植物組織培養(yǎng)-第一章課件

大家好1大家好1

第一章實(shí)驗(yàn)室與基本操作

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第一章實(shí)驗(yàn)室與基本操作

2第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室及其基本設(shè)備實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模：

1.以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，則會(huì)限制生產(chǎn)影響效率。

2.在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來設(shè)計(jì)避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。3第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室及其基本設(shè)備實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)4實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)4一、準(zhǔn)備室作用：材料、培養(yǎng)器械的清洗、培養(yǎng)基準(zhǔn)備、滅菌等的準(zhǔn)備工作。普通化學(xué)實(shí)驗(yàn)室：儀器及設(shè)備、化學(xué)藥品。

純水儀、冰箱、移液槍、過濾滅菌器、電爐、微波爐、磁力攪拌器、低速臺(tái)式離心機(jī)、電腦等

。

作用：配制培養(yǎng)基。洗滌室：清洗、貯存器皿設(shè)施、鼓風(fēng)干燥箱等。

作用：玻璃器皿、用具和培養(yǎng)材料的洗滌。5一、準(zhǔn)備室5自動(dòng)雙重純水蒸餾器6自動(dòng)雙重純水蒸餾器6滅菌室：高壓蒸氣滅菌裝置：如立式、臥式和手提式滅菌器。作用：培養(yǎng)基、器械、棉塞、無菌紙等滅菌消毒高壓滅菌設(shè)備USINGTHEAUTOCLAVETOSTERILIZEMEDIA,GLASSWAREOROTHERLABUTENSILS

7滅菌室：高壓滅菌設(shè)備USINGTHEAUTOCLAVE細(xì)菌過濾器細(xì)菌過濾器：用于液體培養(yǎng)基滅菌裝置。8細(xì)菌過濾器細(xì)菌過濾器：用于液體培養(yǎng)基滅菌裝置。8

二、無菌操作室

作用：進(jìn)行植物材料分離接種的重要場(chǎng)所，需長(zhǎng)時(shí)間的無菌操作，對(duì)組織培養(yǎng)成功起關(guān)鍵作用。試驗(yàn)設(shè)施：

超凈工作臺(tái)

紫外燈固定式和移動(dòng)式載物臺(tái)消毒器、廣口瓶、酒精燈、酒精棉、機(jī)械支架手術(shù)剪、解剖刀、解剖針、鑷子等9

二、無菌操作室

作用：9超凈工作臺(tái)(alaminarflowhood)

工作原理:

利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效過濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。10超凈工作臺(tái)(alaminarflowhood)1111三、培養(yǎng)室

作用：進(jìn)行材料的培養(yǎng)的場(chǎng)所。其大小、規(guī)模可根據(jù)工作性質(zhì)設(shè)定。以充分利用空間和節(jié)能為原則。設(shè)備：

可調(diào)控光、溫、濕度等設(shè)備。還有固定式培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床。適用于器官（芽、莖、花藥等）、愈傷組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體的固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。12三、培養(yǎng)室作用：12培養(yǎng)細(xì)胞或組織的各種器皿13培養(yǎng)細(xì)胞或組織的各種器皿13123414123414四、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室：作用：細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)觀察。需備有高倍顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡、各種相機(jī)、恒溫箱、切片機(jī)、恒溫水浴、滴瓶、染色缸、載玻片、蓋玻片等。15四、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室：15五、溫室：

作用：培育組織與細(xì)胞培養(yǎng)出來的材料，組培苗的移栽鍛煉。16五、溫室：

作用：培育組織與細(xì)胞培養(yǎng)出來的材料，組培苗的移第二節(jié)基本操作一、洗滌方法1、重鉻酸鉀洗液：飽和的重鉻酸鉀洗液：43克重鉻酸鉀溶于1000毫升蒸餾水中（飽和溶液）。按1：1體積比將濃硫酸緩慢地倒入飽和重鉻酸鉀水溶液中。

流程：

（12h）

水洗→晾干→重鉻酸鉀洗液→自來水沖凈、蒸餾水洗兩次→干燥2、洗滌劑：洗衣粉、洗液3、超聲波洗凈器：小型玻璃器皿，頑固性污漬。超聲波除污。（要加水）

新的玻璃器皿：0.1﹪HCl浸泡12小時(shí)，洗衣粉、自來水洗、蒸餾水沖。污染的玻璃器皿：要先高壓滅菌后，然后再刷洗。要避免交叉污染。17第二節(jié)基本操作一、洗滌方法17二、滅菌方法：干熱滅菌：利用鼓風(fēng)干燥箱（烘箱）進(jìn)行烘烤滅菌的方法。箱內(nèi)溫度控制在150℃，120min。玻璃器皿.濕熱滅菌：利用高壓蒸汽滅菌的方法。一般溫度為121℃，壓力0.1MPa，消毒15～20min。培養(yǎng)基滅菌.熏蒸滅菌：利用藥物熏蒸以達(dá)到滅菌的目的。用甲醛內(nèi)加入高錳酸鉀、百菌清、硫磺熏蒸。用3%來蘇爾溶液或1%漂白粉水溶液，或0.2%過氧乙酸溶液噴灑、拖擦地板。培養(yǎng)室、接種室滅菌.18二、滅菌方法：干熱滅菌：18過濾滅菌：使溶液通過夾有微孔濾膜的漏斗，濾膜孔徑需選用0.3～0.45μm。在無菌環(huán)境下，用真空泵抽濾，其濾液為無菌。液體培養(yǎng)（不耐高溫活性物質(zhì)）藥劑滅菌：用70～75%酒精、0.1～0.2%升汞、10%的次氯酸鈉、新潔爾滅、Clorox等藥劑滅菌的方法。培養(yǎng)材料滅菌。燒灼滅菌：用酒精燈燒灼達(dá)到滅菌的目的。接種器具滅菌。射線滅菌：用紫外線照射的方法滅菌。照射時(shí)間一般為15～30min。接種時(shí)應(yīng)關(guān)閉紫外燈。室內(nèi)滅菌。19過濾滅菌：19三、無菌操作：1.接種室以及工作臺(tái)滅菌：紫外燈30分鐘，用時(shí)一定要關(guān)閉它。2.工作臺(tái)消毒：70%乙醇，用小型噴壺消毒或棉球擦拭。3.點(diǎn)燃酒精燈，開啟滅菌器,對(duì)使用器械進(jìn)行燒烤滅菌。器械冷卻后方可使用。20三、無菌操作：20第三節(jié)培養(yǎng)基的配置一、培養(yǎng)基成分（culturemedium：維持離體細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液）主要有：1、無機(jī)鹽(inorganicelements)：包括大量元素（N，P，K，Ca、S、Mg），微量元素（Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I）。2、有機(jī)化合物（organiccompounds)

：碳源（糖類），維生素類，有機(jī)含氮化合物。3、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)：生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素，赤霉素，脫落酸等。4、附加物類：瓊脂，活性炭，椰乳，硝酸銀等。21第三節(jié)培養(yǎng)基的配置一、培養(yǎng)基成分主要有：211、無機(jī)鹽(inorganicelements)——大量元素和微量元素大量元素N：用量最多。常用的有硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，KNO3、NH4NO3植物組織從培養(yǎng)基中吸收氮后形成蛋白質(zhì)。P：在植物組織培養(yǎng)在的細(xì)胞增殖分化大量需要。主要從NaH2PO4、

KH2PO4供應(yīng)。磷參與核酸、能量代謝。K：直接影響培養(yǎng)物中酶的活性。主要由KCl、KNO3或KH2PO4供應(yīng)。Ca、S、Mg：CaCl2、Ca(NO3)2作為Ca來源，MgSO4作為S和Mg的來源。221、無機(jī)鹽(inorganicelements)——大量元微量元素主要包括Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I等。植物對(duì)這些元素需要量甚微，稍多會(huì)發(fā)生毒害。Fe是用量較多的一種微量元素，對(duì)組織中葉綠素的合成和延伸生長(zhǎng)起重要作用。鐵常以FeSO4和乙二胺四乙酸鈉(Na2-EDTA)的螯合物存在于培養(yǎng)基中。23微量元素232、有機(jī)化合物（organiccompounds)

有機(jī)碳源：即糖類。作用：維持培養(yǎng)基的合適滲透壓對(duì)初生細(xì)胞和原生質(zhì)體的完整性有十分重要作用。另外，糖類也是合成有機(jī)物的碳源。最常用有：蔗糖、葡萄糖、果糖、多糖、可溶性淀粉和糊精。作為氮源，蔗糖一般濃度為2%～3%。糖的濃度影響組織分化類型：在高濃度（3%～4%）的蔗糖有利于韌皮組織分化；低糖濃度（1.5%～2.5%）時(shí)，僅生長(zhǎng)出木質(zhì)部；適中濃度時(shí)形成具有木質(zhì)部和韌皮部。242、有機(jī)化合物（organiccompounds)有機(jī)維生素類作用：直接參與生物催化劑（酶）的形成、蛋白質(zhì)、脂肪代謝等重要生命活動(dòng)。VB1（Thiamine-HCl,鹽酸硫胺素）參與碳水化合物等有機(jī)物轉(zhuǎn)化，促進(jìn)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)不定根的發(fā)育。用量10mg/L。VB5(NicotinicAcid，煙酸)，可促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)。煙酸是尼克酰胺的前體，尼克酰胺核苷酸是脫氫酶輔酶NAD+、NADP+的成分。用量1mg/L。VB6（Pyridoxine-HCl，鹽酸吡哆醇）參與植物氮代謝,促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)、提高愈傷組織分化能力、促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)。用量1mg/L。葉酸（VB9）促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)，參與嘌呤、嘧啶合成。VB12（生物素VH）培養(yǎng)物也有促進(jìn)作用。肌醇（Myo-insotol,環(huán)己六醇）：具有幫助活性物質(zhì)發(fā)揮作用的效果，可提高VB1的效應(yīng)。同時(shí)對(duì)促進(jìn)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，胚狀體及芽的形成有良好作用。用量：一般50～100mg/L。25維生素類作用：直接參與生物催化劑（酶）的形成、蛋白質(zhì)、脂肪代③有機(jī)含氮化合物氨基酸：常用的為：甘氨酸及酰胺類物質(zhì)。如谷氨酰胺（Glutamine），天冬酰胺和多種氨基酸混合物。水解乳蛋白（Lactalbuminhydrolysate,LH）、水解酪蛋白（Caseinhydrolysate，CH）。26③有機(jī)含氮化合物263、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)生長(zhǎng)素：

吲哚乙酸（IAA）：在培養(yǎng)組織中有吲哚乙酸氧化酶，可使IAA解體，而且也可在光下分解，用量稍高。

吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA），人工合成化學(xué)物質(zhì)，用量低（0.1～2mg/L）。

2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），作用比IBA和NAA強(qiáng)。細(xì)胞分裂素：激動(dòng)素（Kinetin,KT）

6-芐基腺嘌呤（6-Benzyladenine,6-BA）玉米素（Zeatin,ZT）

2-異戊烯基腺嘌呤（2-Isopentenyladenine,2iP）噻重氮苯基脲（Thidiaznron,TDZ）（噻苯?。?/p>

273、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)27赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和多效唑（PP333）等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)也在組織培養(yǎng)中應(yīng)用。

GA3—主要用于促進(jìn)試管苗的生長(zhǎng)。

ABA—體胚的發(fā)育成熟。

PP333—促進(jìn)壯苗。

在組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素的主要作用是誘導(dǎo)外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織及促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)，誘導(dǎo)根器官的分化。

細(xì)胞分裂素的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化，誘導(dǎo)不定芽和胚狀體的分化和形成，延緩組織衰老，增加蛋白質(zhì)合成。28赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和多效唑（PP333）等生4、附加物類

常用附加物類有:瓊脂(Agar):組織培養(yǎng)支持物.本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)，它是一種高分子的碳水化合物，從紅藻等海藻中提取，僅溶解于熱水，成為溶膠，冷后(40℃以下)即凝固為固體狀的凝膠。在固體培養(yǎng)方式中不可缺少。一般用量為0.5%～1.0%，有固體條狀和粉狀兩種。瓊脂糖(Agerose):可改善培養(yǎng)物的供氧狀況。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、維生素C（Vc）以及硝酸銀等，可防止培養(yǎng)材料的褐變.活性碳(AC)：具有吸附能力，減少有害物質(zhì)的影響，如可防止酚類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。也有利于某些植物生根.用量1-5%.294、附加物類

常用附加物類有:29⑤馬鈴薯萃取液：多用于壯苗的培養(yǎng)，在使用時(shí)可將馬鈴薯去皮、切碎、水煮20一30分鐘，然后將濾液加入培養(yǎng)基中，其用量通常為100—200g/L。當(dāng)培養(yǎng)基中添加了馬鈴薯萃取液后，可以對(duì)pH產(chǎn)生緩沖作用，試管苗也生長(zhǎng)得更為健壯。⑥香蕉：多用于蘭花的組織培養(yǎng)，將成熟香蕉果肉搗爛后，添加到培養(yǎng)基中，用量150—200g/L。香蕉果泥可緩沖培養(yǎng)基的pH，對(duì)外植體的分化有著較為明顯的促進(jìn)作用。⑦椰乳：Coconutmilk,CM。用于較難培養(yǎng)的植物材料的培養(yǎng)基中。可將椰子的液態(tài)胚乳取出、或高壓滅菌，或無菌過濾。使用濃度100-200mL／L。

30⑤馬鈴薯萃取液：多用于壯苗的培養(yǎng)，在使用時(shí)可將馬鈴薯去皮、二、培養(yǎng)基的種類（一）常用的培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽數(shù)量適宜，硝酸鹽、鉀和銨鹽的含量比其他培養(yǎng)基高。應(yīng)用最廣泛。主要用于園藝植物、木本植物、花卉、蔬菜等的組織培養(yǎng)。B5培養(yǎng)基

銨的含量較低。在豆科植物上應(yīng)用最多。培養(yǎng)大豆細(xì)胞和組織培養(yǎng)設(shè)計(jì)。White培養(yǎng)基成分比較簡(jiǎn)單，無機(jī)鹽和糖的用量低。31二、培養(yǎng)基的種類（一）常用的培養(yǎng)基31（二）培養(yǎng)基按試驗(yàn)?zāi)康姆譃椋?/p>

誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)基

（脫分化培養(yǎng)基）：

外植體誘導(dǎo)發(fā)生愈傷組織的培養(yǎng)基。

水稻誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)加2.4-D；而煙草、胡蘿卜既需生長(zhǎng)素，又需細(xì)胞分裂素。繼代培養(yǎng)基：誘導(dǎo)出愈傷組織后，使愈傷組織能不斷地生長(zhǎng)下去的培養(yǎng)基。32（二）培養(yǎng)基按試驗(yàn)?zāi)康姆譃椋?/p>

誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基，分化分化培養(yǎng)：由愈傷組織誘導(dǎo)形成小苗（幼芽或胚狀體）的培養(yǎng)基。①不加任何激素的基本培養(yǎng)基，即可誘導(dǎo)分化。如水稻、珍珠粟、甘蔗等植物。②加較高濃度細(xì)胞分裂素和少量生長(zhǎng)素培養(yǎng)基。如煙草、矮牽牛、四季海棠、天竺葵、菊花、倒掛金鐘等組織的分化。③只加細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基。如豌豆、油菜、小麥等。33分化培養(yǎng)：33生根培養(yǎng)基：誘導(dǎo)再生小苗生根的培養(yǎng)基。在無任何生長(zhǎng)激素的基本培養(yǎng)基中就可生出良好的根系。如煙草、紅薯、草莓、枸杞等。有些需加入少量的NAA、IAA或IBA以誘導(dǎo)根。有些需要減低培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的濃度。如用MS培養(yǎng)基中1/2或1/4的無機(jī)鹽誘導(dǎo)生根，常可獲得良好的效果。34生根培養(yǎng)基：34生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)擬南芥愈傷組織器官分化的影響35生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)擬南芥愈傷組織器官分化的影響35NAA0.5mg/L6-BA0.5mg/L生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)褐斑伽藍(lán)葉片器官分化的影響36NAA0.5mg/L6-BA0.5mg/L生長(zhǎng)素和細(xì)胞分（三）培養(yǎng)基按其物理性質(zhì)劃分為：固體培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，使液體培養(yǎng)基固化,一般用于組織或器官培養(yǎng).優(yōu)點(diǎn)：使用方便，占地不大。缺點(diǎn)：培養(yǎng)外植體只能有部分組織與培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)物上下部因接受養(yǎng)分不均勻，引起組織生長(zhǎng)的差異。液體培養(yǎng)培養(yǎng)物消毒后直接置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),一般用于細(xì)胞培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)物吸收營(yíng)養(yǎng)比較充分，容易獲得均勻一致的細(xì)胞群體。缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基較麻煩。

37（三）培養(yǎng)基按其物理性質(zhì)劃分為：37液體培養(yǎng)又分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩種形式。

靜止培養(yǎng)

在液體培養(yǎng)中用濾紙做成紙橋，橋系緊貼培養(yǎng)液表面，四周插入溶液中，直至瓶底部，使?fàn)I養(yǎng)液借助毛細(xì)管力滲入濾紙，培養(yǎng)物置于濾紙橋面，通過紙橋源源不斷地供給養(yǎng)分。38液體培養(yǎng)又分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩種形式。

靜止培養(yǎng)38振蕩培養(yǎng)將裝有培養(yǎng)物和液體培養(yǎng)基的器皿置于轉(zhuǎn)床或搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，它既能使培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中均勻的接觸吸收培養(yǎng)基成分，又能保持良好的通氣條件.

搖床有旋轉(zhuǎn)式、半旋轉(zhuǎn)式和往復(fù)式三種。速度比轉(zhuǎn)床快。

39振蕩培養(yǎng)39（三）培養(yǎng)基的篩選篩選：在多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況，確定較適宜的培養(yǎng)基。調(diào)整：根據(jù)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況或培養(yǎng)目的的不同，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)整，探索新的培養(yǎng)基。如：改良MS、改良B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基等。40（三）培養(yǎng)基的篩選篩選：在多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)三、培養(yǎng)基的制備

（一）母液的配制大量元素母液：配制原溶液的10～50X，依次溶解，混合定容。微量元素母液：一般配制100X，定容。稱量時(shí)最好用萬分之一的電子天平。鐵鹽母液：亦配制100X，硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸鈉（Na2-EDTA）分別溶解后，混合后再螯合30分鐘，最后定容。有機(jī)物母液：100X，定容。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物母液：濃度0.5～1mg/ml。

生長(zhǎng)素類：IAA、2.4-D、NAA、IBA為有機(jī)酸，制備時(shí)用堿液溶解。

IAA溶液配置：一般稱25mg，加0.1mol/LNaOH2～3ml，溶解后，加水定容25ml，即為IAA1mg/ml，也可用無水乙醇溶解后定容。

細(xì)胞分裂素類，KT、BA等，一般用0.1mol/LHCl溶解后加水定容。41三、培養(yǎng)基的制備（一）母液的配制41配制母液注意幾點(diǎn)：配制倍數(shù)不宜過高，可避免浪費(fèi)；也可避免倍數(shù)過高，吸取量相對(duì)少而影響準(zhǔn)確性。母液配制好后應(yīng)放在2～4℃冰箱內(nèi)保存。母液貯備時(shí)間不宜過長(zhǎng)。過長(zhǎng)時(shí)宜出現(xiàn)沉淀和微生物污染。42配制母液注意幾點(diǎn)：配制倍數(shù)不宜過高，可避免浪費(fèi)；也可避免倍數(shù)幾種培養(yǎng)基成分表(mg/L)培養(yǎng)基成分Murashige&Skoog(MS,1962)Gamborg(B5,1968)White(W-63,1963)N6朱至清，1975）（NH4）SO4NH4NO3KNO3Ca(NO3)2.4H2OCaCl2.2H2OMgSO4.7H2OKH2PO4NaH2PO4.H2ONa2-EDTAFe-EDTANaFe-EDTAFeSO4.7H2OKClNa2SO4Fe2SO4)3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2OH3BO3KIMoO3Na2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl.6H2O鹽酸硫胺素VB1煙酸鹽酸吡哆醇VB6肌醇甘氨酸蔗糖瓊脂pH

16501900

440370170

37.3

27.8

22.38.66.20.83

0.250.0250.0250.10.50.51002.030(g)10(g)5.8

134

2500

150250

15037.3

27.8

102.03.00.75

0.250.0250.025101.01.0100

20(g)10(g)5.5

80200

720

17

2002.55.03.01.50.750.001

0.10.30.1

3.020(g)10(g)5.6463

2830

166185400

37.3

27.8

4.43.81.60.8

1.00.50.5

2.050(g)10(g)5.8

大量元素微量元素有機(jī)物鐵鹽溶液43幾種培養(yǎng)基成分表(mg/L)培養(yǎng)基成分Murashig

（二）培養(yǎng)基配制

按培養(yǎng)基配方濃度將母液實(shí)際用量依次加入大量筒中。然后將蔗糖溶解加入，用蒸餾水定容至所需要的體積。調(diào)整pH值（0.1～1mol/LNaOH或0.1～1mol/LHCl)。另外,瓊脂溶解后的總體積計(jì)算在培養(yǎng)基體積中，溶解后，分裝培養(yǎng)器皿中，加塞，準(zhǔn)備消毒。

44

（二）培養(yǎng)基配制

按培養(yǎng)基配方濃度將母液實(shí)際用量依次加入大第四節(jié)離體培養(yǎng)體系的建立

一、建立離體培養(yǎng)體系的基本程序

1.無菌外植體的獲得

2.初代培養(yǎng)物的建立

3.形態(tài)發(fā)生和植株再生

外植體（離體的植物器官、組織、細(xì)胞）脫分化愈傷組織再分化器官發(fā)生：不定根或不定芽胚胎發(fā)生：胚狀體植物體45第四節(jié)離體培養(yǎng)體系的建立一、建立離體培養(yǎng)體系的基本程序外二、外植體選擇的基本原則

1.再生能力強(qiáng)：

基因型；分化程度；發(fā)育年齡；器官和組織的類型、部位等。

2.遺傳穩(wěn)定性好；

3.外植體來源豐富；

4.外植體容易滅菌：地上比地下、一年生比多年生、幼嫩比老齡、健康比受傷組織滅菌容易。

5.外植體大小適宜：46二、外植體選擇的基本原則465.外植體大小對(duì)分化的影響475.外植體大小對(duì)分化的影響47三、培養(yǎng)材料的滅菌（一）滅菌的要求①消滅病菌②減少對(duì)材料的損傷（二）常用消毒劑48三、培養(yǎng)材料的滅菌（一）滅菌的要求①消滅病菌②減少對(duì)材料的損（三）材料滅菌過程1、材料前處理：自來水沖洗。此過程在準(zhǔn)備室內(nèi)完成。2、消毒液處理：用酒精、升汞、次氯酸鈣等配制好的溶液進(jìn)行消毒。程序:首先75%酒精30S,0.1%升汞消毒5～30min。3、無菌水沖洗：

3-5次，每次要把鑷子、刀片等器械，進(jìn)行酒精燈燒灼消毒。

2-3步驟操作在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。49（三）材料滅菌過程1、材料前處理：49四、污染主要類型及特征

1、細(xì)菌：菌斑粘液狀，在材料基部挨著培養(yǎng)基的部位，一般短時(shí)間內(nèi)可以觀察到。1-3天。

2、真菌：有顏色的霉菌。時(shí)間較長(zhǎng)才能看到。10-30天之后出現(xiàn)。50四、污染主要類型及特征50五、污染的控制1、操作環(huán)節(jié)：防止污染的主要措施是：①改善環(huán)境條件。②嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作。③嚴(yán)查接種材料。④經(jīng)常檢查滅菌設(shè)備的質(zhì)量。⑤檢查培養(yǎng)容器是否存在問題。51五、污染的控制1、操作環(huán)節(jié)：512、內(nèi)源細(xì)菌⑴培養(yǎng)基中加入殺菌劑：

添加抗菌素（200mg/Ｌ的青霉素）、鏈霉素、慶大霉素和頭孢唑林鈉、苯甲酸鈉。⑵反復(fù)莖尖培養(yǎng)：

致病菌在植物體內(nèi)通過維管束傳播，通過反復(fù)的莖尖培養(yǎng)既可脫除內(nèi)生菌，又可脫病毒。⑶降低PH值：

大多數(shù)細(xì)菌在介質(zhì)PH小于4.5時(shí)不能生長(zhǎng)。培養(yǎng)基的PH值由5.8調(diào)至3.9～4.3，可防止大量的細(xì)菌污染。522、內(nèi)源細(xì)菌⑴培養(yǎng)基中加入殺菌劑：52小結(jié)

1.組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室及基本設(shè)備準(zhǔn)備室、無菌操作室、培養(yǎng)室、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室、溫室

2.無菌操作：洗滌、滅菌、無菌操作

3.培養(yǎng)基的制備：培養(yǎng)基的成分、種類、制備程序

4.離體培養(yǎng)體系的建立

培養(yǎng)材料的選擇、確定原則，影響取材部位的因素、材料的滅菌、污染的控制等。第一章實(shí)驗(yàn)室與基本操作53小結(jié)第一章實(shí)驗(yàn)室與基本操作53大家好54大家好1

第一章實(shí)驗(yàn)室與基本操作

55

第一章實(shí)驗(yàn)室與基本操作

2第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室及其基本設(shè)備實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模：

1.以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，則會(huì)限制生產(chǎn)影響效率。

2.在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來設(shè)計(jì)避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。56第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室及其基本設(shè)備實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)57實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)4一、準(zhǔn)備室作用：材料、培養(yǎng)器械的清洗、培養(yǎng)基準(zhǔn)備、滅菌等的準(zhǔn)備工作。普通化學(xué)實(shí)驗(yàn)室：儀器及設(shè)備、化學(xué)藥品。

純水儀、冰箱、移液槍、過濾滅菌器、電爐、微波爐、磁力攪拌器、低速臺(tái)式離心機(jī)、電腦等

。

作用：配制培養(yǎng)基。洗滌室：清洗、貯存器皿設(shè)施、鼓風(fēng)干燥箱等。

作用：玻璃器皿、用具和培養(yǎng)材料的洗滌。58一、準(zhǔn)備室5自動(dòng)雙重純水蒸餾器59自動(dòng)雙重純水蒸餾器6滅菌室：高壓蒸氣滅菌裝置：如立式、臥式和手提式滅菌器。作用：培養(yǎng)基、器械、棉塞、無菌紙等滅菌消毒高壓滅菌設(shè)備USINGTHEAUTOCLAVETOSTERILIZEMEDIA,GLASSWAREOROTHERLABUTENSILS

60滅菌室：高壓滅菌設(shè)備USINGTHEAUTOCLAVE細(xì)菌過濾器細(xì)菌過濾器：用于液體培養(yǎng)基滅菌裝置。61細(xì)菌過濾器細(xì)菌過濾器：用于液體培養(yǎng)基滅菌裝置。8

二、無菌操作室

作用：進(jìn)行植物材料分離接種的重要場(chǎng)所，需長(zhǎng)時(shí)間的無菌操作，對(duì)組織培養(yǎng)成功起關(guān)鍵作用。試驗(yàn)設(shè)施：

超凈工作臺(tái)

紫外燈固定式和移動(dòng)式載物臺(tái)消毒器、廣口瓶、酒精燈、酒精棉、機(jī)械支架手術(shù)剪、解剖刀、解剖針、鑷子等62

二、無菌操作室

作用：9超凈工作臺(tái)(alaminarflowhood)

工作原理:

利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效過濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。63超凈工作臺(tái)(alaminarflowhood)6411三、培養(yǎng)室

作用：進(jìn)行材料的培養(yǎng)的場(chǎng)所。其大小、規(guī)?？筛鶕?jù)工作性質(zhì)設(shè)定。以充分利用空間和節(jié)能為原則。設(shè)備：

可調(diào)控光、溫、濕度等設(shè)備。還有固定式培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床。適用于器官（芽、莖、花藥等）、愈傷組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體的固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。65三、培養(yǎng)室作用：12培養(yǎng)細(xì)胞或組織的各種器皿66培養(yǎng)細(xì)胞或組織的各種器皿13123467123414四、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室：作用：細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)觀察。需備有高倍顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡、各種相機(jī)、恒溫箱、切片機(jī)、恒溫水浴、滴瓶、染色缸、載玻片、蓋玻片等。68四、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室：15五、溫室：

作用：培育組織與細(xì)胞培養(yǎng)出來的材料，組培苗的移栽鍛煉。69五、溫室：

作用：培育組織與細(xì)胞培養(yǎng)出來的材料，組培苗的移第二節(jié)基本操作一、洗滌方法1、重鉻酸鉀洗液：飽和的重鉻酸鉀洗液：43克重鉻酸鉀溶于1000毫升蒸餾水中（飽和溶液）。按1：1體積比將濃硫酸緩慢地倒入飽和重鉻酸鉀水溶液中。

流程：

（12h）

水洗→晾干→重鉻酸鉀洗液→自來水沖凈、蒸餾水洗兩次→干燥2、洗滌劑：洗衣粉、洗液3、超聲波洗凈器：小型玻璃器皿，頑固性污漬。超聲波除污。（要加水）

新的玻璃器皿：0.1﹪HCl浸泡12小時(shí)，洗衣粉、自來水洗、蒸餾水沖。污染的玻璃器皿：要先高壓滅菌后，然后再刷洗。要避免交叉污染。70第二節(jié)基本操作一、洗滌方法17二、滅菌方法：干熱滅菌：利用鼓風(fēng)干燥箱（烘箱）進(jìn)行烘烤滅菌的方法。箱內(nèi)溫度控制在150℃，120min。玻璃器皿.濕熱滅菌：利用高壓蒸汽滅菌的方法。一般溫度為121℃，壓力0.1MPa，消毒15～20min。培養(yǎng)基滅菌.熏蒸滅菌：利用藥物熏蒸以達(dá)到滅菌的目的。用甲醛內(nèi)加入高錳酸鉀、百菌清、硫磺熏蒸。用3%來蘇爾溶液或1%漂白粉水溶液，或0.2%過氧乙酸溶液噴灑、拖擦地板。培養(yǎng)室、接種室滅菌.71二、滅菌方法：干熱滅菌：18過濾滅菌：使溶液通過夾有微孔濾膜的漏斗，濾膜孔徑需選用0.3～0.45μm。在無菌環(huán)境下，用真空泵抽濾，其濾液為無菌。液體培養(yǎng)（不耐高溫活性物質(zhì)）藥劑滅菌：用70～75%酒精、0.1～0.2%升汞、10%的次氯酸鈉、新潔爾滅、Clorox等藥劑滅菌的方法。培養(yǎng)材料滅菌。燒灼滅菌：用酒精燈燒灼達(dá)到滅菌的目的。接種器具滅菌。射線滅菌：用紫外線照射的方法滅菌。照射時(shí)間一般為15～30min。接種時(shí)應(yīng)關(guān)閉紫外燈。室內(nèi)滅菌。72過濾滅菌：19三、無菌操作：1.接種室以及工作臺(tái)滅菌：紫外燈30分鐘，用時(shí)一定要關(guān)閉它。2.工作臺(tái)消毒：70%乙醇，用小型噴壺消毒或棉球擦拭。3.點(diǎn)燃酒精燈，開啟滅菌器,對(duì)使用器械進(jìn)行燒烤滅菌。器械冷卻后方可使用。73三、無菌操作：20第三節(jié)培養(yǎng)基的配置一、培養(yǎng)基成分（culturemedium：維持離體細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液）主要有：1、無機(jī)鹽(inorganicelements)：包括大量元素（N，P，K，Ca、S、Mg），微量元素（Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I）。2、有機(jī)化合物（organiccompounds)

：碳源（糖類），維生素類，有機(jī)含氮化合物。3、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)：生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素，赤霉素，脫落酸等。4、附加物類：瓊脂，活性炭，椰乳，硝酸銀等。74第三節(jié)培養(yǎng)基的配置一、培養(yǎng)基成分主要有：211、無機(jī)鹽(inorganicelements)——大量元素和微量元素大量元素N：用量最多。常用的有硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，KNO3、NH4NO3植物組織從培養(yǎng)基中吸收氮后形成蛋白質(zhì)。P：在植物組織培養(yǎng)在的細(xì)胞增殖分化大量需要。主要從NaH2PO4、

KH2PO4供應(yīng)。磷參與核酸、能量代謝。K：直接影響培養(yǎng)物中酶的活性。主要由KCl、KNO3或KH2PO4供應(yīng)。Ca、S、Mg：CaCl2、Ca(NO3)2作為Ca來源，MgSO4作為S和Mg的來源。751、無機(jī)鹽(inorganicelements)——大量元微量元素主要包括Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I等。植物對(duì)這些元素需要量甚微，稍多會(huì)發(fā)生毒害。Fe是用量較多的一種微量元素，對(duì)組織中葉綠素的合成和延伸生長(zhǎng)起重要作用。鐵常以FeSO4和乙二胺四乙酸鈉(Na2-EDTA)的螯合物存在于培養(yǎng)基中。76微量元素232、有機(jī)化合物（organiccompounds)

有機(jī)碳源：即糖類。作用：維持培養(yǎng)基的合適滲透壓對(duì)初生細(xì)胞和原生質(zhì)體的完整性有十分重要作用。另外，糖類也是合成有機(jī)物的碳源。最常用有：蔗糖、葡萄糖、果糖、多糖、可溶性淀粉和糊精。作為氮源，蔗糖一般濃度為2%～3%。糖的濃度影響組織分化類型：在高濃度（3%～4%）的蔗糖有利于韌皮組織分化；低糖濃度（1.5%～2.5%）時(shí)，僅生長(zhǎng)出木質(zhì)部；適中濃度時(shí)形成具有木質(zhì)部和韌皮部。772、有機(jī)化合物（organiccompounds)有機(jī)維生素類作用：直接參與生物催化劑（酶）的形成、蛋白質(zhì)、脂肪代謝等重要生命活動(dòng)。VB1（Thiamine-HCl,鹽酸硫胺素）參與碳水化合物等有機(jī)物轉(zhuǎn)化，促進(jìn)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)不定根的發(fā)育。用量10mg/L。VB5(NicotinicAcid，煙酸)，可促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)。煙酸是尼克酰胺的前體，尼克酰胺核苷酸是脫氫酶輔酶NAD+、NADP+的成分。用量1mg/L。VB6（Pyridoxine-HCl，鹽酸吡哆醇）參與植物氮代謝,促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)、提高愈傷組織分化能力、促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)。用量1mg/L。葉酸（VB9）促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)，參與嘌呤、嘧啶合成。VB12（生物素VH）培養(yǎng)物也有促進(jìn)作用。肌醇（Myo-insotol,環(huán)己六醇）：具有幫助活性物質(zhì)發(fā)揮作用的效果，可提高VB1的效應(yīng)。同時(shí)對(duì)促進(jìn)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，胚狀體及芽的形成有良好作用。用量：一般50～100mg/L。78維生素類作用：直接參與生物催化劑（酶）的形成、蛋白質(zhì)、脂肪代③有機(jī)含氮化合物氨基酸：常用的為：甘氨酸及酰胺類物質(zhì)。如谷氨酰胺（Glutamine），天冬酰胺和多種氨基酸混合物。水解乳蛋白（Lactalbuminhydrolysate,LH）、水解酪蛋白（Caseinhydrolysate，CH）。79③有機(jī)含氮化合物263、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)生長(zhǎng)素：

吲哚乙酸（IAA）：在培養(yǎng)組織中有吲哚乙酸氧化酶，可使IAA解體，而且也可在光下分解，用量稍高。

吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA），人工合成化學(xué)物質(zhì)，用量低（0.1～2mg/L）。

2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），作用比IBA和NAA強(qiáng)。細(xì)胞分裂素：激動(dòng)素（Kinetin,KT）

6-芐基腺嘌呤（6-Benzyladenine,6-BA）玉米素（Zeatin,ZT）

2-異戊烯基腺嘌呤（2-Isopentenyladenine,2iP）噻重氮苯基脲（Thidiaznron,TDZ）（噻苯隆）

803、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)27赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和多效唑（PP333）等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)也在組織培養(yǎng)中應(yīng)用。

GA3—主要用于促進(jìn)試管苗的生長(zhǎng)。

ABA—體胚的發(fā)育成熟。

PP333—促進(jìn)壯苗。

在組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素的主要作用是誘導(dǎo)外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織及促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)，誘導(dǎo)根器官的分化。

細(xì)胞分裂素的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化，誘導(dǎo)不定芽和胚狀體的分化和形成，延緩組織衰老，增加蛋白質(zhì)合成。81赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和多效唑（PP333）等生4、附加物類

常用附加物類有:瓊脂(Agar):組織培養(yǎng)支持物.本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)，它是一種高分子的碳水化合物，從紅藻等海藻中提取，僅溶解于熱水，成為溶膠，冷后(40℃以下)即凝固為固體狀的凝膠。在固體培養(yǎng)方式中不可缺少。一般用量為0.5%～1.0%，有固體條狀和粉狀兩種。瓊脂糖(Agerose):可改善培養(yǎng)物的供氧狀況。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、維生素C（Vc）以及硝酸銀等，可防止培養(yǎng)材料的褐變.活性碳(AC)：具有吸附能力，減少有害物質(zhì)的影響，如可防止酚類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。也有利于某些植物生根.用量1-5%.824、附加物類

常用附加物類有:29⑤馬鈴薯萃取液：多用于壯苗的培養(yǎng)，在使用時(shí)可將馬鈴薯去皮、切碎、水煮20一30分鐘，然后將濾液加入培養(yǎng)基中，其用量通常為100—200g/L。當(dāng)培養(yǎng)基中添加了馬鈴薯萃取液后，可以對(duì)pH產(chǎn)生緩沖作用，試管苗也生長(zhǎng)得更為健壯。⑥香蕉：多用于蘭花的組織培養(yǎng)，將成熟香蕉果肉搗爛后，添加到培養(yǎng)基中，用量150—200g/L。香蕉果泥可緩沖培養(yǎng)基的pH，對(duì)外植體的分化有著較為明顯的促進(jìn)作用。⑦椰乳：Coconutmilk,CM。用于較難培養(yǎng)的植物材料的培養(yǎng)基中?？蓪⒁拥囊簯B(tài)胚乳取出、或高壓滅菌，或無菌過濾。使用濃度100-200mL／L。

83⑤馬鈴薯萃取液：多用于壯苗的培養(yǎng)，在使用時(shí)可將馬鈴薯去皮、二、培養(yǎng)基的種類（一）常用的培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽數(shù)量適宜，硝酸鹽、鉀和銨鹽的含量比其他培養(yǎng)基高。應(yīng)用最廣泛。主要用于園藝植物、木本植物、花卉、蔬菜等的組織培養(yǎng)。B5培養(yǎng)基

銨的含量較低。在豆科植物上應(yīng)用最多。培養(yǎng)大豆細(xì)胞和組織培養(yǎng)設(shè)計(jì)。White培養(yǎng)基成分比較簡(jiǎn)單，無機(jī)鹽和糖的用量低。84二、培養(yǎng)基的種類（一）常用的培養(yǎng)基31（二）培養(yǎng)基按試驗(yàn)?zāi)康姆譃椋?/p>

誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)基

（脫分化培養(yǎng)基）：

外植體誘導(dǎo)發(fā)生愈傷組織的培養(yǎng)基。

水稻誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)加2.4-D；而煙草、胡蘿卜既需生長(zhǎng)素，又需細(xì)胞分裂素。繼代培養(yǎng)基：誘導(dǎo)出愈傷組織后，使愈傷組織能不斷地生長(zhǎng)下去的培養(yǎng)基。85（二）培養(yǎng)基按試驗(yàn)?zāi)康姆譃椋?/p>

誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基，分化分化培養(yǎng)：由愈傷組織誘導(dǎo)形成小苗（幼芽或胚狀體）的培養(yǎng)基。①不加任何激素的基本培養(yǎng)基，即可誘導(dǎo)分化。如水稻、珍珠粟、甘蔗等植物。②加較高濃度細(xì)胞分裂素和少量生長(zhǎng)素培養(yǎng)基。如煙草、矮牽牛、四季海棠、天竺葵、菊花、倒掛金鐘等組織的分化。③只加細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基。如豌豆、油菜、小麥等。86分化培養(yǎng)：33生根培養(yǎng)基：誘導(dǎo)再生小苗生根的培養(yǎng)基。在無任何生長(zhǎng)激素的基本培養(yǎng)基中就可生出良好的根系。如煙草、紅薯、草莓、枸杞等。有些需加入少量的NAA、IAA或IBA以誘導(dǎo)根。有些需要減低培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的濃度。如用MS培養(yǎng)基中1/2或1/4的無機(jī)鹽誘導(dǎo)生根，常可獲得良好的效果。87生根培養(yǎng)基：34生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)擬南芥愈傷組織器官分化的影響88生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)擬南芥愈傷組織器官分化的影響35NAA0.5mg/L6-BA0.5mg/L生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)褐斑伽藍(lán)葉片器官分化的影響89NAA0.5mg/L6-BA0.5mg/L生長(zhǎng)素和細(xì)胞分（三）培養(yǎng)基按其物理性質(zhì)劃分為：固體培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，使液體培養(yǎng)基固化,一般用于組織或器官培養(yǎng).優(yōu)點(diǎn)：使用方便，占地不大。缺點(diǎn)：培養(yǎng)外植體只能有部分組織與培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)物上下部因接受養(yǎng)分不均勻，引起組織生長(zhǎng)的差異。液體培養(yǎng)培養(yǎng)物消毒后直接置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),一般用于細(xì)胞培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)物吸收營(yíng)養(yǎng)比較充分，容易獲得均勻一致的細(xì)胞群體。缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基較麻煩。

90（三）培養(yǎng)基按其物理性質(zhì)劃分為：37液體培養(yǎng)又分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩種形式。

靜止培養(yǎng)

在液體培養(yǎng)中用濾紙做成紙橋，橋系緊貼培養(yǎng)液表面，四周插入溶液中，直至瓶底部，使?fàn)I養(yǎng)液借助毛細(xì)管力滲入濾紙，培養(yǎng)物置于濾紙橋面，通過紙橋源源不斷地供給養(yǎng)分。91液體培養(yǎng)又分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩種形式。

靜止培養(yǎng)38振蕩培養(yǎng)將裝有培養(yǎng)物和液體培養(yǎng)基的器皿置于轉(zhuǎn)床或搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，它既能使培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中均勻的接觸吸收培養(yǎng)基成分，又能保持良好的通氣條件.

搖床有旋轉(zhuǎn)式、半旋轉(zhuǎn)式和往復(fù)式三種。速度比轉(zhuǎn)床快。

92振蕩培養(yǎng)39（三）培養(yǎng)基的篩選篩選：在多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況，確定較適宜的培養(yǎng)基。調(diào)整：根據(jù)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況或培養(yǎng)目的的不同，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)整，探索新的培養(yǎng)基。如：改良MS、改良B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基等。93（三）培養(yǎng)基的篩選篩選：在多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)三、培養(yǎng)基的制備

（一）母液的配制大量元素母液：配制原溶液的10～50X，依次溶解，混合定容。微量元素母液：一般配制100X，定容。稱量時(shí)最好用萬分之一的電子天平。鐵鹽母液：亦配制100X，硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸鈉（Na2-EDTA）分別溶解后，混合后再螯合30分鐘，最后定容。有機(jī)物母液：100X，定容。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物母液：濃度0.5～1mg/ml。

生長(zhǎng)素類：IAA、2.4-D、NAA、IBA為有機(jī)酸，制備時(shí)用堿液溶解。

IAA溶液配置：一般稱25mg，加0.1mol/LNaOH2～3ml，溶解后，加水定容25ml，即為IAA1mg/ml，也可用無水乙醇溶解后定容。

細(xì)胞分裂素類，KT、BA等，一般用0.1mol/LHCl溶解后加水定容。94三、培養(yǎng)基的制備（一）母液的配制41配制母液注意幾點(diǎn)：配制倍數(shù)不宜過高，可避免浪費(fèi)；也可避免倍數(shù)過高，吸取量相對(duì)少而影響準(zhǔn)確性。母液配制好后應(yīng)放在2～4℃冰箱內(nèi)保存。母液貯備時(shí)間不宜過長(zhǎng)。過長(zhǎng)時(shí)宜出現(xiàn)沉淀和微生物污染。95配制母液注意幾點(diǎn)：配制倍數(shù)不宜過高，可避免浪費(fèi)；也可避免倍數(shù)幾種培養(yǎng)基成分表(mg/L)培養(yǎng)基成分Murashige&Skoog(MS,1962)Gamborg(B5,1968)White(W-63,1963)N6朱至清，1975）（NH4）SO4NH4NO3KNO3Ca(NO3)2.4H2OCaCl2.2H2OMgSO4.7H2OKH2PO4NaH2PO4.H2ONa2-EDTAFe-EDTANaFe-EDTAFeSO4.7H2OKClNa2SO4Fe2SO4)3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2OH3BO3KIMoO3Na2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl.6H2O鹽酸硫胺素VB1煙酸鹽酸吡哆醇VB6肌醇甘氨酸蔗糖瓊脂pH

16501900

440370170

37.3

27.8

22.38.66.20.83

0.250.0250.0250.10