細胞生物學實驗

細胞生物學實驗細胞生物學實驗細胞生物學實驗V:1.0精細整理，僅供參考細胞生物學實驗日期：20xx年X月實驗室規(guī)則和要求一般規(guī)定上課第一天請先熟悉環(huán)境，牢記“安全”是進行任何實驗最重要的事項。在實驗室內(nèi)請穿著實驗衣（最好長及膝蓋下），避免穿著涼鞋、拖鞋（腳趾不要裸露）。留有長發(fā)者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危險或污染實驗。在實驗室內(nèi)禁止吸煙、吃東西、飲食、化妝、嚼口香糖、嬉戲奔跑，食物飲料勿存放于實驗室的冰箱中，實驗桌上勿堆放書包、書籍、衣服外套及雜物等。所有實驗儀器、耗材、藥品等均屬實驗室所有，不得攜出實驗室外。每組分配之儀器、耗材請在課程開始前確定清點與保管，課程結(jié)束后如數(shù)清點繳回。公用儀器請善加愛惜使用。實驗前后，請把工作區(qū)域清理擦拭，并隨時保持環(huán)境清潔。實驗前詳閱實驗內(nèi)容，了解實驗細節(jié)的原理及操作，注意上課所告知的注意事項。實驗進行中有任何狀況或疑問，隨時發(fā)問，切勿私自變更實驗程序。打翻任何藥品試劑及器皿時，請隨即清理。實驗后，適切記下自己的結(jié)果，嚴禁抄襲，確實關閉不用之電源、水、酒精燈及瓦斯等。身體不適、睡眠不足、精神不濟或注意力無法集中，請立即停止實驗。實驗時間若延長，請注意時間的管制及自身的安全，不可自行逗留實驗室。實驗完畢，請清理實驗室、倒垃圾、滅菌、關閉燈光及冷氣，離開實驗室前記得洗手。任何意外事件應立即報告教師或?qū)嶒炇夜芾砣藛T，并應熟知相關之應變措施。藥品使用任何藥品，請先看清楚標示說明、注意事項，翻閱物質(zhì)安全資料，查明是否對人體造成傷害，使用完畢請放回原位。新配制的試劑請清楚注明內(nèi)容物、濃度、注意事項及配制日期，為避免污染，勿將未用完的藥劑倒回容器內(nèi)。揮發(fā)性、腐蝕性、有毒溶劑（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、鹽酸、硫酸、-巰基乙醇、甲醛、酚等）要在排煙柜中戴手套量取配制，取用完應隨即蓋好蓋子，若不小心打翻試劑，馬上處理。有毒、致癌藥劑例如丙稀酰胺（神經(jīng)毒）、溴化乙啶（突變劑）、SDS（粉塵）請戴手套及口罩取用，并勿到處污染，脫下手套后，養(yǎng)成洗手的好習慣。使用后的實驗試劑和材料，應放在專用的收集桶內(nèi)。固體培養(yǎng)基、瓊脂糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。使用刻度吸管取物時，切勿用嘴吸取，請用自動吸管或吸耳球。

儀器使用儀器前先了解其性能、配備及正確操作方法，零件及附件嚴禁拆卸，勿私自調(diào)整，并注意插座電壓（110V或220V）之類別。使用離心機時，離心管要兩兩對稱、重量平衡，離心機未停下不得打開蓋子。冷凍離心機于開機狀態(tài)時，務必蓋緊蓋子，以保持離心槽之低溫并避免結(jié)霜。電源供應器有高電壓，切勿觸摸電極或電泳槽內(nèi)溶液，手濕切勿開啟電源。使用微波爐加熱，不可有鋁箔等金屬物品，瓶蓋必須松開，以免爆炸。加熱后戴防熱手套取出瓶子，務必輕搖晃，確認不會突沸。水浴鍋、干燥器等，使用前熟悉操作手續(xù)，嚴防燙傷。操作臺上有酒精等有機溶劑及易燃物（如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等）要遠離火苗，不可留置火焰燃燒，萬一著火，應力持鎮(zhèn)定，沉著處理。酒精或乙醚等著火時，應使用泡沫滅火劑或濕毛巾覆蓋，勿使用水沖潑。實驗完畢后需清理實驗臺，除需收回共用物品外，不留任何器皿。傾倒的試劑、水漬應擦干凈，保證實驗臺和實驗前同樣清潔。值日組協(xié)助實驗室管理人員收回共用物品，清潔儀器，清理實驗臺，打掃實驗室。

第一部分基礎實驗實驗1顯微技術(shù)概述實驗目的：使學生了解基本的細胞生物學實驗操作，熟悉常規(guī)和常用的實驗方法。鍛煉學生動手能力，增強學生基本科研技能和科研思路；了解目前常用細胞生物學研究方法。任務：細胞生物學作為高校生命科學的主干課程之一，從本質(zhì)上講是一門實驗科學，因此設置實驗課程十分重要，學生可以通過這一教學環(huán)節(jié)掌握細胞生物學的基本研究手段和方法，并更深入理解理論課的各方面內(nèi)容。進一步講，細胞是生物構(gòu)成的基本單位，是理解一切生命現(xiàn)象的基礎，許多細胞生物學實驗方法也用于遺傳學，分子生物學，生物化學等科學實驗研究，在將來的各項工作中將會有廣泛的實際用途。培養(yǎng)目標：使學生掌握細胞生物學實驗技術(shù)，提高學生分析問題和解決問題的能力，為了今后獨立進行科研工作打下堅實的基礎。實驗2細胞膜的滲透性一、實驗目的了解細胞膜的滲透性質(zhì)及各種物質(zhì)跨膜進入細胞的不同速度二、實驗原理將紅細胞放入數(shù)種等滲溶液中，由于紅細胞對各種溶質(zhì)的滲透性不同，有的溶質(zhì)可以滲入，有的溶質(zhì)則不能滲入；滲入的溶質(zhì)能夠提高紅細胞膜的滲透壓，所以水分進入細胞引起溶血。由于溶質(zhì)滲入速度不同，因此溶血的時間也不相同。三、實驗器材與試劑器材：50ml小燒杯，10ml移液管，試管（1～10ml），試管架。試劑：0.17mol/L氯化鈉，0.17mol/L氯化銨，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸鈉，0.12mol/L草酸銨，0.12mol/L硫酸鈉，0.32mol/L葡萄糖，0.32mol/L甘油，0.32mol/L乙醇，0.32mol/L丙酮。實驗材料：動物血液（如羊血）四、實驗步驟1、羊血細胞懸浮液取50ml小燒杯一只，加一份羊血和10份0.17mol/L氯化鈉溶液，形成一種不透明的紅色溶液，即稀釋的羊血。2、低滲溶液取試管一只，加入5ml蒸餾水，再加0.5ml稀釋的羊血，注意觀察溶液顏色變化，由不透明的紅色逐漸澄清，說明紅細胞發(fā)生破裂造成溶血，全部紅細胞溶血后光線比較容易透過溶液。3、羊紅細胞滲透性（1）取試管一支，加入0.17mol/L氯化鈉溶液5ml，再加入0.5ml稀釋的羊血，輕輕搖動，觀察顏色變化及溶血現(xiàn)象，說明原因。（2）取試管一支，加入0.17mol/L氯化銨溶液5ml，再加入0.5ml稀釋的羊血，輕輕搖動，觀察顏色變化及溶血現(xiàn)象，說明原因。（3）另外8種等滲溶液進行同上實驗記錄實驗結(jié)果并簡單分析表1不同低滲溶液中紅細胞溶血現(xiàn)象溶液種類溶血與否時間結(jié)果分析0.17mol/L氯化鈉0.17mol/L氯化銨0.17mol/L醋酸胺0.17mol/L硝酸鈉0.12mol/L草酸銨0.12mol/L硫酸鈉0.32mol/L葡萄糖0.32mol/L甘油0.32mol/L乙醇0.32mol/L丙酮五、注意事項（或?qū)嶒炋貏e提示）六、實驗報告結(jié)果與討論思考題實驗3細胞器線粒體的分離與觀察一、實驗目的用差速離心法分離動、植物細胞線粒體二、實驗原理線粒體是真核細胞特有的，司能量轉(zhuǎn)換的重要細胞器。細胞種的能源物質(zhì)——糖、脂肪、部分氨基酸在此進行最終的氧化，并通過偶聯(lián)磷酸華生成ATP，供給細胞生理活動之需。對線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的研究通常是在離體線粒體上進行的。制備線粒體用組織勻漿在懸浮介質(zhì)中進行差速離心的方法。在一給定的離心場中（對于所使用的離心機，就是選用一定的轉(zhuǎn)速），球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心某一時間內(nèi)，組織勻降中的各種細胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器中最先沉降的是細胞核，其次是線粒體，其他更輕的細胞器和大分子可依次再分離。懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性，在pH7.2的條件下，亞細胞組分不容易重新聚集，有利于分離。整個操作過程應注意樣品保持4，避免酶失活。線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。詹納斯綠B（janusgreenB）是對線粒體專一的活細胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引而堆積在線粒體膜上。線粒體的細胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。本實驗介紹大鼠（動物）肝臟和玉米（植物）線粒體的分離。三、實驗器材與試劑四、實驗步驟大鼠肝臟線粒體的分離實驗用品材料：大鼠肝臟試劑：生理鹽水1％詹納斯綠B染液，生理鹽水配制蔗糖－Tris鹽酸緩沖液（pH7.4）0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/LTris-鹽酸緩沖液（pH7.4）0.1mol/LTris10ml0.1mol/L鹽酸8.4ml加重蒸水到100ml加蔗糖到0.25mol/L。蔗糖為密度梯度離心用D(+)蔗糖0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/LTris-鹽酸緩沖液（pH7.4）配制如上，加蔗糖到0.34mol/L。固定液：甲醇－冰醋酸（9：1）Giemsa染液：Giemsa粉0.5g，甘油33ml。先往Giemsa粉中加少量甘油在研缽內(nèi)，研磨至無顆粒，再將剩余甘油倒入混勻，56左右保溫2h，令其充分溶解，最后加甲醇混勻，成為Giemsa原液，保存于棕色瓶中。用時吸出少量用1/15mol/L磷酸緩沖液作10～20倍稀釋。1/15mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）：1/15mol/LKH2PO450ml1/15mol/LNa2HPO450ml器材高速離心機，解剖刀剪，小燒杯，冰浴盤，漏斗，尼龍織物，玻璃均漿器。實驗方法制備大鼠肝細胞勻漿。實驗前大鼠空腹12h，擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱取肝組織1g，剪碎，用預冷到0～4°C的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后在0~4°C條件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿，蔗糖溶液分數(shù)次添加，勻漿用雙層尼龍織物過濾備用。注意盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時間，整個分離過程不宜過長，以保持組分生理活性。差速離心先將9ml0.34mol/L緩沖蔗糖溶液放入離心管，然后沿管壁小心的加入9ml肝勻漿使其覆蓋在上層。用冷凍控溫高速離心機按照圖1順序進行差速離心。鼠肝勻漿700鼠肝勻漿700g，離心10min沉淀上清洗滌（可省略）10ml預冷的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液，2次，每次1000g，離心15min。沉淀I細胞核及質(zhì)膜碎片上清合并10000g，離心10min沉淀洗滌（可省略）加10ml預冷的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液，1000g，15min。沉淀II（線粒體）圖1差速離心順序圖分離物鑒定細胞核：取細胞核沉淀一滴涂片，在甲醇－冰醋酸溶液中固定15min，充分吹干，滴Giemsa染液（原液10～20倍稀釋）染色10分鐘。自來水沖洗，吹干，鏡檢。觀察結(jié)果。線粒體：取線粒體沉淀涂片，注意勿太濃密，不待干即滴加1％詹納斯綠B染液染色20min，蓋上蓋玻片鏡檢。觀察結(jié)果。玉米線粒體的分離從植物細胞中分離線粒體，除了做線粒體功能測定之外，在植物細胞遺傳工程中，常用于分離核外基因——線粒體DNA等目的。分離線粒體的方法仍采用均勻介質(zhì)中的差速離心法。介質(zhì)中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二價陽離子，Ca2+除去后細胞間粘著解體，促使組織分散成單個細胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在細胞外面，并作為競爭性底物削弱蛋白酶的作用。實驗用品材料玉米黃化幼苗（水稻、高梁等幼苗均可）試劑分離介質(zhì)：0.25mol/L蔗糖，50mmol/LTris-鹽酸緩沖液（pH7.4），3mmol/LEDTA，0.75mg/mlBSA。50mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液（pH7.4）配法：50ml0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與42ml0.1mol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml。保存液：0.3mol/L甘露醇（pH7.4）20％次氯酸鈉（NaClO）溶液1％詹納斯綠B染液，生理鹽水配制。器材溫箱，冰箱，紗布，瓷研缽，冷凍控溫高速離心機實驗方法玉米種子用20％次氯酸鈉溶液浸泡10min消毒，清水沖洗30min，再浸泡清水15h。將種子平鋪在放有濕紗布的盤內(nèi)，保持溫度，置溫箱28于暗處培育2～3d。待芽長到1～2cm長時剪下約5g，放0～41h。加3倍體積分離介質(zhì)，在瓷研缽內(nèi)快速研磨成勻漿。用多層紗布過濾，濾液經(jīng)700g離心10min。除去核和雜質(zhì)沉淀。取上清液10000g離心10min，沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一次。沉淀為線粒體，可存于0.3mol/L甘露醇中。注意以上勻漿及離心均控制在0~4進行。取線粒體沉淀涂片在清潔載玻片上，不待干即滴加1％詹納斯綠B染色20min，鏡下觀察，線粒體為藍綠色圓形顆粒。五、注意事項（或?qū)嶒炋貏e提示）六、實驗報告結(jié)果與討論思考題實驗4RNA的細胞化學（Brachet反應）一、實驗目的了解Brachet反應原理，掌握有關的操作方法。二、實驗原理甲基綠—派洛寧（methylgreen-pyronin）為堿性染料，它分別能與細胞內(nèi)的DNA、RNA結(jié)合呈現(xiàn)不同顏色。當甲基綠與派洛寧作為混合染料時，甲基綠與染色質(zhì)中DNA選擇性結(jié)合顯示綠色或藍色；派洛寧與核仁、細胞質(zhì)中的RNA選擇性結(jié)合顯示紅色。其原因可能是兩種染料的混合染液中有競爭作用，同時兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的DNA結(jié)合呈現(xiàn)綠色。而派洛寧則與聚合程度較低的RNA結(jié)合呈現(xiàn)紅色（但解聚的DNA也能和派洛寧結(jié)合呈現(xiàn)紅色）。即RNA對派洛寧親和力大，被染成紅色，而DNA對甲基綠親和力大，被染成綠色。三、實驗器材與試劑儀器、用具：顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、吸水紙。材料：洋蔥鱗莖內(nèi)表皮。試劑：Unna試劑：甲基綠－派洛寧染色液甲液：5％派洛寧水溶液6ml2％甲基綠水溶液6ml蒸餾水16ml乙液：1mol/L乙酸緩沖液（pH4.8）16ml甲液與乙液分別置于4冰箱備用，使用時兩溶液混勻即可。1mol/L乙酸緩沖液（pH4.8）配方：A液：冰醋酸6ml加蒸餾水至100ml。B液：乙酸鈉13.5g加蒸餾水至100ml。取A液40ml＋B液60ml混勻即為pH4.8乙酸緩沖液。四、實驗步驟用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊，置于載玻片上。滴一滴Unna試劑，染色30min。蒸餾水洗兩次，吸水紙吸去多余水分。蓋上蓋玻片，鏡檢。五、注意事項（或?qū)嶒炋貏e提示）CK對照：撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，經(jīng)5％三氯乙酸90水浴處理15min。再經(jīng)70％乙醇洗片刻，然后按照步驟（1）～（4）制片觀察。六、實驗報告結(jié)果與討論思考題實驗5DNA的細胞化學（Feulgen反應）一、實驗目的了解Feulgen反應的原理，掌握有關的操作方法。二、實驗原理DNA是由許多單核苷酸聚合成的多核甘酸，每個單核苷酸又由磷酸、脫氧核糖和堿基構(gòu)成。DNA經(jīng)1mol/L鹽酸水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的雙鍵打開，使脫氧核糖的第一碳原子上形成游離的醛基，這些醛基與Schiff試劑反應。Schiff試劑是堿性品紅和偏重亞硫酸鈉作用，形成無色的品紅液，當無色品紅與醛基結(jié)合則形成紫紅色的化合物。因此凡是有DNA的地方，都能顯示紫紅色。紫紅色的產(chǎn)生，是由于反應產(chǎn)物的分子內(nèi)含有醌基，醌基是一個發(fā)色基團，所以具有顏色。材料不經(jīng)過水解或預先用熱的三氯醋酸或DNA酶處理，得到的反應是陰性的，從而證明了Feulgen反應的專一性。三、實驗器材與試劑儀器、用具：顯微鏡，恒溫水浴箱、溫度計、解剖針、酒精燈、試管、燒杯、載玻片、蓋玻片、吸水紙。材料：洋蔥鱗莖。試劑：1mol/L鹽酸的配制：取82.5ml密度1.19g/ml的濃鹽酸加蒸餾水至1000ml。Schiff試劑的配制和保存：稱取0.5g堿性品紅加入到100ml煮沸的蒸餾水中（用三角燒瓶），時時振蕩，繼續(xù)煮5min（勿使其沸騰），使之充分溶解。然后冷卻至50℃時用濾紙過濾，濾液中就加入10ml1mol/LHCl，冷卻至25℃時，加入0.5gNa2S2O5（偏重亞硫酸鈉），充分振蕩后，塞緊瓶塞，在室溫暗處靜置至少24h（有時需2～3d），使其顏色退至淡黃色，然后加入0.5g活性炭，用力振蕩1min，最后用粗濾紙過濾于棕色瓶中，封嚴瓶塞，外包黑紙。濾液應為無色無沉淀，貯于4℃冰箱中備用。如有白色沉淀，就不能再使用，如顏色變紅，可加入少許偏重亞硫酸鈉或鉀，使之再轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色時，仍可使用。亞硫酸水：取200ml自來水，加入10ml10％偏重亞硫酸鈉（或鉀）水溶液和10ml1mol/LHCl，三者于使用前混勻。四、實驗步驟將洋蔥鱗莖內(nèi)表皮放在1mol/LHCl中，加熱到60℃水解8～10min。蒸餾水水洗。Schiff試劑遮光染色30min。用新鮮配制的亞硫酸水溶液洗3次，每次1min。水洗5min。顯微鏡觀察。細胞中有DNA的部位應呈現(xiàn)紫紅色陽性反應。五、注意事項（或?qū)嶒炋貏e提示）CK對照：另取同樣材料一份，不經(jīng)1mol/LHCl水解，直接在Schiff試劑中染色，然后按照步驟（4）～（6）制片觀察。六、實驗報告結(jié)果與討論思考題實驗6考馬斯亮藍R250（CoomassieblueR250）染色法觀察細胞骨架一、實驗目的掌握動植物細胞內(nèi)微絲的染色方法。二、實驗原理真核細胞質(zhì)中有錯綜復雜的纖維網(wǎng)，稱為細胞骨架（cytoskeleton）。根據(jù)纖維的直徑分為微絲（microfilament,MF,7nm）、微管（microtubule,MT,25nm）、中間纖維（intermediatedfilament,IF,10nm）。此外，還散布著一些比微絲還細的纖維（3～6nm）。目前觀察細胞骨架的主要手段有電鏡、間接免疫熒光技術(shù)、酶標、組織化學等。微絲是肌動蛋白構(gòu)成的纖維，稱為F-actin。單根微絲直徑約7nm，在光學顯微鏡下看不到。本實驗觀察到的是由微絲平行排列組成的纖維束，在動物細胞里稱為“應力纖維”（stressfiber）應力纖維在體外培養(yǎng)的貼壁細胞中尤為發(fā)達。一般當細胞充分鋪展時，經(jīng)考馬斯亮藍R250染色，可看到沿細胞長軸伸展的粗大纖維束，即應力纖維。應力纖維上還周期性地分布著微絲結(jié)合蛋白，包括-輔肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、類肌鈣蛋白等。應力纖維的端部連接著質(zhì)膜上的粘著斑，與加強細胞對基質(zhì)的附著、鋪展及維持細胞特定形狀有關?？捡R斯亮藍R250可以染各種蛋白，并非特異染色微絲，實驗中用1％TritonX－100抽提掉胞質(zhì)中除骨架蛋白外的其他蛋白，能清晰地顯示微絲束。三、實驗器材與試劑四、實驗步驟考馬斯亮藍R-250染動物細胞微絲儀器光學顯微鏡、溫箱、細胞培養(yǎng)設備材料平皿，直徑30mm小染缸，載波片，蓋玻片條（剪掉一角以區(qū)別細胞正反面）。體外培養(yǎng)的貼壁生長的HeLa細胞試劑細胞培養(yǎng)基（DMEM、RPMI－1640等），磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH7.4），0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.3），M－緩沖液，1％TritonX-100（用M－緩沖液配制），0.2%考馬斯亮藍R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制）。實驗步驟細胞培養(yǎng)在平皿中的蓋玻片上，尚未致密時即可使用。取出蓋玻片，用PBS洗3次。用1％TritonX-100處理25～30min，室溫或37度均可。立即用M-緩沖液輕輕洗細胞3次。略晾干后，用3.0%戊二醛固定細胞5～15min。PBS洗數(shù)次，濾紙吸干。用0.2%考馬斯亮藍R250染色1小時，然后用水小心沖洗，蒸餾水沖洗，空氣中略干燥。普通光學顯微鏡下用40×物鏡或油鏡觀察?？捡R斯亮藍R-250染植物細胞微絲實驗步驟：取洋蔥鱗莖表皮，大小約1cm2，放入盛有0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（6.8）的小燒杯中。吸去緩沖液，用1％TritonX-100處理洋蔥表皮20～30min。除去TritonX-100，用M-緩沖液充分洗3次，每次約10min。加3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制，pH6.8）固定0.5~1h。用PBS洗3次，濾紙吸去殘液。0.2%考馬斯亮藍R250染色30min。蒸餾水洗數(shù)遍。將樣品置于載玻片上，加蓋玻片，光學顯微鏡下觀察。五、注意事項（或?qū)嶒炋貏e提示）六、實驗報告結(jié)果與討論思考題實驗7動物細胞傳代培養(yǎng)與觀察實驗一、實驗目的熟練掌握細胞的傳代培養(yǎng)法。二、實驗原理傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一。也是幾乎所有細胞生物學實驗的基礎。當細胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續(xù)生長。這一過程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細胞供實驗所需。傳代要在嚴格的無菌條件下進行，每一步都需要認真仔細的無菌操作。三、實驗器材與試劑材料：培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75％酒精棉球，酒精燈，培養(yǎng)細胞。藥品：培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶。儀器：C02培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺。四、實驗步驟1．人進入無菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒雙手。2．倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置37℃下預熱。3．超凈臺臺面應整潔，用0.1％新潔爾滅溶液擦凈。4．打開超凈臺的紫外燈照射臺面20min左右，關閉超凈臺的紫外燈，打開抽風機清潔空氣，除去臭氧。5．點燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。6．將培養(yǎng)用液瓶口用75％酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。7．倒掉培養(yǎng)細胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2—3mLHanks液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一下。8．每個大培養(yǎng)瓶加入1mL胰酶，小瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當細胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細胞提早脫落入消化液中。9．加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復吹打消化好的細胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7～10mL／大瓶，3～5mL／小瓶)制成細胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。10．對懸浮培養(yǎng)細胞，步驟7-9不做。可將細胞懸液進行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。五、注意事項（或?qū)嶒炋貏e提示）1．傳代培養(yǎng)時要注意無菌操作并防止細胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進行一種細胞的操作。每一種細胞使用一套器材。培養(yǎng)用液應嚴格分開。2．每天觀察細胞形態(tài)，掌握好細胞是否健康的標準：健康細胞的形態(tài)飽滿，折旋光性好，生長致密時即可傳代。3．如發(fā)現(xiàn)細胞有污染跡象，應立即采取措施，一般應棄置污染的細胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BSS或培養(yǎng)基反復清洗，隨后培養(yǎng)基中加入較大量的抗菌素，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基等。六、實驗報告1、結(jié)果與討論2、思考題第二部分綜合實驗實驗8MTT法檢測化學藥物對體外培養(yǎng)細胞增殖及存活的影響一、實驗目的了解掌握MTA法的基本原理及基本過程。二、實驗原理測試藥物對細胞增殖的影響，對細胞的殺傷作用，一般采用集落形成法，生長曲線法等。這些方法作用量大，費時對于處理大量樣品和受試對象，則更為繁瑣。1983年，T.Mosmann結(jié)合微空培養(yǎng)方法，利用細胞對tetrazolium(簡稱MTT)的還原作用，建立了比色檢測法。經(jīng)過以后的改進，特別是M.C.Alley(1988)的研究，逐漸成熟，稱為MicrocultureTetrazoliumAssay，簡稱MTA。該法快速、簡便、使用面廣。