藥監(jiān)系統(tǒng)官方培訓(xùn) 核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑(盒)行標(biāo)宣貫 北檢所 20200927

《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑(盒)》YY/T

1182-2020PCR儀器光學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖光源燈濾光鏡反射鏡CCD相機(jī)雙色鏡夫累爾透鏡多元鏡96孔透鏡組濾鏡輪96孔板定量PCR-光學(xué)檢測(cè)單元ABIEppendorf

Stratagene

Roche

CorbettBio-Rad燈+CCD

7300LC480IQ57500MyIQMx3005Mx4000鹵鎢燈+PMTLED+PMTRealplex2Realplex4LC2.0Rotorgene30

Opticon200/6000LED+PDTStepOne/PlusMiniOpticonChromo4CFX96熒光PCR原理

–

TaqManTM技術(shù)QR5’3’RTaqQRR5’5’3’3’1.

StrandDisplacement2.

CleavageTaqQ5’RTaq3.

PolymerizationComplete5’5’3’lRTaq4.

Detection5’5’3’熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR常用的三個(gè)概念擴(kuò)增曲線、閾值、CT值（1）、擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增曲線的兩種形式左圖反映的是隨著PC反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號(hào)的變化量的對(duì)數(shù)與PC反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時(shí)具有簡(jiǎn)單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件都采用右圖的形式，這兩種實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換。熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR常用的三個(gè)概念（2）、閾值線熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR常用的三個(gè)概念（3）、CT值PCR過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理對(duì)于普通的PCR反應(yīng)來(lái)說=X

（

＋

）上式中，

為

輪PC循環(huán)后，目的基因PC產(chǎn)物的量；

為PC循環(huán)數(shù)；

為目的基因的初始模板量，

為PC的反應(yīng)效率，0≤E≤

。熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理由于PCR反應(yīng)體系中熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的量成正比，所以用熒光強(qiáng)度來(lái)代替PCR產(chǎn)物的量，我們可以得到：Rn=RB+X0(1+

E

n

Rs總熒光信號(hào)強(qiáng)度

本底信號(hào)

分子數(shù)量×單位信號(hào)強(qiáng)度：第

個(gè)循環(huán)時(shí)的總信號(hào)：本底：?jiǎn)挝恍盘?hào)強(qiáng)度：起始DN數(shù)目：

PC效率熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理當(dāng)循環(huán)數(shù)n等于CT值時(shí)，所有樣品熒光信號(hào)強(qiáng)度變化量的對(duì)數(shù)全部一致，都達(dá)到了閾值。RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT

-RB)=lgX0

+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0

+lg(RT

-RB)–lgRs此時(shí)，PCR反應(yīng)處于指數(shù)期階段，所有樣品的反應(yīng)效率E穩(wěn)定且近似相等；

lg(RT

-RB)、Rs也都相同，只有CT值和-lgX0為變量，且這兩個(gè)變量之間成一次性方程。也就是說，

所有樣品的lgX0與到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)n（Ct值）呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析CTlg(1+E)=-lgX0

+lg(RT

-RB)–lgRs（1）、PCR效率相等，在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，E穩(wěn)定且為常數(shù)；（2）、RT

–RB

要相等；也就是說到達(dá)閾值時(shí)樣品的熒光強(qiáng)度與樣品的熒光本底之差要相等；（3）、樣品的單位信號(hào)強(qiáng)度Rs要相等，用熒光染料做熒光基團(tuán)時(shí)，Rs

就是每條PCR產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，此熒光強(qiáng)度和PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)短有關(guān)，PCR產(chǎn)物越長(zhǎng)，結(jié)合的熒光染料越多，

Rs

值越大；用探針做熒光基團(tuán)時(shí)，Rs

就等于PCR反應(yīng)時(shí)，Taq酶水解掉探針，探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，和PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度沒有直接關(guān)系。6.熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析LogX0與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品Ct值，就可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出未知樣品初始模板量。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線105104103102101100105

104

103

102

101

100?

標(biāo)準(zhǔn)品梯度的選擇：5～6個(gè)梯度?

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)的選擇：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)通常為10熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論雙鏈核酸的熔解曲線分析對(duì)于核酸序列相同的PCR產(chǎn)物，其TM值也相同，而且其TM值在一個(gè)很小的溫度范圍內(nèi)，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強(qiáng)度急劇降低，以熒光強(qiáng)度的變化率和溫度來(lái)作圖，則可得到如下圖：融解曲線分析對(duì)PCR產(chǎn)物特異性進(jìn)行分析熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論mRNA差異表達(dá)的相對(duì)定量分析2-△△CT法該方法的前提條件是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同且都為1，在試驗(yàn)開始前必須分別對(duì)目的基因和內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線，看兩者擴(kuò)增效率的差別，假如兩者擴(kuò)增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，無(wú)需再做標(biāo)準(zhǔn)品。該方法要求嚴(yán)格的重復(fù)，因?yàn)镃T值的差異只要有很小的變化，測(cè)得的結(jié)果就會(huì)有很大的差別。該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測(cè)的基因種類很多的情況?！逗怂釘U(kuò)增檢測(cè)用試劑(盒)》起草單位起草單位標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目名稱制/修訂北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所中國(guó)食品藥品檢定研究院核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑

修訂(盒)中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司湖南圣湘生物科技有限公司上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑(盒)》?

YY/T1182-2010?

2010-12-27發(fā)布?

2012-06-01實(shí)施?

通用標(biāo)準(zhǔn)?

YY/T1182-2020修訂目的：–

增強(qiáng)其通用性；–

提高技術(shù)指標(biāo)的合理性；–

增強(qiáng)條理性?！逗怂釘U(kuò)增檢測(cè)用試劑(盒)》修訂修訂后條款號(hào)修訂后條款名稱范圍主要修訂內(nèi)容

刪除產(chǎn)品描述內(nèi)容，刪除不適用內(nèi)容“基因分型、基因芯片和病毒基因分型/突變檢測(cè)用試劑（盒）”；

增加核酸擴(kuò)增方法描述，增加不適用內(nèi)容“基因測(cè)序產(chǎn)品”；1234

增加文件GB/T29791.2規(guī)范性引用術(shù)語(yǔ)和定義分類刪除

個(gè)術(shù)語(yǔ)9刪除原命名內(nèi)容5.1通用要求5.1.1~5.1.25.2.1~5.2.95.3.1~5.3.5565.2定量試劑的要求5.3定性試劑的要求技術(shù)要求試驗(yàn)方法針對(duì)

技術(shù)要求的調(diào)整，進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整578標(biāo)簽和使用說明略包裝、運(yùn)輸和貯存略其他：刪除原附錄A《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑(盒)》驗(yàn)證序號(hào)

驗(yàn)證單位

產(chǎn)品名稱方法學(xué)1達(dá)安人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光法）人乳頭瘤病毒（20個(gè)型）基因分型檢測(cè)試劑盒（電化學(xué)基因傳感器法）234圣湘源奇雅培乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒解脲脲原體核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）（PCR-熒光探針法）（RT-PCR法）白血病相關(guān)融合基因檢測(cè)試劑盒BCR-ABL融合基因定量檢測(cè)試劑盒丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒人免疫缺陷病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（熒光RT-PCR法）（實(shí)時(shí)熒光PCR法）（實(shí)時(shí)熒光PCR法）5678羅氏亞能艾康安圖PCR-熒光探針法）（α-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒MP乙型肝炎病毒核酸(gap-PCR法)肺炎支原體（

）核酸檢測(cè)試劑盒PCR（熒光法）(DNA)定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）9乙型肝炎病毒（HBV天?。┖怂岫繖z測(cè)試劑盒（熒光PCR法）5.1通用要求核酸檢測(cè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目

研制者

發(fā)布年

編號(hào)

濃度HBVDNA