生物大分子的提取

生物大分子的提取生物大分子的提取生物大分子的提取V:1.0精細(xì)整理，僅供參考生物大分子的提取日期：20xx年X月最佳答案2.1概述在自然科學(xué)，尤其是生命科學(xué)高度發(fā)展的今天，蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，有能夠達(dá)到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結(jié)構(gòu)與功能的研究就無從談起。然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細(xì)致而困難的工作。與化學(xué)產(chǎn)品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點(diǎn)：⑴生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。⑶許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境時(shí)就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，溫度、pH值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估計(jì)和判斷。生物大分子的制備通?？砂匆韵虏襟E進(jìn)行：①確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進(jìn)行科研、開發(fā)還是要發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)。②建立相應(yīng)的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關(guān)鍵。③通過文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)，掌握生物大分子目的產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)。④生物材料的破碎和預(yù)處理。⑤分離純化方案的選擇和探索，這是最困難的過程。⑥生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定，要求達(dá)到一維電泳一條帶，二維電泳一個(gè)點(diǎn)，或HPLC和毛細(xì)管電泳都是一個(gè)峰。⑦產(chǎn)物的濃縮，干燥和保存。分析測定的方法主要有兩類：即生物學(xué)和物理、化學(xué)的測定方法。生物學(xué)的測定法主要有：酶的各種測活方法、蛋白質(zhì)含量的各種測定法、免疫化學(xué)方法、放射性同位素示蹤法等；物理、化學(xué)方法主要有：比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法（紫外／可見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及核磁共振等。實(shí)際操作中盡可能多用儀器分析方法，以使分析測定更加快速、簡便。要了解的生物大分子的物理、化學(xué)性質(zhì)主要有：①在水和各種有機(jī)溶劑中的溶解性。②在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。③固態(tài)時(shí)對(duì)溫度、含水量和凍干時(shí)的穩(wěn)定性。④各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)。⑤其他化學(xué)性質(zhì)：如對(duì)各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對(duì)各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性。⑥對(duì)其他生物分子的特殊親和力。制備生物大分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等。各種方法的基本原理可以歸納為兩個(gè)方面：①利用混合物中幾個(gè)組分分配系數(shù)的差異，把它們分配到兩個(gè)或幾個(gè)相中，如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、層析和結(jié)晶等；②將混合物置于某一物相（大多數(shù)是液相）中，通過物理力場的作用，使各組分分配于不同的區(qū)域，從而達(dá)到分離的目的，如電泳、離心、超濾等。目前純化蛋白質(zhì)等生物大分子的關(guān)鍵技術(shù)是電泳、層析和高速與超速離心。2.2生物大分子制備的前處理2.2.1生物材料的選擇制備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳锊牧?。材料的來源無非是動(dòng)物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。選擇的材料應(yīng)含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加工處理。動(dòng)物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛?，如果所要求的成分在?xì)胞內(nèi)，則要先破碎細(xì)胞。植物要先去殼、除脂。微生物材料要及時(shí)將菌體與發(fā)酵液分開。生物材料如暫不提取，應(yīng)冰凍保存。動(dòng)物材料則需深度冷凍保存。2.2.2細(xì)胞的破碎不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專門的細(xì)胞破碎方法。(1)機(jī)械法：1)研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。2)組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C(jī)將組織打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)(即高速分散器)將組織的細(xì)胞打碎。(2)物理法：1)反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。2)超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時(shí)，時(shí)間要長一些。3)壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高壓下使細(xì)胞懸液通過一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。4)冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。(3)化學(xué)與生物化學(xué)方法：1)自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认拢?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。2)溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。3)酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細(xì)胞壁分解。4)有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。2.2.3生物大分子的提取“提取”是在分離純化之前將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)不丟失生物活性的過程。影響提取的因素主要有：目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大小；由固相擴(kuò)散到液相的難易；溶劑的pH值和提取時(shí)間等。通常：極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑；溫度升高，溶解度加大；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。提取時(shí)所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。⑴水溶液提?。旱鞍踪|(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應(yīng)注意的幾個(gè)主要影響因素是：1)鹽濃度（即離子強(qiáng)度）：離子強(qiáng)度對(duì)生物大分子的溶解度有極大的影響，有些物質(zhì)，如DNA-蛋白復(fù)合物，在高離子強(qiáng)度下溶解度增加。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時(shí)大大增加，稱為“鹽溶”現(xiàn)象。鹽溶現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動(dòng)，減少了偶極分子之間極性基團(tuán)的靜電吸引力，增加了溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。為了提高提取效率，有時(shí)需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強(qiáng)度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性。2)pH值：蛋白質(zhì)、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān)。過酸、過堿均應(yīng)盡量避免，一般控制在pH=6～8范圍內(nèi)，提取溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點(diǎn)的兩側(cè)。3)溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時(shí)一般在0℃～5℃的低溫操作。4)防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的pH、離子強(qiáng)度或極性等方法使相應(yīng)的水解酶失去活性，防止它們對(duì)欲提純的蛋白質(zhì)、酶及核酸的降解作用。5)攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會(huì)引起酶等物質(zhì)的變性失活。因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)都含有相當(dāng)數(shù)量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團(tuán)，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會(huì)使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化。⑵有機(jī)溶劑提取一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機(jī)溶劑提取。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有親水性和親脂性。有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機(jī)溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機(jī)溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐?，并兼有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。例如，胰島素（見講義p36）。2.3生物大分子的分離純化由于生物體的組成成分是如此復(fù)雜，數(shù)千種乃至上萬種生物分子又處于同一體系中，因此不可能有一個(gè)適合于各類分子的固定的分離程序，但多數(shù)分離工作關(guān)鍵部分的基本手段是相同的。為了避免盲目性，節(jié)省實(shí)驗(yàn)探索時(shí)間，要認(rèn)真參考和借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)，少走彎路。常用的分離純化方法和技術(shù)有：沉淀法（包括：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀等）、離心、吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等。本章以介紹沉淀法為主。2.3.1沉淀法沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程。沉淀法（即溶解度法）操作簡便，成本低廉，不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，也用于某些生產(chǎn)目的的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用的方法。通過沉淀，將目的生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步的分離。其基本原理是根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離的目的，不同溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)，溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)芤旱膒H值、離子強(qiáng)度和極性都會(huì)使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是：⑴中性鹽沉淀（鹽析法）：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。⑵有機(jī)溶劑沉淀：多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化。⑶選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。⑷等電點(diǎn)沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其他方法結(jié)合使用。⑸有機(jī)聚合物沉淀：是發(fā)展較快的一種新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyeneglycol）作為沉淀劑。2.3.1.1中性鹽沉淀（鹽析法）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離。鹽析法應(yīng)用最廣的還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點(diǎn)是：①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。②操作簡單、安全。③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。⑴中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，因?yàn)樵摲肿拥模瑿OOH、－NH2和－OH都是親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成1nm～100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子表面極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。親水膠體在水中的穩(wěn)定因素有兩個(gè)：即電荷和水膜。因?yàn)橹行喳}的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。鹽析示意圖如下頁“圖4”所示。⑵中性鹽的選擇常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4，因?yàn)樗c其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點(diǎn)：1)溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進(jìn)行。由下表可以看到，硫銨在0℃時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類：表2-1幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.81012)分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純度提高了四倍。3)不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L濃度的（NH4）2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。4)價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境。⑶鹽析的操作方法最常用的是固體硫酸銨加入法。將其研成細(xì)粉，在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，接近計(jì)劃飽和度時(shí)，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀。鹽析后要在冰浴中放置一段時(shí)間，待沉淀完全后再離心與過濾。在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法。各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出。⑷鹽析曲線的制作如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，沒有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可以借鑒，則應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下(講義p39)：蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力102030405060708090100硫銨飽和度％⑸鹽析的影響因素1)蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.5％～3.0％，相當(dāng)于25mg/mL～30mg/mL。2)pH值對(duì)鹽析的影響：在等電點(diǎn)處溶解度小，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。3)溫度的影響：對(duì)于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強(qiáng)度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨濃度升高而增加的。一般情況下，可在室溫下進(jìn)行。但對(duì)于某些對(duì)溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。2.3.1.2有機(jī)溶劑沉淀法⑴基本原理有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：①降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。②由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是：①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。②沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機(jī)溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)用。其缺點(diǎn)是對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。⑵有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計(jì)算用于生化制備的有機(jī)溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。為了獲得沉淀而不著重于進(jìn)行分離，可用溶液體積的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機(jī)溶劑，來進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀。⑶有機(jī)溶劑沉淀的影響因素1)溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感，溫度稍高就會(huì)引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此必須預(yù)冷，操作要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時(shí)必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。2)樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例更大的有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀。高濃度樣品，可以節(jié)省有機(jī)溶劑，減少變性的危險(xiǎn)，但雜蛋白的共沉淀作用大。通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜。3)pH值：選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，通常是選在等電點(diǎn)附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。4)離子強(qiáng)度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超過5％為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的2倍體積為宜，少量的中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)變性有良好的保護(hù)作用，但鹽濃度過高會(huì)增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進(jìn)行下一步的分離，則應(yīng)盡可能抽干沉淀，減少其中有機(jī)溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機(jī)溶劑，以免影響樣品的生物活性。2.3.1.3選擇性變性沉淀法這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純。⑴熱變性利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。⑵表面活性劑和有機(jī)溶劑變性使那些對(duì)表面活性劑和有機(jī)溶劑敏感性強(qiáng)的雜蛋白變性沉淀。通常在冰浴或冷室中進(jìn)行。⑶選擇性酸堿變性利用對(duì)pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀。通常是在分離純化流程中附帶進(jìn)行的分離純化步驟。2.3.1.4等電點(diǎn)沉淀法利用具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離。由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。2.3.1.5有機(jī)聚合物沉淀法有機(jī)聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。其中應(yīng)用最多的是“聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)】(PolyethyleneGlycol簡寫為PEG)，它的親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的PEG。本方法的優(yōu)點(diǎn)是：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用很少量的P“EG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。③沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。2.3.2透析自ThomasGraham1861年發(fā)明透析方法至今已有一百多年。透析已成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室最簡便最常用的分離純化技術(shù)之一。在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機(jī)溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析的技術(shù)。透析只需要使用專用的半透膜即可完成。保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋（膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。截留分子量MwCO通常為1萬左右。用1％BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1％AgNO3檢查NaCl、KCl等。2.3.3超濾超過濾即超濾，自20年代問世后，直至60年代以來發(fā)展迅速，很快由實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的分離手段發(fā)展成重要的工業(yè)單元操作技術(shù)。超濾現(xiàn)已成為一種重要的生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，