CAR-T技術(shù)及腫瘤精準(zhǔn)免疫治療

.4/4CAR-T技術(shù)與腫瘤精準(zhǔn)免疫治療本文由愛康得生物原創(chuàng)2015年1月20日,美國總統(tǒng)奧巴馬在國情咨文演講中提出"精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃",一時(shí)間"精準(zhǔn)醫(yī)療"成為一大熱門詞匯。在美國,精準(zhǔn)醫(yī)療稱為"PrecisionMedicine",而早在百余年前的中國,中醫(yī)就提出了"精準(zhǔn)醫(yī)療"這一概念,稱為"辯證施治"。腫瘤又被稱為多基因疾病,其發(fā)病機(jī)理,疾病發(fā)展過程,疾病病癥與表現(xiàn)在個(gè)體之間差存在異。腫瘤的發(fā)生因素很復(fù)雜,遺傳因素,外環(huán)境與內(nèi)環(huán)境以及體細(xì)胞與干細(xì)胞的DNA損傷與修復(fù),導(dǎo)致基因突變的逐步積累,最終演變?yōu)楦鞣N癌癥的發(fā)生〔圖1。腫瘤發(fā)生的機(jī)理如基因突變,逆分化,腫瘤干細(xì)胞,免疫監(jiān)視,端粒與端粒酶等等還有太多的未知領(lǐng)域。這些錯(cuò)綜復(fù)雜的因素導(dǎo)致相同組織器官癌癥引發(fā)的機(jī)理不一致,相同機(jī)理引發(fā)的癌癥部位不一致。腫瘤的發(fā)生往往有數(shù)千個(gè)突變類型,每個(gè)病人的突變類型不一樣,所以傳統(tǒng)的治療模式出現(xiàn)了許多困惑,如無法解釋的耐藥性,腫瘤基因組的異質(zhì)性,有效治療響應(yīng)監(jiān)測手段的缺乏等,在此時(shí),精準(zhǔn)治療對于腫瘤的治療十分重要。圖1：腫瘤發(fā)生的復(fù)雜性。腫瘤的發(fā)生因素很復(fù)雜,遺傳因素,外環(huán)境與內(nèi)環(huán)境以及體細(xì)胞與干細(xì)胞的DNA損傷與修復(fù),導(dǎo)致基因突變的逐步積累,最終演變?yōu)楦鞣N癌癥的發(fā)生。腫瘤精準(zhǔn)免疫治療發(fā)展當(dāng)前,廣泛用于腫瘤精準(zhǔn)免疫治療的藥物為靶向藥物和單克隆抗體,其利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間分子生物學(xué)上的差異〔包括基因、酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等不同特性,抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖,最后使其死亡。如用于治療非小細(xì)胞肺癌的易瑞沙和特羅凱,用于治療大腸癌的西妥昔單抗,用于治療乳腺癌的曲妥珠單抗,用于治療前列腺癌伊馬替尼等。但腫瘤細(xì)胞十分狡猾,在靶向藥物使用過程中,腫瘤為躲避藥物的作用會產(chǎn)生突變,繼而產(chǎn)生耐藥使這類藥物失去效力,如易瑞沙平均耐藥時(shí)間約1年,特羅凱耐藥時(shí)間還要更短些,大約在8個(gè)月左右。耐藥后腫瘤進(jìn)展十分迅速,病人不得不重新尋找其他治療方法。20XX是值得紀(jì)念的一年,《科學(xué)》雜志評論作為20XX度最重要的科學(xué)突破的榜首——癌癥的免疫療法。其中以程序性死亡因子1抗體<anti-PD1>及其它免疫檢查點(diǎn)抗體和嵌合抗原受體T細(xì)胞療法〔CAR-T療法最受矚目。PD-1在惡性黑色素瘤和肺鱗癌的治療獲得重大突破,被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床。CAR-T在B細(xì)胞惡性腫瘤的治療獲得巨大成功,ALL完全緩解率達(dá)到驚人的90%。在此我們著重聊一聊CAR-T免疫療法。CAR-T免疫療法是通過整合嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞來抵抗腫瘤細(xì)胞的療法。嵌合抗原受體可以特異性識別腫瘤相關(guān)抗原靶點(diǎn),識別結(jié)合后將激活增殖T細(xì)胞的信號傳遞至胞內(nèi),引起T細(xì)胞激活和增殖,從而有效殺傷腫瘤細(xì)胞。自1989年以色列魏茨曼科學(xué)研究所免疫學(xué)家ZeligEshhar將免疫球蛋白scFv與FcεRI受體<γ鏈>或CD3復(fù)合物<ζ鏈>胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合并導(dǎo)入T細(xì)胞制備出第一代CAR-T以來,CAR-T經(jīng)歷了20余年的發(fā)展〔圖2。CAR分子大致可分為5代演變：I代,特異性T細(xì)胞激活；II代,增加共刺激因子,提高細(xì)胞毒性；III代,同時(shí)具有兩個(gè)共刺激因子,提高T細(xì)胞增殖能力與殺傷毒性；IV代,整合自殺基因,精確調(diào)控,細(xì)胞因子釋放〔如IL-7,IL-15激活等；V代,通用型CAR〔圖3。圖2：CAR-T的發(fā)展歷程圖3：CAR分子的演變。I代,特異性T細(xì)胞激活；II代,增加共刺激因子,提高細(xì)胞毒性；III代,同時(shí)具有兩個(gè)共刺激因子,提高T細(xì)胞增殖能力與殺傷毒性；IV代,整合自殺基因,精確調(diào)控,細(xì)胞因子釋放〔如IL-7,IL-15激活等；V代,通用型CAR。CAR-T臨床試驗(yàn)療效與毒性在血液惡性腫瘤方面,20XXUPenn利用CD19-CAR-T細(xì)胞治療復(fù)發(fā)難治性B-ALL,完全緩解率達(dá)90%；2015年ASCO會議,MSKCC公布一組數(shù)據(jù),CD19-CAR-T治療B-ALL,32例受試者有29例獲完全緩解,CR率達(dá)91%。在治療實(shí)體瘤方面,利用HER2-CAR-T治療HER2+肉瘤患者,共19例患者參與臨床實(shí)驗(yàn),輸注CAR-T細(xì)胞數(shù)量逐步升高,無明顯CAR-T毒性,部分瘤內(nèi)有少量T細(xì)胞浸潤,4例穩(wěn)定病情達(dá)12周~14個(gè)月,中位生存期10.3月〔5.1~29.1個(gè)月〔圖4；Mesothelin是一個(gè)腫瘤相關(guān)抗原,在很多惡性胸膜間皮瘤中廣泛高表達(dá)。以Meso為靶點(diǎn),通過在T細(xì)胞上瞬時(shí)表達(dá)CAR分子,經(jīng)靜脈回輸外加瘤內(nèi)注射的方式對2例入選患者進(jìn)行治療,未出現(xiàn)明顯的副作用,CAR-T細(xì)胞在兩例患者體內(nèi)均體現(xiàn)了一定的抗腫瘤活性,患者腹水中的Mesothelin陽性的腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少〔圖5。圖4：HER2-CAR-T治療HER2+肉瘤患臨床療效觀察。部分瘤內(nèi)有少量T細(xì)胞浸潤,4例穩(wěn)定病情達(dá)12周~14個(gè)月,中位生存期10.3月〔5.1~29.1個(gè)月。圖5：以Meso為靶點(diǎn),通過在T細(xì)胞上瞬時(shí)表達(dá)CAR分子,經(jīng)靜脈回輸外加瘤內(nèi)注射的方式對2例入選患者進(jìn)行治療,未出現(xiàn)明顯的副作用,CAR-T細(xì)胞在兩例患者體內(nèi)均體現(xiàn)了一定的抗腫瘤活性,患者腹水中的Mesothelin陽性的腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少。接受CAR-T治療的患者會出現(xiàn)毒性反應(yīng)。如寒戰(zhàn),發(fā)熱,白細(xì)胞減少,溶瘤綜合癥,巨噬細(xì)胞活化綜合癥,細(xì)胞因子風(fēng)暴,B細(xì)胞缺乏及低丙種球蛋白血癥,脫靶效應(yīng)〔ontarget/offtumor等。其中幾乎所有接受CAR-T細(xì)胞治療并且出現(xiàn)應(yīng)答的患者都會出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴,這與T細(xì)胞的激活直接相關(guān),而腫瘤負(fù)荷影響細(xì)胞因子風(fēng)暴的級別〔分為1~4級。通過輸注前化療預(yù)處理,使用輸注細(xì)胞劑量遞增方案,并嚴(yán)密監(jiān)測血清相關(guān)指標(biāo),如IL-6水平,C-反應(yīng)蛋白等。利用IL-6拮抗劑如Tocilizumab可治療嚴(yán)重細(xì)胞因子風(fēng)暴,并且不會影響CAR-T療效。脫靶效應(yīng)常見于CAR-T治療實(shí)體瘤患者中,由于靶向抗原在正常組織中也低表達(dá),導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞攻擊人正常組織,如人肺組織會低表達(dá)Her2,Her2-CAR-T細(xì)胞可引起致命的肺毒性。通過降低scFv親和力,局部瘤內(nèi)注射,尋找腫瘤特異性抗原等方法來減少或避免這類毒性的發(fā)生。由此可見,目前CAR-T細(xì)胞治療還不夠精準(zhǔn)。CAR-T臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與治療方案研究截至2015年10月,全球共計(jì)110項(xiàng)CAR-T臨床試驗(yàn)在ClinicalT注冊,其中大部分為血液腫瘤的臨床試驗(yàn),實(shí)體瘤占38項(xiàng),均為I/II期臨床試驗(yàn)〔表1,血液腫瘤靶點(diǎn)選擇最多的是CD19,實(shí)體瘤主要靶點(diǎn)選擇是EGFR,GD2,CEA,Her2〔圖6。表1：CAR-T實(shí)體瘤臨床試驗(yàn)在ClinicalT注冊情況〔截至2015.10圖6：實(shí)體瘤靶向抗原選擇比例圖在臨床試驗(yàn)中,血液腫瘤的CAR-T治療方案為：在獲得臨床試驗(yàn)批準(zhǔn)后,首先根據(jù)入選與排除標(biāo)準(zhǔn)篩選受試者,與受試者簽署知情同意書后對其病情進(jìn)行評估,采集分離PBMC,經(jīng)T細(xì)胞分選,CAR病毒感染,洗脫擴(kuò)增,質(zhì)控檢測后收獲CAR-T細(xì)胞。在細(xì)胞輸注前4天完成化療預(yù)處理。連續(xù)3天按10%,30%,60%的劑量遞增方式輸注CAR-T細(xì)胞。輸注后半年內(nèi)月度隨訪和半年后的季度隨訪,以及15年后的轉(zhuǎn)基因跟蹤。實(shí)體腫瘤的CAR-T治療沒有獲得如血液腫瘤治療后的驚人療效。實(shí)體腫瘤的治療情況相對復(fù)雜多變。首實(shí)體腫瘤致密結(jié)構(gòu)特點(diǎn)阻礙了CAR-T對腫瘤組織的浸潤,導(dǎo)致實(shí)體瘤內(nèi)部沒有足夠的T效應(yīng)T細(xì)胞；再者腫瘤微環(huán)境中存在免疫負(fù)調(diào)節(jié)因素的制約,如免疫抑制性細(xì)胞的存在〔regulatoryTcells,myeloidderivedsuppressorcells,andM2tumor-associatedmacrophages,抑制性細(xì)胞因子〔TGF-β,IL-10,腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的T細(xì)胞功能抑制性蛋白分子<B7-Hfamilymembers,Fasligand>,引導(dǎo)CAR-T向腫瘤灶歸巢的趨化因子等。所以,CAR-T細(xì)胞輸注前患者預(yù)處理方案,如何讓CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)有效增殖并保持高殺瘤活性,如何使CAR-T細(xì)胞有效浸潤在實(shí)體瘤內(nèi)部等一系列問題尚待進(jìn)一步研究。如使用CT模擬定位三維適形放療技術(shù)對實(shí)體瘤進(jìn)行預(yù)處理,或用微創(chuàng)介入或瘤內(nèi)注射的方式,使CAR-T細(xì)胞更多地進(jìn)入到實(shí)體瘤內(nèi)部對靶細(xì)胞進(jìn)行有效殺傷。另外可以將CAR-T負(fù)載溶瘤病毒以提高對實(shí)體瘤治療的效果〔詳見《CAR-T細(xì)胞與溶瘤病毒聯(lián)用》一文。小結(jié)精準(zhǔn)醫(yī)療是未來疾病治療的發(fā)展方向,但是目前腫瘤的精準(zhǔn)治療長路漫漫。如果將腫瘤比喻為陰,免疫系統(tǒng)比喻為陽,則陰陽之間相互對立,相互統(tǒng)一,相互制約,消長與共〔圖7。圖7：腫瘤與免疫治療之間相互對立,相互統(tǒng)一,相互制約,消長與共僅依靠細(xì)胞治療腫瘤還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。手術(shù),化療,放療可以迅速降低腫瘤負(fù)荷,特異性治療如CAR-T,TCR-T,抗體藥物