配是生物分子與雙水相系統(tǒng)間靜電作用、疏水作用、生物親和作用等共同作用的結(jié)果，形式上可以將分配系數(shù)的對數(shù)值分解為幾項:InK=InKm+InKe+InKh+InKb+InKs+InKc

式中，Ke靜電作用對溶質(zhì)分配系數(shù)的貢獻；

Kh疏水作用對溶質(zhì)分配系數(shù)的貢獻；

Kb生物親和作用對溶質(zhì)分配系數(shù)的貢獻；

Ks分子大小對溶質(zhì)分配系數(shù)的貢獻；

Kc分子構(gòu)型影響對溶質(zhì)分配系數(shù)的貢獻；

Km除上述因素外的其它因素影響對溶質(zhì)分配系數(shù)的貢獻。

值得指出的是，這些因素中雖然沒有一個因素完全獨立于其它因素，但一般來說，這些不同的因素或多或少是獨立存在的。

影響待分離物質(zhì)在雙水相體系中分配行為的主要參數(shù)有成相聚合物的種類、成相聚合物的分子質(zhì)量和總濃度、無機鹽的種類和濃度、pH值、溫度等。

1.2.3雙水相的優(yōu)勢

ATPE作為一種新型的分離技術(shù)，對生物物質(zhì)、天然產(chǎn)物、抗生素等的提取、純化表現(xiàn)出以下優(yōu)勢：

(1)含水量高(70％--90％)，在接近生理環(huán)境的體系中進行萃取，不會引起生物活性物質(zhì)失活或變性；

(2)可以直接從含有菌體的發(fā)酵液和培養(yǎng)液中提取所需的蛋白質(zhì)（或者酶），還能不經(jīng)過破碎直接提取細胞內(nèi)酶，省略了破碎或過濾等步驟；

(3)分相時間短，自然分相時間一般為5min～15min；

(4)界面張力小(10-7～10-4mN／m)，有助于兩相之間的質(zhì)量傳遞，界面與試管壁形成的接觸角幾乎是直角；

(5)不存在有機溶劑殘留問題，高聚物一般是不揮發(fā)物質(zhì)，對人體無害；

(6)大量雜質(zhì)可與固體物質(zhì)一同除去；

(7)易于工藝放大和連續(xù)操作，與后續(xù)提純工序可直接相連接，無需進行特殊處理；

(8)操作條件溫和，整個操作過程在常溫常壓下進行；

(9)親和雙水相萃取技術(shù)可以提高分配系數(shù)和萃取的選擇性。

雖然該技術(shù)在應(yīng)用方面已經(jīng)取得了很大的進展，但幾乎都是建立在實驗的基礎(chǔ)上，到目前為止還沒能完全清楚地從理論上解釋雙水相系統(tǒng)的形成機理以及生物分子在系統(tǒng)中的分配機理。

現(xiàn)代生物分離技術(shù)在多肽蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用

點擊次數(shù)：408發(fā)布時間：2010-5-248:31:47

(inversemicelle)。雙親物質(zhì)的這種膠團化過程的自由能變化主要來源于雙親分子之間偶極子－偶極子相互作用，除此之外，平動能和轉(zhuǎn)動能的丟失以及氫鍵或金屬配位鍵的形成等都可能參與這種膠團化過程。

在反膠束內(nèi)部，雙親分子極性頭基相互聚集形成一個“極性核”，可以增溶水、蛋白質(zhì)等極性物質(zhì)，增溶了大量水的反膠束體系即為微乳液(microemulsion)。水在反膠束中以兩種形式存在：自由水(freewater)和結(jié)合水(boundwater)，后者由于受到雙親分子極性頭基的束縛，具有與主體水(普通水)不同的物化性質(zhì)，如粘度增大，介電常數(shù)減小，氫鍵形成的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞等。

對于增溶了物質(zhì)(如水，蛋白質(zhì)等)的反膠束基本上都認為是單層雙親分子聚集的近似球體，并忽視膠束之間的相互作用。事實上，反膠束體系處于不停的運動狀態(tài)，反膠束之間的碰撞頻率為109~1011次/s，而且反膠束中的增溶物在頻繁的交換。

2.1.2反膠束萃取蛋白質(zhì)的機理

蛋白質(zhì)溶解于小水池中(正萃，或稱萃取)，其周圍有一層水膜及表面活性劑極性頭的保護，使其避免與有機溶劑接觸而失活。改變pH、鹽濃度等條件蛋白質(zhì)又可回到水相(反萃)，實現(xiàn)了蛋白

質(zhì)的萃取分離、純化目的。反膠團萃取蛋白質(zhì)的機理目前尚不十分清楚。一般認為，萃取過程是靜電力、疏水力、空間力、親和力或幾種力協(xié)同作用的結(jié)果，其中蛋白質(zhì)與表面活性劑極性頭間的靜電相互作用是主要推動力。根據(jù)所用表面活性劑類型，通過控制水相pH高于或低于蛋白質(zhì)的等電點(pI)，達到正萃反萃的目的。

2.2反膠束萃取蛋白質(zhì)的應(yīng)用

2.2.1同時提取蛋白質(zhì)和油脂：陳復(fù)生等在AO-異辛烷反膠束同時萃取花生蛋白和花生油的過程，采用正交試驗分析討論了影響萃取的主要因素得到了最佳萃取工業(yè)條件。萃取后，油進入有機相而蛋白質(zhì)溶入反膠束中。克服了傳統(tǒng)方法工藝復(fù)雜，得率低，蛋白質(zhì)容易變性的缺點。同時用蒸餾方法將油和烴分開，提煉出了油脂。

2.2.2分離蛋白質(zhì)混合物：Chang在Aliquat336/異辛烷反膠束分離枯草桿菌中兩種酶——淀粉酶和中性蛋白酶時，通過加入助表面活性劑丁醇，有效地分離了這兩種不同等電點的酶。

2.2.3從發(fā)酵液中分離和提純酶：Krishnakant用AOT/異辛烷體系從土豆發(fā)酵液中提取酸性磷酸酶，在pH值810，萃取水相與有機相體積比為3：1，反萃水相與有機相體積比為1：1時得到最大活性的酸性磷酸酶。Sun在CB-卵磷脂親和反膠束中加入Tween85，直接從雞蛋清中提取了溶

菌酶。而該反膠束系統(tǒng)還可以回收后反復(fù)使用。

三、雙水相萃取

3.1雙水相萃取的原理及特點

3.1.1雙水相萃取的原理

雙水相萃取與水-有機相萃取的原理相似，都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配，但萃取體系的

性質(zhì)不同。當物質(zhì)進入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的存在和環(huán)境因素的影響，使其在上、下相中的濃度不同。分配系數(shù)K等于物質(zhì)在兩相的濃度比，由于各種物質(zhì)的K值不同，可利用雙水相萃取體系對物質(zhì)進行分離。

3.1.2雙水相萃取的特點

雙水相體系萃取具有如下特點：(1)含水量高(70%~90%)，是在接近生理環(huán)境的溫度和體系中進行萃取，不會引起生物活性物質(zhì)失活或變性；(2)分相時間短，自然分相時間一般為5~15min；(3)界面張力小(10-7~10-4mN/m)，有助于強化相際間的質(zhì)量傳遞；(4)不存在有機溶劑殘留問題；(5)大量雜質(zhì)能與所有固體物質(zhì)一同除去，使分離過程更經(jīng)濟；(6)易于工程放大和連續(xù)操作。由于雙水相萃取具有上述優(yōu)點，因此，被廣泛用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取。

3.2雙水相萃取在分離和提取各種蛋白質(zhì)(酶)上的應(yīng)用

用聚乙二醇(PEG)/羥丙基淀粉酶(ReppalPEG)體系經(jīng)兩步法可從黃豆中分離磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。在黃豆勻漿中加入PEG4000，可絮凝細胞碎片及大部分雜蛋白。在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%)，PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。萃取過程的放大采用離心傾析機連續(xù)處理勻漿液，用離心萃取器完成雙水相體系的兩相分離，整個工藝具有處理量大、接觸時間短、酶收率高的特點。用PEG/(NH4)2SO4雙水相體系，經(jīng)一次萃取從A-淀粉酶發(fā)酵液中分離提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取最適宜條件為

PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)，pH=8，α-淀粉酶收率為90%，分配系數(shù)為19.6，蛋白酶的分離系數(shù)高達15.1。比活率為原發(fā)酵液的1.5倍，蛋白酶在水相中的收率高于60%。通過向萃取相(上相)中加進適當濃度的(NH4)2SO4可達到反萃取。實驗結(jié)果表明，隨著(NH4)2SO4濃度的增加，雙水相體系兩相間固體物析出量也增加。固體沉淀物既可干燥后生產(chǎn)工業(yè)級酶制劑，也可將固體物加水溶解后用有機溶劑沉淀法制造食品級酶制劑.

Harris用雙水相體系從羊奶中純化蛋白，研究了牛血清清蛋白(OSA)、牛酪蛋白、β-乳球蛋白

在PEG/磷酸鹽體系中的分配以及PEG相對分子質(zhì)量、pH值和鹽的加入對3種蛋白分配的影響。實驗結(jié)果表明。增加NaCl濃度，可提高分配系數(shù)，最佳pH為5。對OSA和牛酪蛋白，可得到更高的分配系數(shù)。在含有疏水基葡聚糖中，蛋白質(zhì)和類囊體薄膜泡囊的分配研究表明，苯甲?；暇厶呛臀祯；暇厶蔷哂惺杷?。疏水基影響氨基酸、蛋白質(zhì)和薄膜泡囊在雙水相體系中的分配，在只有磷酸鹽緩沖溶液的PEG8000/葡聚糖雙水相體系中，大部分β-半乳糖苷酶被分配在上相，但在下相中加入少量的苯甲?；暇厶?取代程度為0.054)或戊酰基葡聚糖(取代程度為0.12)時，β-半乳糖苷酶的分配系數(shù)就降低了100倍。在對牛血清清蛋白、溶菌酶、脂肪酶和β-乳

球蛋白的分配進行的觀察中發(fā)現(xiàn)具有相似的現(xiàn)象。類囊體薄膜泡囊的分配受疏水基的影響特別大，薄膜泡囊被分配在含有疏水基的一相中。在含有N，N-二甲基甲酰胺的聚合物雙水相中，利用逆流分配可對玉米醇溶蛋白進行分級分離。Miyuki在PEG/K3PO4雙水相體系中用兩步法對葡糖淀

粉酶進行了萃取純化。用第一步萃取后含有酶的下相和PEG組成雙水相作為第二步萃取體系，稱作兩步法。葡糖淀粉酶的最佳分配條件是PEG4000(第一步)、PEG1500(第二步)，pH=7，純化系數(shù)提高了3倍。

四、電泳

4.1電泳的定義原理及優(yōu)點

在電場作用下，帶電顆粒在溶液中的運動稱為電泳，在小離子的情況下，稱為離子導電性現(xiàn)象。這是一種不完全的電解現(xiàn)象，所需的產(chǎn)物不是直接釋放在電極上，而是使它們不同的運動同步受阻在兩電極間的中間位置上。它能分離非常類似的物質(zhì)，包括不同的蛋白質(zhì)，提高了分折和制備的效果，特別是在紙上和在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上區(qū)帶電泳的采用。

電泳是分離生化物質(zhì)的一種有效的和多功能的方法。在電場的作用下，電泳流動性的差別，可用于許多物質(zhì)的分離，其中包括離子、膠體、細胞物質(zhì)、細胞器以及全細胞。以前電泳僅用于常規(guī)的生化分析，但近期在制備電泳上取得了許多重大的進展(如低容積高價值的化合物或試劑的生產(chǎn)中)。

電泳分離的優(yōu)點是分辨率高和能保持產(chǎn)物的生物活性。

4.2毛細管電泳(CE)

毛細管電泳是一類以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)。毛細管電泳具有多種分離模式：毛細管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細管等速電泳(CITP)、毛細管等電聚焦(CIEF)等。應(yīng)用毛細管電泳分離多肽類物質(zhì)具有柱效高、分析時間短、所用樣品量和試劑少等優(yōu)點。黃志東等使用MECC在8min分離了7種肽類物質(zhì)。

與高效液相色譜相比，CE的制備總量低，只適用于微量制備；對擴散系數(shù)小的生物大分子而言，CE比HPLC的分辨率高得多，因此CE被用來作為收集非常純的單一餾分的微量制備手段。

4.3二維凝膠電泳技術(shù)(two－dimensionaldelelectrophoresis，2-DE)

2-DE是1975年由O’Farrell首次建立的，其基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)具有不同等電點和相對分子質(zhì)量的二個一級特性，將蛋白質(zhì)的混合物在等電聚焦電泳(is