利用CRISPR研究基因組“暗物質(zhì)”的論文

Word-4-利用CRISPR研究基因組“暗物質(zhì)”的論文超過98%的人類基因組由非編碼基因組成。這些非編碼基因被稱為基因組的“暗物質(zhì)”，它們能調(diào)控編碼基因的表達，從而影響人類健康和疾病進程。自從人類基因組序列被公開發(fā)表以來，科學(xué)家們努力解析基因中的功能元件，包括非編碼調(diào)整區(qū)——參加轉(zhuǎn)錄調(diào)整的順式調(diào)整區(qū)和非編碼RNA（ncRNA）。轉(zhuǎn)錄因子在整個基因組中可能有數(shù)百至數(shù)千個結(jié)合位點，因此討論起來特別簡單。目前常用的兩種討論轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達位點的方法是：1，耗時且簡單的增加子討論；2，在非自然?狀態(tài)中克隆增加子或啟動子序列，開展并行討論。最近Sanjana等人和Fulco等人的討論都指出，可以利用CRISPR技術(shù)在自然?狀態(tài)里討論非編碼調(diào)控元件的功能。

大規(guī)模的生化試驗使人們發(fā)覺了由潛在的、被數(shù)百種蛋白靶向結(jié)合的調(diào)整序列。值得一提的是，識別脫氧核糖核酸酶I超敏感位點（deoxyribonucleaseIhypersensitivesite，DHS）和大規(guī)模染色質(zhì)免疫沉淀測序（chromatinimmunoprecipitation–sequencing，ChIPseq）方法的提出，讓科學(xué)家們能夠全面地解析蛋白與染色質(zhì)結(jié)合的狀況。然而，把這些分子和功能調(diào)控聯(lián)系起來特別困難。

由于使用不同的CRISPR載體可以無偏向性地敲除蛋白編碼基因，因此CRISPR篩選是討論非編碼基因功能的有力工具。與人類細胞中NGG（前間區(qū)序列鄰近基序）序列上游的基因序列同源的'單引導(dǎo)RNA（singleguideRNA，sgRNA）可以引導(dǎo)CRISPR系統(tǒng)到達特定基因組位點，從而特異性地引起突變。首個CRISPR“敲除”篩選討論在基因組規(guī)模上誘導(dǎo)了全基因敲除，并克服了RNA干擾篩選中的諸多限制，例如脫靶效應(yīng)和敲除不完全（圖：CRISPR-Cas9篩選方法）。

Sanjana等人使用CRISPR工具來討論黑色素瘤細胞中調(diào)控vemurafenib（B-Raf蛋白V600E突變中，600位點的纈氨酸被谷氨酸所替代，而Vemurafenib抑制攜帶了V600E突變的B-Raf蛋白中的絲氨酸–蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域）抗性的序列。討論人員使用CRISPR工具靶向主要的抗性調(diào)整區(qū)域——NF1（neurofibromatosistype1，神經(jīng)纖維瘤病1型基因）、NF2（neurofibromatosistype2，神經(jīng)纖維瘤病2型基因）和CUL3（cullin3，泛素連接酶3）。該方法中，向?qū)NA和反式激活crRNA（trans-activatingcrRNA）融合，引導(dǎo)來源于釀膿鏈球菌的Cas9（spCas9）在目標位點處誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，從而產(chǎn)生突變。結(jié)果顯示，靶向CUL3的sgRNA在轉(zhuǎn)錄起始點最為富集。sgRNA富集的區(qū)域，CUL3被敲除，這表明，CUL3好像與染色體相互作用、組蛋白翻譯后修飾，以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點阻斷的調(diào)控區(qū)域相關(guān)。

Fulco等人利用CRISPR干擾系統(tǒng)，即利用失活的Cas9和KRAB蛋白融合，緘默靶向序列的表達。這種方法雖然實現(xiàn)了靶向性的基因緘默，但并未引起基因突變。討論者們設(shè)計的靶向序列圍繞在MYC和GATA1基因四周（這兩個基因能調(diào)控K562紅白血病細胞的增殖）。他們首先使用病毒感染細胞，將CRISPRi系統(tǒng)載帶進入細胞，然后使用多西環(huán)素誘導(dǎo)dCas9靶向目標序列。他們發(fā)覺，sgRNA富集點恰好和包含多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的DHS重合。更好玩的是，dCas9靶向GATA1或組蛋白脫乙酰酶6（HDAC6）增加子時，都會削減HDAC6表達。這表明，對于共同的增加子（GATA1和HDAC6存在共同的增加子），基因之間存在競爭關(guān)系。鑒定出來的MYC增加子的位置與轉(zhuǎn)錄起始位點、CCCTC-結(jié)合因子（CTCF，介導(dǎo)染色質(zhì)相互作用）結(jié)合位點都是吻合的。這可能是MYC調(diào)控細胞增殖的機制。

雖然CRISPR-spCas9和CRISPRi篩選方法都勝利識別了非編碼調(diào)整元件，但CRISPRi只能用于轉(zhuǎn)錄抑制，鑒于不同基因之間的轉(zhuǎn)錄抑制是不同的，CRISPR不肯定能適用于其它基因的轉(zhuǎn)錄抑制。但總的來說，這兩項討論都證明白CRISPR在討論非編碼調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上的潛力。此外，討論已經(jīng)證明，雖然非編碼基因的突變只能造成微小的基因表達變化，但可以造成大的表型變化，這意味著CRISPR篩選也可以推廣到其它疾病的表型測定上。盡管全基因組關(guān)聯(lián)討論已經(jīng)鑒定出致病的生殖細胞突變，但是系統(tǒng)性討論致病的體細胞突變中的非編碼調(diào)控元件突變也具有重要意義。例如，討論表明，一