植物學RNAi技術在植物功能基因組學中的研究進展課件

RNAi技術在植物功能基因組學中的研究進展themegalleryRNAi技術在植物功能基因組學中的研究進展themegall1InterdactionRNA干涉(RNAinterference,簡稱RNAi)是指一些小的雙鏈RNA(doublestrandRNA,dsRNA)可以高效、特異的阻斷體內特定基因表達,促使mRNA降解,誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型。RNAi是一種高效的特異性強的基因阻斷技術?？梢钥焖俜治霭谢虻墓δ?，近年來發(fā)展迅速,已成為功能基因組研究和反向遺傳學研究的有力工具。RNAi技術被《Science》雜志評為2019年度的十大科技突破。themegalleryInterdactionRNA干涉(RNAinterfer2RNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載體的構建

RNAi技術在植物上的應用

RNAi存在問題與展望

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Text2Text3Text4Text5ContentsthemegalleryRNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載3RNAi技術概述1.1RNAi的發(fā)現(xiàn)1.2RNAi的分子機制1.3RNAi作用的特點themegalleryRNAi技術概述1.1RNAi的發(fā)現(xiàn)1.2RNAi的分子41.1RNAi的發(fā)現(xiàn)2019年,康乃爾大學的Guo和Kempheus利用反義RNA(antisenseRNA)技術特異性地阻斷線蟲(C.elegans)中的par-1基因的表達以期得到與對照組注射正義RNA(senseRNA)相反的結果，但結果卻令他們費解：二者同樣阻斷了par-1基因的表達途徑。2019年,Fire和Mello等首次將正義鏈和反義鏈的混合物注入秀麗新小桿線蟲,結果表現(xiàn)出比單獨注射正義鏈或者反義鏈都要強得多的基因沉默(genesilencing)。他們將這種現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNAinterference,RNAi)。

themegallery1.1RNAi的發(fā)現(xiàn)2019年,康乃爾大學的Guo和Kem51.2RNAi的分子機制外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內,產(chǎn)生一些dsRNA。胞質中的核酸內切酶Dicer將這些dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的短雙鏈RNA(大約21~25bp),即siRNA。siRNA在RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈,然后反義siRNA再與體內一些酶結合形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)。RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結合,RISC具有核酸酶的功能,在結合部位切割mRNA,被切割后的斷裂mRNA隨即降解。themegallery1.2RNAi的分子機制外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組6RNAi信號的放大siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA,而且可作為引物與靶RNA結合并在依賴RNA的RNA聚合酶(RNdependentRNApolymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA,從而使RNAi的作用進一步放大,最終將靶mRNA完全降解。這是一種類似于RNA聚合酶的鏈式反應，該反應以siRNA中的一條鏈為引物，以靶mRNA為模板，在RdRP作用下擴增靶mRNA，產(chǎn)生新的二級siRNAs(單鏈的具有明顯極性的反義RNA)。在Dicer酶的作用下，這些二級siRNAs又能反作用于靶mRNA，使其降解，產(chǎn)生更多的siRNAs。themegalleryRNAi信號的放大siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈m71.3RNAi作用的特點高效性

研究發(fā)現(xiàn)RNAi過程中不同濃度的dsRNA產(chǎn)生的效果一樣。Miki等研究水稻OsRac基因家族的功能時,通過構建單一基因片段的植物表達載體,成功地抑制了OsRac基因家族的多個基因。說明RNAi可實現(xiàn)在一個個體或一個細胞內同時沉默多個基因。高度特異性

由dsRNA誘導的RNAi只引起與dsRNA同源的mRNA降解,不影響其它基因的表達,具有很高的特異性。siRNA具有特征性的結構:5’末端為磷酸基,3’末端為羥基,并且有2個突出的單鏈核苷酸。這種結構對RNAi是十分必要的。ATP依賴性研究發(fā)現(xiàn),如果除去或降低內源性ATP含量,dsRNA對靶基因的抑制作用明顯降低或消失,加入外源性ATP后,抑制作用仍未加強。說明RNAi是一個對ATP依賴的過程,且外源性ATP對此無促進作用。

可傳播性

在植物中,RNAi信號可以通過胞間連絲或維管組織在細胞間傳遞;而在動物中,RNAi信號的擴散需要特殊蛋白參與,在膜上形成跨膜通道而傳播到整個機體?？蛇z傳性

RNAi效應可以穩(wěn)定的遺傳給子代,在子代的表現(xiàn)型呈孟德爾遺傳方式。

themegallery1.3RNAi作用的特點高效性themegallery8RNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載體的構建

RNAi技術在植物上的應用

RNAi存在問題與展望

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Text2Text3Text4Text5ContentsthemegalleryRNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載9

轉錄后基因沉默（PTGS）轉錄水平基因沉默（TGS）

翻譯水平上基因沉默（miRNA）RNAi引起基因沉默的途徑themegallery轉錄后基因沉默（PTGS）轉10轉錄后基因沉默（PTGS）轉錄后基因沉默是最普遍的一種沉默機制。PTGS通過降解mRNA來抑制基因的表達。包括幾種現(xiàn)象:一種現(xiàn)象是植物中的共抑制(co-suppress)現(xiàn)象,即引起外源基因和靶基因或內源基因同時發(fā)生沉默,首次在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。此外病毒侵染植物引起基因沉默也屬于共抑制現(xiàn)象。另一種是真菌發(fā)生靜息現(xiàn)象(quelling)。轉錄水平基因沉默（TGS）

它是由siRNA指導染色體發(fā)生變化(包括DNA和組蛋白甲基化)是指啟動子序列發(fā)生甲基化或局部染色體發(fā)生變化,影響轉錄因子的結合,使基因不能正常轉錄,下調基因表達。

themegallery轉錄后基因沉默（PTGS）themegallery11翻譯水平上基因沉默這個過程主要是由內源性miRNA介導的一種基因沉默。miRNA的前體(pre-miRNA)是70nt的莖環(huán)RNA或雙鏈RNA,它們在Dicer酶、ATP和解旋酶的共同作用下分裂成21~25bp的成熟miRNA。成熟的miRNA是具有約22nt的5’為單磷酸基、3’為羥基的單鏈RNA。miRNA與相關蛋白質結合成另一種RISC復合體,RISC復合體通過和靶mRNA結合,從而導致mRNA的降解或抑制基因的轉錄。

植物miRNAs明顯特征是剪切靶mRNA,如miR172,主要功能是作為翻譯抑制子。themegallery翻譯水平上基因沉默themegallery12RNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載體的構建

RNAi技術在植物上的應用

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Text3Text4Text5ContentsthemegalleryRNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載133植物RNAi表達載體的構建3.1轉基因RNAi載體構建的關鍵因素在強組成型啟動子下游插入反向重復片段的重組雙元載體是導致RNA沉默的基本結構。在該載體中,目標基因的cDNA片段被克隆在間隔序列(spacer)的兩端,這些片段通過頭頭相連或尾尾相連導致該轉基因產(chǎn)生自我互補的hpRNA(分子內dsRNA)結構。themegallery3植物RNAi表達載體的構建3.1轉基因RNAi載體構建的14內含子有無在轉錄時通過拼接產(chǎn)生功能性間隔(spacer)內含子在介導基因沉默比無功能性的內含子更有效。形成帶有內含子的ihpRNA載體，其沉默效率比hpRNA高達90%以上。啟動子強弱啟動子強弱對于外源基因的表達水平有重要的影響。CaMV35S啟動子已廣泛應用于雙子葉植物中,但在水稻、小麥等禾本科植物中可用泛素Ubiquitin啟動子等,以提高載體的干擾程度。目的片段大小目的片段大小的選擇也十分重要。Helliwell和Waterhouse在構建載體時選擇50bp~1kb的目的片段都成功地導致了目的基因沉默。但是發(fā)現(xiàn)較短的片段效率較低,較長的發(fā)夾結構在寄主細菌中容易重組。

Helliwell建議采用300bp~600bp大小的片段更容易獲得比較有效的基因沉默。

themegallery內含子有無themegallery153.2RNAi載體構建的過程3.2.1目的片段的克隆以植株的DNA為模板,用帶特定酶切位點的引物進行PCR擴增,然后將PCR產(chǎn)物克隆到T載體上3.2.2表達載體的構建

正義基因片段和純化的質粒片段連接

帶有正義基因片段的質粒載體與反義片段連接

雙元表達載體

themegallery3.2RNAi載體構建的過程3.2.1目的片段的克隆the16RNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載體的構建

RNAi技術在植物上的應用

RNAi存在問題與展望

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Text2Text3Text4Text5ContentsthemegalleryRNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載174RNAi技術在植物上的應用4.4植物品種改良中的應用4.3植物雄性不育的研究4.2植物抗病性的研究4.1植物基因功能的研究themegallery4RNAi技術在植物上的應用4.4植物品種改良中的應用4184.1植物基因功能的研究Chuang等在花發(fā)育研究中采用RNAi技術進一步驗證了AG,CLV3,AP1,PAN等已知功能基因,并開創(chuàng)了RNAi技術在植物功能基因組學中的應用。

Fig.1.GeneconstructsusedtoanalyzedsRNAeffects.themegallery4.1植物基因功能的研究Chuang等在花發(fā)育研究中采用R19Fig.2.Flowersofwild-type,ag-1andAG(RNAi)plants.Fig.4.EffectsofAGdsRNAonlevelsofAGmRNAandAGproteinFig.3.Phenotypesofwild-type,CLV3(RNAi),andclv3–2plants.Fig.5.EffectsofPANdsRNAoncrc-1transgenicplants.(AandD)crc-1.3452themegalleryFig.2.Flowersofwild-type,20RNAi在基因家族方面的研究Miki等(2019)等將水稻OsRac基因家族的7個成員通過RNAi技術分別被特異抑制,把基因家族成員的3‘-非轉譯區(qū)(3’-UTR)作為反向重復序列構建RNAi載體,其中3個成員被高效抑制。同時將OsRac基因家族中高保守性強的序列構建RNAi載體,結果不同效率地抑制了所有成員基因的表達。這個結果顯示RNAi技術在研究基因家族的有效性。themegalleryRNAi在基因家族方面的研究Miki等(2019)等將水稻O21RNAi技術研究多倍體植物功能缺失研究表明,在真菌、動物和植物中的RNAi是生物抵御病毒侵染的一種古老的生理機制。

Richard等在四倍體植株中成功地運用了RNAi技術。用擬南芥著絲點甲基化相關的dsRNA對擬南芥的四倍體進行RNA干擾,發(fā)現(xiàn)擬南芥的四倍體中對應的著絲點脫甲基化,擬南芥四倍體中對應的與甲基化有關的mRNA含量水平劇減。最近,Travella等在構建的PDS-RNAi和EIN1-RNAi的六倍體小麥轉基因作物中,成功的抑制了目的基因。研究證明,RNAi技術是研究多倍體植物功能缺失突變很好的工具。

themegalleryRNAi技術研究多倍體植物功能缺失研究表明,在真菌、動物和植224.2植物抗病性的研究2019年,首次報道RNAi技術在防治馬鈴薯Y病毒抗病的應用,利用馬鈴薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段構建IRS載體進行煙草轉化,使植株完全免疫。

根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)引起的根癌病危害著許多多年生水果、堅果和觀賞性植物。研究發(fā)現(xiàn)iaaM和ipt2個基因在這個疾病中起重要作用。采用RNAi技術,在擬南芥和番茄中沉默iaaM和ipt2個基因成功地抵抗了根癌病。

themegallery4.2植物抗病性的研究2019年,首次報道RNAi技術在防治234.3植物雄性不育的研究劉樂承等人采用RNAi技術下調了白菜BcMF4基因的表達，導致了菜心轉基因植株部分花粉的不育，證明BcMF4基因在普通白菜和菜心等白菜植物的花粉發(fā)育中起著重要作用.

Cigan等利用RNAi技術直接沉默玉米的花粉囊基因表達的啟動子MS45,從而抑制花粉囊的形成,形成玉米的雄性不育株;

利用不同的啟動子使已經(jīng)沉默的啟動子MS45重新表達,玉米植株重新恢復育性。

themegallery4.3植物雄性不育的研究劉樂承等人采用RNAi244.4植物品種改良中的應用日本生物技術研究所使用RNA干擾花色素苷和類黃酮生物合成的關鍵酶查耳酮合成酶(CHS)基因,成功地將花由原先的藍色轉變?yōu)榘咨头凵?創(chuàng)造了新的商品花卉。Ogita等利用RNAi抑制咖啡因合成酶(theobrominesynthase)基因的表達,結果咖啡因含量降低了5~7成。Liu(2019)等利用RNAi技術對棉籽油的成分進行改良,應用RNAi技術下調兩個主要脂肪酸脫氫酶基因的表達,從而將棉籽油中的高油酸和高硬脂含量水平降低.利用RNAi通過敲除22kD玉米貯藏蛋白的表達，培育出高賴氨酸玉米品種(segaletal.，2019)。Ganga等(2019)采用果實特異啟動子結合RNAi技術來抑制番茄內源光形態(tài)建成調節(jié)基因DET1的表達,結果類胡蘿卜素和類黃酮含量明顯升高,而果實的其它品質參數(shù)沒有發(fā)生大的改變。表明利用器官特異基因的沉默可以改善植物營養(yǎng)品質。themegallery4.4植物品種改良中的應用日本生物技術研究所使用RNA干擾花25RNAi技術作為一種便捷實用的基因組研究方法,預示著一個嶄新的RNA時代即將來臨。RNAi技術將有助于人們更深入完整地認識和了解作物的生長發(fā)育現(xiàn)象,揭示作物生長發(fā)育的內在規(guī)律和分子基礎,調控作物有益性狀的高效表達,使有害基因處于沉默狀態(tài),這對于加速分子育種技術在作物育種上的應用,加快選育抗病、抗蟲、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質等各種不同育種目標的新品種具有重要的意義。5RNAi存在問題與展望themegalleryRNAi技術作為一種便捷實用的基因組研究方法,預示著一個嶄新26ThanksForYourAttantion!themegalleryThanksForYourAttantion!the27RNAi技術在植物功能基因組學中的研究進展themegalleryRNAi技術在植物功能基因組學中的研究進展themegall28InterdactionRNA干涉(RNAinterference,簡稱RNAi)是指一些小的雙鏈RNA(doublestrandRNA,dsRNA)可以高效、特異的阻斷體內特定基因表達,促使mRNA降解,誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型。RNAi是一種高效的特異性強的基因阻斷技術?？梢钥焖俜治霭谢虻墓δ?，近年來發(fā)展迅速,已成為功能基因組研究和反向遺傳學研究的有力工具。RNAi技術被《Science》雜志評為2019年度的十大科技突破。themegalleryInterdactionRNA干涉(RNAinterfer29RNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載體的構建

RNAi技術在植物上的應用

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Text2Text3Text4Text5ContentsthemegalleryRNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載30RNAi技術概述1.1RNAi的發(fā)現(xiàn)1.2RNAi的分子機制1.3RNAi作用的特點themegalleryRNAi技術概述1.1RNAi的發(fā)現(xiàn)1.2RNAi的分子311.1RNAi的發(fā)現(xiàn)2019年,康乃爾大學的Guo和Kempheus利用反義RNA(antisenseRNA)技術特異性地阻斷線蟲(C.elegans)中的par-1基因的表達以期得到與對照組注射正義RNA(senseRNA)相反的結果，但結果卻令他們費解：二者同樣阻斷了par-1基因的表達途徑。2019年,Fire和Mello等首次將正義鏈和反義鏈的混合物注入秀麗新小桿線蟲,結果表現(xiàn)出比單獨注射正義鏈或者反義鏈都要強得多的基因沉默(genesilencing)。他們將這種現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNAinterference,RNAi)。

themegallery1.1RNAi的發(fā)現(xiàn)2019年,康乃爾大學的Guo和Kem321.2RNAi的分子機制外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內,產(chǎn)生一些dsRNA。胞質中的核酸內切酶Dicer將這些dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的短雙鏈RNA(大約21~25bp),即siRNA。siRNA在RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈,然后反義siRNA再與體內一些酶結合形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)。RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結合,RISC具有核酸酶的功能,在結合部位切割mRNA,被切割后的斷裂mRNA隨即降解。themegallery1.2RNAi的分子機制外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組33RNAi信號的放大siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA,而且可作為引物與靶RNA結合并在依賴RNA的RNA聚合酶(RNdependentRNApolymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA,從而使RNAi的作用進一步放大,最終將靶mRNA完全降解。這是一種類似于RNA聚合酶的鏈式反應，該反應以siRNA中的一條鏈為引物，以靶mRNA為模板，在RdRP作用下擴增靶mRNA，產(chǎn)生新的二級siRNAs(單鏈的具有明顯極性的反義RNA)。在Dicer酶的作用下，這些二級siRNAs又能反作用于靶mRNA，使其降解，產(chǎn)生更多的siRNAs。themegalleryRNAi信號的放大siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈m341.3RNAi作用的特點高效性

研究發(fā)現(xiàn)RNAi過程中不同濃度的dsRNA產(chǎn)生的效果一樣。Miki等研究水稻OsRac基因家族的功能時,通過構建單一基因片段的植物表達載體,成功地抑制了OsRac基因家族的多個基因。說明RNAi可實現(xiàn)在一個個體或一個細胞內同時沉默多個基因。高度特異性

由dsRNA誘導的RNAi只引起與dsRNA同源的mRNA降解,不影響其它基因的表達,具有很高的特異性。siRNA具有特征性的結構:5’末端為磷酸基,3’末端為羥基,并且有2個突出的單鏈核苷酸。這種結構對RNAi是十分必要的。ATP依賴性研究發(fā)現(xiàn),如果除去或降低內源性ATP含量,dsRNA對靶基因的抑制作用明顯降低或消失,加入外源性ATP后,抑制作用仍未加強。說明RNAi是一個對ATP依賴的過程,且外源性ATP對此無促進作用。

可傳播性

在植物中,RNAi信號可以通過胞間連絲或維管組織在細胞間傳遞;而在動物中,RNAi信號的擴散需要特殊蛋白參與,在膜上形成跨膜通道而傳播到整個機體?？蛇z傳性

RNAi效應可以穩(wěn)定的遺傳給子代,在子代的表現(xiàn)型呈孟德爾遺傳方式。

themegallery1.3RNAi作用的特點高效性themegallery35RNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載體的構建

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Text2Text3Text4Text5ContentsthemegalleryRNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載36

轉錄后基因沉默（PTGS）轉錄水平基因沉默（TGS）

翻譯水平上基因沉默（miRNA）RNAi引起基因沉默的途徑themegallery轉錄后基因沉默（PTGS）轉37轉錄后基因沉默（PTGS）轉錄后基因沉默是最普遍的一種沉默機制。PTGS通過降解mRNA來抑制基因的表達。包括幾種現(xiàn)象:一種現(xiàn)象是植物中的共抑制(co-suppress)現(xiàn)象,即引起外源基因和靶基因或內源基因同時發(fā)生沉默,首次在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。此外病毒侵染植物引起基因沉默也屬于共抑制現(xiàn)象。另一種是真菌發(fā)生靜息現(xiàn)象(quelling)。轉錄水平基因沉默（TGS）

它是由siRNA指導染色體發(fā)生變化(包括DNA和組蛋白甲基化)是指啟動子序列發(fā)生甲基化或局部染色體發(fā)生變化,影響轉錄因子的結合,使基因不能正常轉錄,下調基因表達。

themegallery轉錄后基因沉默（PTGS）themegallery38翻譯水平上基因沉默這個過程主要是由內源性miRNA介導的一種基因沉默。miRNA的前體(pre-miRNA)是70nt的莖環(huán)RNA或雙鏈RNA,它們在Dicer酶、ATP和解旋酶的共同作用下分裂成21~25bp的成熟miRNA。成熟的miRNA是具有約22nt的5’為單磷酸基、3’為羥基的單鏈RNA。miRNA與相關蛋白質結合成另一種RISC復合體,RISC復合體通過和靶mRNA結合,從而導致mRNA的降解或抑制基因的轉錄。

植物miRNAs明顯特征是剪切靶mRNA,如miR172,主要功能是作為翻譯抑制子。themegallery翻譯水平上基因沉默themegallery39RNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載體的構建

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Text3Text4Text5ContentsthemegalleryRNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載403植物RNAi表達載體的構建3.1轉基因RNAi載體構建的關鍵因素在強組成型啟動子下游插入反向重復片段的重組雙元載體是導致RNA沉默的基本結構。在該載體中,目標基因的cDNA片段被克隆在間隔序列(spacer)的兩端,這些片段通過頭頭相連或尾尾相連導致該轉基因產(chǎn)生自我互補的hpRNA(分子內dsRNA)結構。themegallery3植物RNAi表達載體的構建3.1轉基因RNAi載體構建的41內含子有無在轉錄時通過拼接產(chǎn)生功能性間隔(spacer)內含子在介導基因沉默比無功能性的內含子更有效。形成帶有內含子的ihpRNA載體，其沉默效率比hpRNA高達90%以上。啟動子強弱啟動子強弱對于外源基因的表達水平有重要的影響。CaMV35S啟動子已廣泛應用于雙子葉植物中,但在水稻、小麥等禾本科植物中可用泛素Ubiquitin啟動子等,以提高載體的干擾程度。目的片段大小目的片段大小的選擇也十分重要。Helliwell和Waterhouse在構建載體時選擇50bp~1kb的目的片段都成功地導致了目的基因沉默。但是發(fā)現(xiàn)較短的片段效率較低,較長的發(fā)夾結構在寄主細菌中容易重組。

Helliwell建議采用300bp~600bp大小的片段更容易獲得比較有效的基因沉默。

themegallery內含子有無themegallery423.2RNAi載體構建的過程3.2.1目的片段的克隆以植株的DNA為模板,用帶特定酶切位點的引物進行PCR擴增,然后將PCR產(chǎn)物克隆到T載體上3.2.2表達載體的構建

正義基因片段和純化的質粒片段連接

帶有正義基因片段的質粒載體與反義片段連接

雙元表達載體

themegallery3.2RNAi載體構建的過程3.2.1目的片段的克隆the43RNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載體的構建

RNAi技術在植物上的應用

RNAi存在問題與展望

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Text2Text3Text4Text5ContentsthemegalleryRNAi技術概述RNAi引起基因沉默的途徑植物RNAi表達載444RNAi技術在植物上的應用4.4植物品種改良中的應用4.3植物雄性不育的研究4.2植物抗病性的研究4.1植物基因功能的研究themegallery4RNAi技術在植物上的應用4.4植物品種改良中的應用4454.1植物基因功能的研究Chuang等在花發(fā)育研究中采用RNAi技術進一步驗證了AG,CLV3,AP1,PAN等已知功能基因,并開創(chuàng)了RNAi技術在植物功能基因組學中的應用。

Fig.1.GeneconstructsusedtoanalyzedsRNAeffects.themegallery4.1植物基因功能的研究Chuang等在花發(fā)育研究中采用R46Fig.2.Flowersofwild-type,ag-1andAG(RNAi)plants.Fig.4.EffectsofAGdsRNAonlevelsofAGmRNAandAGproteinFig.3.Phenotypesofwild-type,CLV3(RNAi),andclv3–2plants.Fig.5.EffectsofPANdsRNAoncrc-1transgenicplants.(AandD)crc-1.3452themegalleryFig.2.Flowersofwild-type,47RNAi在基因家族方面的研究Miki等(2019)等將水稻OsRac基因家族的7個成員通過RNAi技術分別被特異抑制,把基因家族成員的3‘-非轉譯區(qū)(3’-UTR)作為反向重復序列構建RNAi載體,其中3個成員被高效抑制。同時將OsRac基因家族中高保守性強的序列構建RNAi載體,結果不同效率地抑制了所有成員基因的表達。這個結果顯示RNAi技術在研究基因家族的有效性。themegalleryRNAi在基因家族方面的研究Miki等(2019)等將水稻O48RNAi技術研究多倍體植物功能缺失研究表明,在真菌、動物和植物中的RNAi是生物抵御病毒侵染的一種古老的生理機制。

Richard等在四倍體植株中成功地運用了RNAi技術。用擬南芥著絲點甲基化相關的dsRNA對擬南芥的四倍體進行RNA干擾,發(fā)現(xiàn)擬南芥的四倍體中對應的著絲點脫甲基化,擬南芥四倍體中對應的與甲基化有關的mRNA含量水平劇減。最近,Travella等在構建的PDS-RNAi和EIN1-RNAi的六倍體小麥轉基因作物中,成功的抑制了目的基因。研究證明,RNAi技術是研究多倍體植物功能缺