重組質(zhì)粒酶切鑒定及PCR實(shí)驗(yàn)

重組質(zhì)粒酶切鑒定及 PCR實(shí)驗(yàn)重組質(zhì)粒的酶切鑒定及 PCR實(shí)驗(yàn)一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．檢驗(yàn)重組質(zhì)粒的插入片段的大小2．學(xué)習(xí)PCR技術(shù)的使用二．實(shí)驗(yàn)原理（一）重組質(zhì)粒酶切鑒定將含有外源DNA的轉(zhuǎn)化子的E.coliDH5α菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并用試劑盒提取其質(zhì)粒DNA，將所提取的DNA用切pUC19質(zhì)粒的同一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割以驗(yàn)證所插入的外源DNA的大小。（二）PCRPCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是 1986年由KallisMullis發(fā)現(xiàn)。這項(xiàng)技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，它不僅可用于基因分離克隆和核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析等方面。本次實(shí)驗(yàn)旨在通過學(xué)習(xí)和掌握PCR反應(yīng)的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，以驗(yàn)證重組質(zhì)粒插入片段大小。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理PCR是一種利用兩種與相反鏈雜交并附著于靶DNA兩側(cè)的寡核苷酸引物，經(jīng)酶促合成特異的DNA片段的體外方法。反應(yīng)過程由高溫變性，低溫退火和適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，然后反復(fù)進(jìn)行，使目的的DNA得以迅速擴(kuò)增。置待擴(kuò)增DNA于高溫下解鏈成為單鏈DNA模板，人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合，DNA聚合酶在72℃將單核苷酸從引物3'端開始摻入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA新鏈。由于每一循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，所以PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng)25—30次周期之后，理論上可增加109倍，實(shí)際上可增加107倍。PCR技術(shù)具有操作簡便、省時(shí)、靈敏度高特異性強(qiáng)和對原始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)，但由于所用的TaqDNA聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能糾正反應(yīng)中發(fā)生的錯(cuò)誤核苷酸摻入，估計(jì)每9000個(gè)核苷酸會(huì)導(dǎo)致一個(gè)摻入錯(cuò)誤，但是錯(cuò)誤摻入的堿基有終止鏈延伸的作用傾向，使得錯(cuò)誤不會(huì)擴(kuò)大。2．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使 DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的 DNA擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)， X表示平（Y）均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為 100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列 DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的競爭等因素。大多數(shù)情況下，平臺(tái)期的到來是不可避免的。3．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5’端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒有固定的止點(diǎn)，長短不一，這就是長產(chǎn)物片段。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈（即長產(chǎn)物片段）結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的短產(chǎn)物片段。短產(chǎn)物片段是按指數(shù)倍數(shù)增加，而長產(chǎn)物片段則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)。這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。三．實(shí)驗(yàn)材料及儀器1．實(shí)驗(yàn)材料：PRC擴(kuò)增儀，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備，移液器，0.2ml薄壁PCR管，凝膠成像儀，模板pUC19重組質(zhì)粒（插入片段125bp和564bp），寡核苷酸引物（上游引物M13F，下游引物M13R），TaqDNA聚合酶（TaKaRa，-20℃貯存），dNTPsTaKaRa，-20℃貯存），10×PCR反應(yīng)緩沖液（TaKaRa，-20℃貯存）高速離心機(jī)，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，量筒，移液槍，冰盒，槍尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，記號筆，TAE電泳緩沖液(10×)，瓊脂糖，溴化乙錠(EB)，DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物DNAMarkerk／HindⅢ，DL5000四．實(shí)驗(yàn)步驟（一）重組質(zhì)粒的酶切、電泳檢測1．對于電泳顯示插入片段在 2.0kb以上的重組質(zhì)粒，采用HindⅢ酶切進(jìn)行驗(yàn)證。大片段或高產(chǎn)量的重組質(zhì)粒推薦的反應(yīng)體系（ 10μl體系）如下：成分體積（μl）ddH2O6.22+1.010×Buffer（含Mg）Re-Puc19μ）2.0HindⅢ（0.815U/l共計(jì)10.0若插入片段比較小，則選用20μl體系：成分體積（μl）ddH2O9.0-11.02+2.010×Buffer（含Mg）Re-Puc19μ）6.0-8.0HindⅢ（1.015U/l共計(jì)20.0輕彈混勻后，短暫離心，于

37℃

孵育

2hr

后，保存于

-20

℃，備電泳檢測。2. 酶切產(chǎn)物電泳檢測取酶切產(chǎn)物10 ul，加入2ul6 ×上樣緩沖液，混勻后取 6ul取重組質(zhì)粒10ul，加入2ul6 ×上樣緩沖液，混勻后取 6ul

點(diǎn)樣。點(diǎn)樣。以λDNA/HindIII為Marker。100V恒壓電泳約40min。電泳結(jié)束EB染色10min，水洗后紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（二）重組質(zhì)粒的 PCR驗(yàn)證/PCR擴(kuò)增目的基因?qū)τ陔娪撅@示插入片段在 2.0kb以下的重組質(zhì)粒，采用 PCR進(jìn)行驗(yàn)證。引物此次重組用到的載體是pUC19，限制性內(nèi)切酶為HindⅢ，所以選擇HindⅢ酶切位點(diǎn)兩側(cè)一定距離的序列制作引物。由于載體pUC19上兩引物間序列的長度是150bp，所以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度（bp）=150+插入片段的長度。下圖所示為pUC19部分序列，即引物來源：M13F(-47):EcoRⅠcgccagggttttcccagtcacgac gttgTaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtcctgtgtgaaattgttatccgctcHind ⅢM13R(-48)(互補(bǔ)鏈)PCR引物為引物名引物序列稱

5’

3 ’

引物長度

Tm()

℃(mers)M13F(-4 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCA24 64.77)CGACM13R(-4GAGCGGATAACAATTTCACA2457.98)CAGG1.反應(yīng)體系的建立PCR反應(yīng)體系如下：編號組分體積（ul）1ddH2O14.822+2.010×Buffer（含Mg）3dNTP（2.5mMeach）1.64M13F（10μM）0.85M13R（10μM）0.86模板（約10ng/μl）1.07Taq酶（5u/μl）0.2總體積20.0除了此反應(yīng)體系之外，還要做三個(gè)反應(yīng)體系：其他組分不變，只將編號6的組分換成共用564bp模板，pUC19質(zhì)粒（作為模板對照），ddH2O（作為陰性對照）。振蕩混勻，然后短暫離心。反應(yīng)程序的設(shè)定將加好樣的PCR管進(jìn)行標(biāo)記，放入PCR儀中，設(shè)定反應(yīng)基本參數(shù)如表所示。編號項(xiàng)目溫度/℃時(shí)間1預(yù)變性943min2變性9430s3復(fù)性5830s4延伸72轉(zhuǎn)2，循環(huán)29次5終延伸7210min6保存41）預(yù)變性：讓DNA雙鏈充分解離,然后第一次退火過程時(shí)候引物可以盡量多的結(jié)合到模版上面這主要是為了保險(xiǎn)起見，使模板DNA的二級結(jié)構(gòu)充分打開。2）變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。3）復(fù)性：當(dāng)溫度突然降低時(shí)由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜的多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會(huì)較少。4）延伸：在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及鎂離子存在的條件下 ， 5 ＇-→3＇的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的 DNA鏈延伸反應(yīng)。5）終延伸：循環(huán)完成后使PCR反應(yīng)完全以提高擴(kuò)增產(chǎn)量，在用普通Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)在產(chǎn)物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測：1%的瓊脂糖凝膠電泳：20ulPCR產(chǎn)物中加 3.0ul10 ×上樣緩沖液，混合均勻，取5ul點(diǎn)樣。以DL2000plus為Marker。100V恒壓電泳約40min。電泳結(jié)束EB染色10min，水洗后紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析（一） 重組質(zhì)粒的酶切電泳結(jié)果將重組質(zhì)粒酶切之后進(jìn)行凝膠電泳，紫外成像如圖 1.1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011圖1第1-5組重組質(zhì)粒酶切凝膠電泳成像圖從左到右各泳道分別為：第1泳道：λDNA/HindIII；第2-19泳道：第1-5組重組與酶切質(zhì)粒（R1，R1/HindIII，R2，R2/HindIII）；第20泳道：pUC19/HindIII；第21泳道：λDNA/HindIII。我所在的組別是第 1組，樣品在第2-5泳道。第2、3泳道分別為重組質(zhì)粒1和重組質(zhì)粒1的酶切，具體分析見圖2。第4、5泳道分別為重組質(zhì)粒2和重組質(zhì)粒2的酶切，具體分析見圖3。如圖 2 所示。泳道 1 為λDNA/HindIII ， 泳 道 20 為pUC19/HindIII ，泳道2為本組重組質(zhì)粒樣品1，泳道3為重組質(zhì)粒的酶切。帶（1）大小在5000-6000bp左右，與第2泳道中的重組質(zhì)粒位置近似，因此帶（1）可以理解為未被酶切開的重組質(zhì)粒；帶（2）大小4000左右，與第2泳道中重組質(zhì)粒前面的那條帶近似，但卻變得暗了，可以判斷為未被酶切的重組質(zhì)粒，也說明泳道2中最前面的那條帶為外源DNA重組質(zhì)粒。帶（3）大小與酶切pUC19質(zhì)粒大小相似，可以判斷為重組質(zhì)粒酶切后的質(zhì)粒載體；而帶（4）大小在564bp左右，為酶切開的λDNA片段。圖2重組質(zhì)粒1酶切對比如圖 3所示。泳道 1 為λDNA/HindIII ，泳道 20 為pUC19/HindIII，泳道4為本組重組質(zhì)粒樣品 2，泳道5為重組質(zhì)粒的酶切。帶（2）大小4000左右，與第 4泳道中的重組質(zhì)粒位置近似，因此帶（2）可以理解為未被酶切開的重組質(zhì)粒；帶（3）大小與酶切pUC19質(zhì)粒大小相似，可以判斷為重組質(zhì)粒酶切后的質(zhì)粒載體；而帶（4）大小在2322bp左右，為酶切開的λDNA片段。泳道4中，在重組質(zhì)粒上方又出現(xiàn)了一條帶（1），大小在4316bp左右，可能為酶切開而沒有連接上的λDNA片段。圖3重組質(zhì)粒2酶切對比（二）重組質(zhì)粒的 PCR驗(yàn)證結(jié)果瓊脂糖電泳展示的克隆片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果如下圖：圖4第1-5組重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證結(jié)果從左到右各泳道點(diǎn)樣如下表所示：泳道123組別對照J(rèn)D-1樣品DL2000564bp本組plus模板樣品

45678910JD-2JD-3564bp本組本組本組564pUC19水模板樣品樣品樣品模板12泳道1112131415161718組別JD-4JD-5空對照樣品564bp本組本組564bp本組本組無DL2000模板樣品樣品模板樣品樣品plus1212從圖中可以看出，第8泳道沒有條帶，這是由于第3組的同學(xué)操作失誤，忘記加564bp模板造成的。我所在的組別是第1組，即泳道2、3。泳道2為564bp模板，泳道3為本組樣品中的2號樣品。具體分析如下：圖5中，泳道1為DL2000plus，泳道2為模板564bp，泳道3為本組提取的兩個(gè)樣品中的一個(gè)——重組質(zhì)粒 2。泳道9是以pUC19質(zhì)粒代替模板 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道10是以ddH2O代替模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道2為564bp模板PCR產(chǎn)物，顯示的條帶大小為 750bp左右，因?yàn)閮梢镩g序列的長度是 150bp，所以泳道 2顯示的條帶結(jié)果較為理想。泳道3為本組所提重組質(zhì)粒 2，其酶切圖如圖6所示。其中泳道1為圖5PCR擴(kuò)增目的基因結(jié)果圖 λDNA/HindIII ，泳道4、5分別為重組質(zhì)粒及其酶切條帶。泳道 5中的帶（4）為酶切后的λ DNA片段，大小為 2322bp。將此條帶進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得到的條帶即為圖5中的泳道三所示條帶，此條帶在2000bp-3000bp之間，基本與插入片段的大小相符。泳道9以pUC19質(zhì)粒代替模板 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板對照。顯示的較明顯的條帶在 100bp-250bp之間，應(yīng)為150bp的引物序列，是目的擴(kuò)增片段，泳道9中無其他雜帶，結(jié)果較為理想。泳道10以ddH2O代替模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為陰性對照，但出現(xiàn)了彌散性條帶，推測可能是引物設(shè)計(jì)中，出現(xiàn)引物自身配對結(jié)合的情況導(dǎo)致的引物二聚體。圖6本組重組質(zhì)粒2及酶切圖克隆片段的定量計(jì)算量取DNAmarkerDL2000plus條帶的遷移距離（如表橫坐標(biāo)，DNA大小的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制曲線（如圖表1克隆片段大小與電泳遷移距離（以圖遷移距離/cm片段大小/bp1.7350002.0730002.4120003.1710003.477503.845004.292504.70100

所示）。以遷移距離為7所示）。4為標(biāo)準(zhǔn)）Lg（片段大?。?.703.483.303.002.882.702.402.00測得圖4中第2、3泳道所示條帶的遷移距離分別為 3.51cm和2.40cm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2=0.9785）計(jì)算出片段大小分別為660bp和2511bp。實(shí)際片段大小應(yīng)分別為714bp和2472bp，誤差分別為7.6％和1.6％。)pb(gL

3.83.63.43.23.02.82.62.42.22.01.81.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0migrationdistance/cm圖1克隆片段大小與電泳遷移距離六．注意事項(xiàng)1.限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)屬于微量操作技術(shù)，無論是DNA樣品還是酶的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性并確保樣品和酶全部加入反應(yīng)體系；酶切反應(yīng)的所有塑料制品（Eppendorf管、吸頭等）必須是新的，并經(jīng)過高溫滅菌，操作時(shí)打開使用，操作過程不要求無菌，但要注意手和空氣中雜酶的污染，因此要求環(huán)境干凈，戴手套操作，盡量減少走動(dòng)，縮短Eppendorf管的開蓋時(shí)間。注意酶切加樣的順序，一般先加重蒸水，其次加緩沖液和DNA，最后加酶。前幾步要把樣品加到管底的側(cè)壁上，加完后用力將其甩到管底，而酶液要在加入前從-20℃冰箱取出，酶管放置在冰上，取酶液時(shí)洗頭應(yīng)從表面吸取，防止由于插入過深而使吸頭外壁沾染過多的酶液，取出的酶液應(yīng)立即加入反應(yīng)混合也得液面以下，并充分混勻。酶液使用完畢后立即放回冰箱，防止酶的失活。Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)，復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)，本實(shí)驗(yàn)兩個(gè)引物的Tm分別為64.7℃，57.9℃，選用退火溫度為58℃，這是因?yàn)樵赥m值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。PCR管的蓋子一定要蓋緊，以防蒸干。七．分析與討論（一）PCR反應(yīng)的要素2+在PCR反應(yīng)體系中主要存在 5類物質(zhì)，即引物、酶、 dNTP、模板和Mg。引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：（1） 引物長度：引物長度根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，長約 17個(gè)堿基的寡核苷酸序列在基因組中可能出現(xiàn)的機(jī)率的為 1次。因此，引物長度一般最低不少于 16個(gè)核苷酸，而最高不超過30個(gè)核苷酸。典型的引物18到24個(gè)核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。（2）引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。3）引物堿基：（G+C）含量以40-60%為宜，（G+C）太少擴(kuò)增效果不佳，（G+C）過多易出現(xiàn)非特異條帶。A、T、G、C最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。4）避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)。兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在引物3’端，即使無法避免，其3’端互補(bǔ)堿基也不應(yīng)大于2個(gè)堿基，否則易生成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。（5）引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。6）引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)。被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處。7）引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。本次實(shí)驗(yàn)所使用的上下游引物M13F、M13R分別與puc19多克隆位點(diǎn)兩端的24bp長度的序列配對。其引物序列分別為（5’-3’）：M13F/CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；M13R/AGCGGATAACAATTTCACACAGGA。pUC19載體上兩引物之間的長度為150bp，因此目的擴(kuò)增的片段長度=（多克隆位點(diǎn)插入片段長度+150bp）。上下游引物的Tm值分別為64.7℃和57.9℃，相差達(dá)到6.7℃，基本符合引物設(shè)計(jì)要求。聚合酶及其濃度TaqDNA聚合酶是從棲熱水生菌中提純的天然酶或是大腸菌合成的基因工程酶[3]。本次實(shí)驗(yàn)催化PCR反應(yīng)的酶量為0.05U/μL，如果聚合酶的濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和 PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，在 PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L（本次實(shí)驗(yàn)為 200μmol/L）。4種dNTP的濃度應(yīng)相等，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。如果4種dNTP濃度過低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，而dNTP濃度過高則會(huì)與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。模板模板的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，提取的核酸可直接作為模板用于PCR反應(yīng)。模板的量應(yīng)適中（本實(shí)驗(yàn)為0.4ng/μL），。如果模板的量過低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，而模板的量過高則會(huì)與2+Mg結(jié)合，使游2+離的Mg濃度降低。另外，模板純化程度過低會(huì)產(chǎn)生非目的擴(kuò)增產(chǎn)物。5.2+Mg2+2+Mg濃度對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在PCR反應(yīng)中，Mg濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。（二） PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時(shí)間設(shè)置基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性、退火、延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸。1）變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93～94℃1min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。2）退火溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個(gè)核苷酸，（G+C）含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。3）延伸溫度與時(shí)間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：70～80℃1