微生物在藥學(xué)中的應(yīng)用

第一節(jié)抗生素的概念與分類(lèi)一、抗生素的概念抗生素：由某些微生物在生活過(guò)程中產(chǎn)生的，對(duì)某些其他病原微生物具有抑制或殺滅作用的一類(lèi)化學(xué)物質(zhì)青霉菌——青霉素（弗萊明）；灰色鏈絲菌——鏈霉素由于最初發(fā)現(xiàn)的一些抗生素主要對(duì)細(xì)菌有殺滅作用，所以一度將抗生素稱(chēng)為抗菌素陸續(xù)出現(xiàn)了抗病毒、抗衣原體、抗支原體，甚至抗腫瘤的抗生素現(xiàn)代抗生素的定義：由某些微生物產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)，能抑制微生物和其他細(xì)胞增殖第一頁(yè)，共九十五頁(yè)。醫(yī)用抗生素的特點(diǎn)差異毒力大對(duì)作用對(duì)象與對(duì)機(jī)體的毒性之間的差異越大越好由作用機(jī)制決定生物活性強(qiáng)、有不同的抗菌譜生物活性用MIC來(lái)表示，其值越小表示作用越強(qiáng)能抑制或殺滅的微生物范圍稱(chēng)為抑菌譜，有廣譜和窄譜之分第二頁(yè)，共九十五頁(yè)。第三頁(yè)，共九十五頁(yè)。二、抗生素的分類(lèi)根據(jù)產(chǎn)生來(lái)源分細(xì)菌產(chǎn)：少，有多粘菌素、短桿菌肽等放線(xiàn)菌產(chǎn)：多，鏈霉素更主要真菌產(chǎn)：青霉素，頭孢霉素等動(dòng)物植物產(chǎn)：地衣素，蒜素，魚(yú)素等根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分Beta-內(nèi)酰胺環(huán)類(lèi)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)氨基糖苷類(lèi)四環(huán)素類(lèi)多肽類(lèi)第四頁(yè)，共九十五頁(yè)。第二節(jié)抗生素產(chǎn)生菌的

分離與篩選目前，新抗生素的獲得大致有如下途徑：1.從自然界分離并篩選新抗生素產(chǎn)生菌。近年來(lái)，為了擴(kuò)大篩選的來(lái)源，已從土壤微生物擴(kuò)展到海洋微生物，從一般常見(jiàn)微生物擴(kuò)展到極端微生物，又從微生物擴(kuò)展到植物、海洋生物等。2.改造現(xiàn)有的已知抗生素的產(chǎn)生菌，再經(jīng)篩選獲得新抗生素產(chǎn)生菌。3.從已知的抗生素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，經(jīng)篩選后獲得新的半合成抗生素。第五頁(yè)，共九十五頁(yè)。4.采用新的篩選方法，如培養(yǎng)超敏細(xì)菌以尋找微量的新抗生素，選用新的腫瘤模型，如用鼠肉瘤病毒M（MSV.M）、鳥(niǎo)類(lèi)粒白細(xì)胞血病病毒等來(lái)篩選抗腫瘤抗生素。5.采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)新抗生素。絕大多數(shù)抗生素的原始產(chǎn)生菌是從自然界分離篩選而得，因此，下面以傳統(tǒng)的分離土壤放線(xiàn)菌為例，簡(jiǎn)單說(shuō)明新抗生素產(chǎn)生菌的常規(guī)分離和篩選過(guò)程。第六頁(yè)，共九十五頁(yè)。

一.土壤微生物的分離1.采土2.分離菌株二.篩選所謂篩選是指從大量待篩選放線(xiàn)菌中，盡快地鑒別出極少數(shù)有實(shí)用價(jià)值的抗生素產(chǎn)生菌的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。在新抗生素產(chǎn)生菌的篩選中，應(yīng)根據(jù)篩選目的選擇合適的篩選模型和方法。1.篩選模型篩選模型是指篩選工作中所使用的試驗(yàn)菌。2.篩選方法抗菌抗生素一般采用瓊脂擴(kuò)散法。

第七頁(yè)，共九十五頁(yè)。三.早期鑒別1.抗生素產(chǎn)生菌的鑒別2.抗生素的鑒別四.分離精制五.臨床前試驗(yàn)研究六.臨床試驗(yàn)第八頁(yè)，共九十五頁(yè)。第三節(jié)抗生素的制備

一.發(fā)酵階段（一）現(xiàn)代膽色素發(fā)酵的一般特點(diǎn)1.需氧發(fā)酵2.深層發(fā)酵3.純種發(fā)酵

第九頁(yè)，共九十五頁(yè)。

（二）一般生產(chǎn)流程

1.孢子制備

2.種子制備3.發(fā)酵

（1）無(wú)菌操作（2）營(yíng)養(yǎng)需要（3）PH（4）溫度（5）前體（6）通氣、攪拌及消沫（7）發(fā)酵終點(diǎn)判斷第十頁(yè)，共九十五頁(yè)。二.發(fā)酵液預(yù)處理及提取階段（一）發(fā)酵液預(yù)處理（二）提取常用的提取法主要有以下幾類(lèi)。1.容媒萃取法2.離子交換法3.沉淀法4.吸附法第十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。第十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。援助古巴可拆卸式中試發(fā)酵車(chē)間

第十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。大連翔大科技股份有限公司中試及大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵車(chē)間

第十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。山東勝利股份有限公司生物工程技術(shù)中心生物農(nóng)藥中試發(fā)酵車(chē)間

第十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。華中農(nóng)大中試發(fā)酵車(chē)間

第十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。內(nèi)蒙古華蒙金河生物技術(shù)有限公司(飼料用抗生素——金霉素，西部開(kāi)發(fā)項(xiàng)目)

第十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。上海聯(lián)合賽爾生物工程公司國(guó)家一類(lèi)新藥霍亂疫苗發(fā)酵生產(chǎn)車(chē)間

第十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。第四節(jié)抗生素的生物合成機(jī)制一.次級(jí)代謝產(chǎn)物的概念所謂次級(jí)代謝產(chǎn)物（secondarymetabalites）是指那些由微生物合成的，但對(duì)微生物的生長(zhǎng)、繁殖無(wú)明顯功能的各種代謝產(chǎn)物，如抗生素等。次級(jí)產(chǎn)物有以下幾個(gè)特點(diǎn)。1.對(duì)微生物的生長(zhǎng)、繁殖無(wú)明顯功能。2.與初級(jí)代謝產(chǎn)物緊密相聯(lián)。3.在一定條件下能大量合成。

第十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。二、抗生素生物合成的代謝途徑大致步驟：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)—?初級(jí)代謝中間物—?前體—?修飾重排—合成途徑—?抗生素有關(guān)代謝途徑脂肪酸代謝氨基酸代謝嘌呤嘧啶代謝糖代謝芳香族合成一碳甲基庫(kù)第二十頁(yè)，共九十五頁(yè)。三、青霉素的生物合成及調(diào)控6-APA第二十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。生物合成的調(diào)控賴(lài)氨酸的反饋抑制糖分解產(chǎn)物的阻抑作用葡萄糖分解產(chǎn)物?抑制?；D(zhuǎn)移酶?抑制青霉素合成乳糖不抑制，但成本高生產(chǎn)中用滴加或間隙補(bǔ)加以維持低濃度糖第二十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。第五節(jié)抗生素的主要作用機(jī)制第二十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。第二十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。1、抑制細(xì)胞壁的合成青霉素類(lèi)抑制細(xì)胞壁肽聚糖的交叉連結(jié)→細(xì)胞壁缺損→水分內(nèi)滲→細(xì)菌膨脹變形→細(xì)菌破裂、溶解。環(huán)絲氨酸：抑制五肽的形成萬(wàn)古霉素和桿菌肽：前者阻斷二糖五肽與胞壁受體結(jié)合；后者影響內(nèi)脂循環(huán)Bata內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素：抑制合成交聯(lián)中所需的轉(zhuǎn)肽酶反應(yīng)，使不能形成三維結(jié)構(gòu)第二十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。2、影響胞漿膜通透性多粘菌素與細(xì)胞膜內(nèi)磷酯結(jié)合→細(xì)胞膜通透性↑→細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)外漏→細(xì)菌死亡。制霉素、二性霉素B：與真菌細(xì)胞膜麥角固醇結(jié)合→形成孔道→細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)外漏→真菌死亡。第二十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。3、抑制蛋白質(zhì)合成氨基甙類(lèi)：〔1〕抑核蛋白體70S始動(dòng)復(fù)合物的生成〔2〕與核蛋白體30S的P10蛋白結(jié)合→翻譯錯(cuò)誤。〔3〕阻止釋放因子與核糖體結(jié)合抑制蛋白質(zhì)的釋放抗菌藥不影響人蛋白質(zhì)的合成因人與細(xì)菌的核蛋白體不同。細(xì)菌：70S（原核細(xì)胞）30S50S人：80S（真核細(xì)胞）40S60S第二十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。4、影響核酸代謝利福平：抑制依賴(lài)于DNA的RNA多聚酶，從而抑制的mRNA合成氟喹諾酮類(lèi)：抑制DNA螺旋酶→抑制DNA復(fù)制與mRNA的轉(zhuǎn)錄。第二十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。5、抗葉酸代謝磺胺類(lèi)抑制二氫葉酸合成酶，TMP（甲氧芐啶）抑制二氫葉酸還原酶，從而抑制DNA、RNA的合成。第二十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。第六節(jié)抗藥性一、基本概念最小抑菌濃度固有性抗藥獲得性抗藥多重抗藥性交叉抗藥性賴(lài)藥性第三十頁(yè)，共九十五頁(yè)。二、產(chǎn)生的遺傳學(xué)機(jī)制自發(fā)突變，藥物選擇壓力抗藥基因轉(zhuǎn)移第三十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。三、產(chǎn)生的生物化學(xué)機(jī)制1．產(chǎn)生滅活酶（1）水解酶：b—內(nèi)酰胺酶水解青霉素或頭孢菌素的b－內(nèi)酰胺環(huán)。（2）鈍化酶：催化某些基團(tuán)結(jié)合到抗生素的OH、NH2上

，使之失去抗菌活性，如G－桿菌對(duì)氨基甙類(lèi)耐藥。第三十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。2、改變靶位結(jié)構(gòu)〔1〕藥物與靶位親和力↓：如β－內(nèi)酰胺類(lèi)與PBPS結(jié)合↓。〔2〕靶位結(jié)構(gòu)改變：

①耐甲氧西林的金葡菌產(chǎn)生PBP2，（MRSA）

②鏈霉素：P10蛋白改變

③利福平：RNA多聚酶β亞基的改變第三十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。3、降低外膜通透性細(xì)菌細(xì)胞膜存在特異通道與非特異通道，當(dāng)通道的通透性↓→耐藥。（1）細(xì)菌孔道蛋白質(zhì)組成、數(shù)目、功能改變：如G－桿菌對(duì)氨基甙類(lèi)耐藥。（2）產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)堵塞孔道：如細(xì)菌對(duì)四環(huán)素耐藥。第三十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。4．通過(guò)主動(dòng)泵出系統(tǒng)清除藥物細(xì)菌：大腸桿菌、金葡菌、表葡菌、銅綠假單孢菌、空腸彎曲菌等?？咕帲核沫h(huán)素、氟喹諾酮類(lèi)、氯霉素、β-內(nèi)酰胺類(lèi)等通過(guò)主動(dòng)泵出而耐藥。第三十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。第三十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。5.其它代謝拮抗物↑：如對(duì)磺胺類(lèi)耐藥的細(xì)菌產(chǎn)生大量的PABA。第三十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。耐藥性產(chǎn)生的人為原因（1）濫用（2）局部用（3）劑量不足（4）單獨(dú)用（5）長(zhǎng)期用第三十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。四、對(duì)細(xì)菌耐藥性的對(duì)策合理使用抗菌藥1、應(yīng)用抗菌藥要有嚴(yán)格指征2、足量用藥、療程要適當(dāng)3、治療慢性病要聯(lián)合用藥4、不要局部用藥研制新藥加強(qiáng)耐藥機(jī)制研究第三十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。第七節(jié)抗生素的效價(jià)、單位和效價(jià)測(cè)定一、抗生素的效價(jià)和單位效價(jià)：相同條件下檢品與標(biāo)準(zhǔn)品的抗菌活性之比值效價(jià)=檢品抗菌活性

標(biāo)準(zhǔn)品抗菌活性×100%第四十頁(yè)，共九十五頁(yè)。單位

衡量有效成分的具體尺度，可以各不相同重量單位：抗菌活性部分的重量，非全部鹽類(lèi)成分。如鏈霉素硫酸鹽、土霉素鹽酸鹽、新生霉素鈉（鉀）鹽類(lèi)似重量單位：全部鹽類(lèi)成分。如純金霉素鹽酸鹽、四環(huán)素鹽酸鹽等，1微克＝1單位重量折算單位：青霉素，以抑制50毫升的金葡菌者為1單位，相當(dāng)于純品0.5988微克，則1毫克＝1670單位特定單位：特定批次樣品的某一重量為一單位。如某批桿菌肽1mg=55單位，制霉菌素1mg=3000單位第四十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。標(biāo)準(zhǔn)品：與商品同質(zhì)，純度較高的抗生素，每毫克含一定單位，可作效價(jià)測(cè)定之標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際單位：經(jīng)國(guó)際協(xié)議，每毫克含一定單位的標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，其單位稱(chēng)國(guó)際單位。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品由WHO的生物檢定專(zhuān)家委員會(huì)主持，由英國(guó)國(guó)立生物標(biāo)準(zhǔn)檢定所組織標(biāo)定、保管、分發(fā)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示量：標(biāo)簽上的標(biāo)示量原則上以重量表示，成分不清（如制霉菌素），或照顧用藥習(xí)慣（青霉素），仍沿用單位表示第四十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。二、抗生素效價(jià)的微生物學(xué)測(cè)定法抗生素效價(jià)的生物測(cè)定有稀釋法、比濁法、擴(kuò)散法三大類(lèi)。管碟法是擴(kuò)散法中的一種，本法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基的擴(kuò)散滲透作用，將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液與未知濃度的樣品溶液在含有敏感性試驗(yàn)菌的瓊脂表面進(jìn)行擴(kuò)散滲透，比較兩者對(duì)被試菌的抑菌作用，求出抑菌圈的大小，以測(cè)定抗生素的濃度。在一定范圍內(nèi)，濃度與抑菌圈直徑在雙周半對(duì)數(shù)表上（濃度為對(duì)數(shù)值，抑菌圈直徑為數(shù)字值）成直線(xiàn)函數(shù)的關(guān)系，由此繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，從樣品的抑菌圈大小可在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求得其效價(jià)。由于本法是利用抗生素抑制敏感細(xì)菌的特點(diǎn)，所以符合臨床使用的實(shí)際情況，而且靈敏度也很高，不需特殊設(shè)備，故一般實(shí)驗(yàn)室及生產(chǎn)上多采用此法。但此法也有缺點(diǎn)，即操作步驟多，手續(xù)繁雜，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、得出結(jié)果慢。盡管如此，由于它有上述的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)而被世界各國(guó)所公認(rèn)，成為國(guó)際通用的方法被列入各國(guó)藥典法規(guī)的范圍內(nèi)。第四十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。測(cè)定方法：一劑量法二劑量法三劑量法影響因素第四十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。第十八章微生物在其他藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用第四十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。第一節(jié)維生素一、維生素C化學(xué)合成法——萊氏法，國(guó)外用生物合成——二步發(fā)酵法，中國(guó)用1、D-葡萄糖——D-山梨醇——L-山梨糖：弱氧化醋桿菌2、L-山梨糖——2-KLG：大小菌第四十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。第四十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。二、維生素B2棉病囊霉：4000～8000毫克/升阿舒假囊酵母：4000毫克/升三、維生素B12肝臟提取化學(xué)合成丙酸桿菌成本太高，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)第四十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。第二節(jié)氨基酸谷氨酸發(fā)酵我國(guó)的菌株：北京棒狀桿菌；鈍齒棒狀桿菌生物素：過(guò)少，菌不長(zhǎng)；過(guò)多則為乳酸發(fā)酵氧：充足時(shí)谷氨酸發(fā)酵；不足時(shí)乳酸發(fā)酵NH4+：適量時(shí)谷氨酸發(fā)酵；不足時(shí)生成a-酮戊二酸；過(guò)量時(shí)生成谷氨酰氨pH中性和偏堿性時(shí)生成谷氨酸；酸性時(shí)生成乙酰谷氨酰氨第四十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。2、賴(lài)氨酸高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷兼抗性突變株賴(lài)氨酸天冬氨酸激酶第五十頁(yè)，共九十五頁(yè)。第三節(jié)酶及酶抑制劑酶：有催化作用的蛋白質(zhì)，新陳代謝必不可少的催化劑酶的用途治療疾病診斷試劑生物工具酶第五十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。一、酶制劑臨床上較常用的微生物酶鏈激酶、鏈道酶：心血管病治療。鏈球菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶：治心肌梗死。從動(dòng)物血漿及動(dòng)物毒液中提取天冬氨酰胺酶：治療白血病、腫瘤。許多菌均可青霉素酶：含青霉素制劑的無(wú)菌檢測(cè)工業(yè)上較常用的微生物酶：青霉素?；阜纸馇嗝顾?，得到6-氨基青霉烷酸(6–APA)，是半合成青霉素的母核第五十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。二、酶抑制劑為具有生物活性的小分子化合物中和抑制或競(jìng)爭(zhēng)抑制某些酶的活性調(diào)節(jié)代謝活動(dòng)：防病、治病如鏈霉產(chǎn)生的泛誕菌素，抑制淀粉酶，防止肥胖癥、糖尿病等第五十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。第四節(jié)甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化甾體化合物具有機(jī)體調(diào)節(jié)作用，可用于治?。耗I上腺皮質(zhì)激素治療或緩解膠原性疾病、過(guò)敏性休克性激素：治療性器官功能衰退與某些婦科疾病乳腺癌、前列腺癌的輔助治療藥物口服避孕藥的主要成分第五十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。微生物轉(zhuǎn)化載體化合物的反應(yīng)類(lèi)型羥化反應(yīng)第五十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。2、環(huán)氧化反應(yīng)第五十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。3、脫氫反應(yīng)第五十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。4、側(cè)鏈的降解？第五十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。微生物生產(chǎn)甾體化合物的方法：?jiǎn)蜗喟l(fā)酵法雙相發(fā)酵法固定化酶法轉(zhuǎn)化者培養(yǎng)好的微生物分離后的菌懸液固定化酶或細(xì)胞提取底物菌體與培養(yǎng)液菌體與液體過(guò)柱液優(yōu)缺點(diǎn)發(fā)酵易、提取難發(fā)酵繁、提取易發(fā)酵繁、提取易第五十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。第五節(jié)其他微生物制劑核酸類(lèi)藥物生物堿微生態(tài)制劑螺旋藻基因工程產(chǎn)品第六十頁(yè)，共九十五頁(yè)。第六十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。微生物與藥物變質(zhì)第六十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。藥物中微生物的來(lái)源1.空氣細(xì)菌、霉菌、酵母菌無(wú)菌操作區(qū)－每1000升空氣中<10個(gè)細(xì)菌。2.水3.其它原料、容器、設(shè)備、操作人員、包裝材料。第六十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。微生物引起的藥物變質(zhì)1.藥物變質(zhì)的判斷（1）有病原微生物存在（2）存在微生物的毒性代謝產(chǎn)物（3）產(chǎn)品發(fā)生可被覺(jué)察的物理或化學(xué)變化（4）口服及外用藥物的微生物總數(shù)超標(biāo)（5）無(wú)菌制劑中發(fā)現(xiàn)有微生物存在第六十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。2.藥物變質(zhì)的結(jié)果（1）變質(zhì)的藥品引起感染（2）藥物理化性質(zhì)的改變引起藥物失效（3）藥物中的微生物產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物第六十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。3.影響藥物變質(zhì)的因素污染量營(yíng)養(yǎng)因素含水量pH值儲(chǔ)藏溫度第六十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。防止微生物污染藥物的措施1.加強(qiáng)藥品生產(chǎn)管理（GoodManufacturingPractice)交叉污染容器貼錯(cuò)標(biāo)簽2.進(jìn)行微生物學(xué)檢驗(yàn)3.使用合格的防腐劑第六十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。藥物的體外抗菌試驗(yàn)用于抗菌藥物的篩選提取過(guò)程中的追蹤抗菌譜的測(cè)定藥物含量的測(cè)定藥物血濃度測(cè)定藥物敏感試驗(yàn)等包括抑菌試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn)兩者并非絕對(duì)第六十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。體外抑菌試驗(yàn)一、連續(xù)稀釋法

可用于測(cè)定藥物的最低抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration)和最低殺菌濃度（minimalbactericidalconcentration).第六十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。一、連續(xù)稀釋法21.液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法2.固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法——平板法可同時(shí)測(cè)定大批量試驗(yàn)菌株的MIC，且不受藥物顏色及混濁度的影響。第七十頁(yè)，共九十五頁(yè)。第七十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。MIC檢測(cè)方法1.藥液稀釋?zhuān)簩?duì)倍稀釋法共14管，12管為空白對(duì)照（不加菌液），13管為陽(yáng)性對(duì)照（不加藥物）。14管為稀釋劑或助溶劑對(duì)照（濃度與1管相同）。2.加入菌液0.1毫升（1000～100000個(gè)細(xì)菌），搖勻。3.培養(yǎng)：37度，16～24小時(shí)。4.MIC的確定：試驗(yàn)管呈現(xiàn)澄明的最低藥物濃度即為MIC。第七十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。二、瓊脂擴(kuò)散法1.濾紙片法新藥的初篩及臨床的藥敏試驗(yàn)2.打孔法藥物血濃度的檢測(cè)3.挖溝法一種藥物對(duì)幾種試驗(yàn)菌的抗菌作用第七十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。體外殺菌試驗(yàn)最低殺菌濃度（MBC）也可稱(chēng)之為最低致死濃度（MLC)。取MIC終點(diǎn)以上未長(zhǎng)菌的各管培養(yǎng)液，分別移種于另一無(wú)菌平板上，培養(yǎng)后平板上無(wú)菌生長(zhǎng)（或少于5個(gè)菌落）的藥物最低濃度為該藥的MBC（或MLC）。第七十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。聯(lián)合抗菌試驗(yàn)兩種抗菌藥物、藥物與不同pH、藥物與不同離子溶液的相互影響。1.協(xié)同－加強(qiáng)作用2.拮抗－減弱作用3.無(wú)關(guān)－相互無(wú)影響4.累加－作用為二者之和第七十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。一、紙條試驗(yàn)在已接種試驗(yàn)菌的平板表面垂直放置兩條各浸有一種藥液的濾紙條，培養(yǎng)后根據(jù)抑菌區(qū)的加強(qiáng)、減弱或無(wú)影響來(lái)判斷它們?cè)诼?lián)合應(yīng)用時(shí)的效應(yīng)。第七十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。二、棋盤(pán)格法A藥各稀釋度按縱行定量加入各管。B藥各稀釋度按橫排定量加入各管。加入定量菌液，經(jīng)培養(yǎng)后觀(guān)察結(jié)果。兩藥同時(shí)檢測(cè)單獨(dú)MIC。FIC（A）＝A藥與B藥聯(lián)合試驗(yàn)時(shí)A藥的MICA藥單獨(dú)試驗(yàn)時(shí)的MICFIC為部分抑菌濃度第七十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。FIC（B）＝B藥與A藥聯(lián)合試驗(yàn)時(shí)B藥的MICB藥單獨(dú)試驗(yàn)時(shí)的MICFIC指數(shù)＝FIC(A)+FIC(B)

<0.75－協(xié)同1－累加1～2－無(wú)關(guān)

>2－拮抗第七十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。體外抗菌試驗(yàn)的影響因素1.試驗(yàn)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株臨床新分離菌株2.培養(yǎng)基3.抗菌藥物濃度稀釋4.對(duì)照試驗(yàn)（1）試驗(yàn)菌對(duì)照（2）已知藥物對(duì)照（3）溶劑及稀釋液對(duì)照第七十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。藥物制劑的微生物學(xué)檢查一、無(wú)菌制劑的無(wú)菌檢查各種注射劑（針劑、輸液）手術(shù)及眼科制劑都必須無(wú)活的微生物。1.無(wú)菌檢查的基本原則采用嚴(yán)格的無(wú)菌操作方法，將被檢藥品置不同培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，觀(guān)察有無(wú)微生物生長(zhǎng)，以判斷被檢藥品是否合格。第八十頁(yè)，共九十五頁(yè)。2.無(wú)菌檢查抽樣（1）百分?jǐn)?shù)抽樣法：每批的2％～5％（2）固定抽樣法：2～203.培養(yǎng)基及培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)無(wú)菌試驗(yàn)靈敏度試驗(yàn)：用已知不同菌株做生長(zhǎng)試驗(yàn)來(lái)監(jiān)控。菌種有：藤黃八疊球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。第八十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。4.陽(yáng)性對(duì)照菌及抑細(xì)菌抑真菌試驗(yàn)（1）陽(yáng)性對(duì)照菌液是為供試品做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)使用的。其目的是檢查陽(yáng)性菌在加入供試品的培養(yǎng)基中能否生長(zhǎng)，以驗(yàn)證供試品有無(wú)抑菌活性物質(zhì)和試驗(yàn)條件是否符合要求。（2）抑細(xì)菌抑真菌試驗(yàn)：加供試品的培養(yǎng)管與未加供試品的培養(yǎng)管比較，以判斷供試品有無(wú)抑菌作用。（如有抑菌作用可加入滅活劑或用薄膜過(guò)濾法檢測(cè)）第八十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。5.檢查法（1）直接接種法：適用于非抗菌作用的供試品。（2）薄膜過(guò)濾法：適用于有抗菌作用的或大容量的供試品。第八十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。特殊藥品的無(wú)菌檢查法油類(lèi)藥物的無(wú)菌檢查供試品中加入1％～3％聚山梨酸80（吐溫80），其作用是使油類(lèi)藥物均勻分散，便于檢出微生物。

第八十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定第八十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。口服藥及外用藥的微生物學(xué)檢查需要限制性控制微生物的數(shù)量和種類(lèi)。1.細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)低于規(guī)定限量（細(xì)菌總數(shù)1克或1毫升不超過(guò)10～104CFU,真菌數(shù)1克或1毫升不超過(guò)10～103CFU)。2.口服藥物不得檢出大腸埃希菌、沙門(mén)菌。3.外用藥不得檢出銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、破傷風(fēng)梭菌。4.不得檢出活螨（含糖的劑型應(yīng)重點(diǎn)檢查）。第八十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。平板菌落計(jì)數(shù)法限制條件1.菌落形成單位（colonyformingunits,CFU）為計(jì)數(shù)單位。一個(gè)菌落就是一個(gè)菌落形成單位，它可以由一個(gè)也可以由多個(gè)菌細(xì)胞形成。2.受特定培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件限制普通培養(yǎng)基，需氧或兼性厭氧，30～35度，48小時(shí)。3.有繁殖能力的菌細(xì)胞才能被認(rèn)定“活菌”。第八十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。平板菌落計(jì)數(shù)法方法1.試驗(yàn)前的準(zhǔn)備2.供試品取樣、供試液的制備（10毫升或10克加入稀釋劑成1：10供試液）3.供試液的稀釋?zhuān)?0倍遞增稀釋法）1:10，1:102,1:103三級(jí)4.注平皿（每級(jí)1毫升＋15毫升培養(yǎng)基）5.培養(yǎng)：30～35℃，48小時(shí)6.菌落數(shù)（30～300）乘以稀釋倍數(shù)為結(jié)果7.不合格應(yīng)復(fù)試第八十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)測(cè)定平板菌落計(jì)數(shù)法（霉菌和酵母菌培養(yǎng)特性）1.用