大分子技術課件

生物大分子的分離、純化、鑒定、定量技術

總論常用生物大分子的分離純化技術特殊要求的分離純化方法

生化與分子生物學生化與分子生物學的研究對象：生物內(nèi)的分子生化：所有生物體內(nèi)的分子，包括糖類、脂類、蛋白質、核酸、有機小分子等代謝與調(diào)控

分子生物學：最初是生物大分子，即蛋白質、核酸,現(xiàn)也是所有細胞內(nèi)的分子,是生物化學的高級階段,基因水平分子醫(yī)學分子遺傳學分子免疫學分子病理學分子藥理學分子毒理學分子檢驗學分子腫瘤學……分子生物學已成為工具性學科，已滲透到生命科學領域包括醫(yī)學的每一分支學科中,從這點講它已不是獨立的學科.諾貝爾獎近百年的歷史，在91項生理學或醫(yī)學獎中有31項與生化與分子生物學有較密切的關系，而化學獎中則有34項相關；尤其是20世紀五十年代以來，52％的生理或醫(yī)學獎和40％的化學獎屬于生化與分子生物學領域，二者之和相當于另外設立了一個生化與分子生物學諾貝爾獎。生化技術與分子生物學技術生物化學技術------分子的分離純化鑒定定量包括分光、層析、電泳、離心、超濾等分子生物學技術------基因、分子水平的系列操作，把生化、微生物免疫等技術相結合形成系統(tǒng)，包括PCR技術、基因克隆表達技術、分子雜交印跡、單克隆抗體技術、RNAi技術、基因敲除、基因診斷與基因治療、芯片技術、mRNA差異顯示技術等

1.電泳技術2.層析技術3.分光技術4.離心技術5.超濾技術一、大分子分離純化常用生化技術特點：與化學產(chǎn)品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點：⑴生物材料的組成極其復雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。⑶許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境時就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、pH值、離子強度等各種影響因素對溶液中各種組成的綜合影響，很難準確估計和判斷。

二、生物大分子分離純化的操作（二）基因組DNA制備1、破碎、裂解細胞（胍、SDS等）2、除蛋白、組織碎片：離心、飽和酚或酚氯仿抽提3、除RNA：RNase（不含DNase或50oC處理）4、除鹽等小分子：乙醇沉淀，12000rpm以上離心5、進一步純化，除痕量蛋白等雜質：蛋白酶K、酚氯仿抽提、柱層析，密度梯度超離心注意1、機械切力：人基因組100Kb，噬菌體50Kb。2、DNase：需要二價陽離子，EDTA螯合二價陽離子3、溫度：45oC以上

DNase失活，冰浴操作，或50oC左右處理。4、乙醇沉淀不能除高濃度的EDTA，用作PCR模板的DNA溶液如含高濃度的EDTA，使Taq酶活性抑制，需要透析或層析除去。5、液氮中充分研磨，對防止DNase降解效果較好1.2.完整的真核DNA3.DNA4.DNA+HindIII5.完整的真核DNA6.酶解的DNA7.DNA+HindIII1234567注意：防RNaseRNasin，專一抑制劑（蛋白），酚抽提可除RNasin。DEPC處理水、浸泡/1200C消毒，1800C烤器皿，胍鹽中儲存，乙醇沉淀可除去胍鹽氧釩核苷復合物（較難除去）（四）質粒載體質粒是基因組DNA以外的共軛閉環(huán)雙鏈小分子DNA，常用基因工程載體特點：自我復制松弛型——高拷貝嚴謹型——低拷貝具有抗性標志和插入失活標志多酶位點不相容性123452為質粒，可見2種構型，3為單酶切質粒，4為雙酶切質粒，1、5為MARKER構型：超螺旋線狀開環(huán)12345操作1．將過夜培養(yǎng)的2ml細菌（測序用質粒抽提請用5ml細胞），高速離心1分鐘，徹底去除上清。2．加入100μlSolutionI，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌。注意：對于低拷貝數(shù)的質粒，請用5ml細胞；質粒如果用于全自動熒光測序分析，請用5ml細胞，無需提高SolutionI，Ⅱ和Ⅲ的用量。3．加入200μlSolutionⅡ，立即上下顛倒或用手指彈管底，使細菌裂解，室溫放置（2分鐘左右）至溶液變成澄清。4．加入400μlSolutionⅡ，立即上下顛倒5—10次，使之充分中和，室溫放置2分鐘。注意：步驟2和3在冰上操作效果更佳。5．高速離心，12,000轉/分鐘，10分鐘。無需低溫離心。注意：提高離心速度，使沉淀更加緊密，步驟6[實驗操作]取上清更為方便。6．取出2ml樣品收集管和3S柱，在管壁標上樣品號，將步驟5中的上清全部轉移到（吸或倒入）3S柱子里。蓋上離心管蓋子（蓋子也可以不蓋，但是如果您同時有很多樣品，擔心混淆或弄翻溶液，建議您蓋上蓋子），室溫放置2分鐘（室溫放置時間不重要，可長可短）；用臺式離心機室溫高速（12,000轉/分鐘）離心1分鐘。注意：轉移上清時不要吸取沉淀，否則會出現(xiàn)染色體DNA和蛋白質污染。離心管蓋子蓋上時，柱子內(nèi)壓的增加，可能會使部分溶液從柱子底部流出，為正?，F(xiàn)象。7．取下3S柱，棄去掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一支收集管中，吸取500μlWashSolution到3S柱，高速離心1分鐘。8．重復步驟7—次。9．取下3S柱，棄去掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一支收集管中，高速離心2分鐘。10．將3S柱放入干凈的1.5ml的離心管中，在3S柱子膜中央加50μlTE或水，不要蓋上離心管蓋，室溫下放置2分鐘；蓋上離心管蓋，室溫高速離心1分鐘。注意：將TE或水預熱到50℃可以提高洗脫效率。測序用質粒用30μl預熱的水洗脫，濃度一般滿足國內(nèi)測序要求。11．洗脫的質粒可以立即用于各種分子生物學操作或-20℃保存?zhèn)溆谩?ml過夜培養(yǎng)細胞，質粒如果用50μl水洗脫，通常情況下可取10μl洗脫液做瓊脂糖(Agarose)電泳或酶切分析。（五）特殊要求的核酸分子分離純化方法分離特定長度的DNA如獲得目的基因、分離探針、PCR產(chǎn)物回收、酶切后的克隆載體特殊分離1、電泳洗脫法高分辨，普通瓊脂糖有雜質，用高純度或低熔點

電泳挖孔法瓊脂糖，或膠回收試劑盒2、密度梯度離心法：常用介質有甘油、蔗糖、氯化銫（昂貴），密度梯度儀不同長度DNA停留在離心管不同高度經(jīng)密度梯度離心，樣品純度極高3、旋轉柱層析：Sephadex-G50：去除很短核酸片段和dNTP,純化探針各種提取、濃縮、分子量截留試劑盒4、試劑盒二、生物大分子的鑒定和定量

（一）紫外分光法鑒定定量原理：在260nm下，核酸（DNA、RNA）有最大吸收，這是由它們含有的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共扼雙鍵系統(tǒng)的特性所決定的。通常每毫升1微克的DNA鈉鹽溶液的光密度為0.020，每毫升1微克的RNA鈉鹽溶液的光密度為0.025，所以核酸濃度與光密度值有以下關系：dsDNA（ug/ml）=OD260*50ssDNA（ug/ml）=OD260*37RNA（ug/ml）=OD260*40OD260、/OD280在1.8~2.2內(nèi)核酸樣品比較純?？偭康亩俊㈣b別方法

DNARNAPROTEIN化學法二苯胺法苔黑酚法雙縮脲法、Folin酚、

染色、凱氏定氮（不需純化）物理法UV260UV260UV280

電泳法電泳法電泳法分子生物學技術在分子病理、證的實質、分子藥理研究中的應用

1、蛋白質是生命的主要物質基礎，是生命運動的具體執(zhí)行者。蛋白質（酶）合成的調(diào)節(jié)是生理調(diào)節(jié)中最基本的調(diào)節(jié)。蛋白質結構和功能的缺陷，與很多疾病密切相關核酸、蛋白質與生理功能的關系神經(jīng)內(nèi)分泌旁分泌免疫DNARNAPr（酶）細胞代謝（化學變化）

生理功能變化病、證異常（1）細胞水平調(diào)節(jié)——調(diào)節(jié)有重要功能的蛋白質RNA轉錄逆轉錄翻譯蛋白質復制DNA復制別構調(diào)節(jié)結構調(diào)節(jié)（單個分子活性調(diào)節(jié)）——（分子對接）化學修飾數(shù)量調(diào)節(jié)合成——基因表達調(diào)控

轉錄是關鍵調(diào)控點，決定何時表達、表達多少

翻譯是表達終結果降解——基因表達調(diào)控（降解酶）功能蛋白（2）激素水平——激素的合成、分泌、與激素受體結合、調(diào)節(jié)靶細胞內(nèi)蛋白活性及基因表達調(diào)控內(nèi)分泌細胞激素靶細胞激素受體（3）神經(jīng)水平——遞質的合成、分泌、與受體結合、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌或效應器細胞內(nèi)活性及基因表達調(diào)控神經(jīng)元神經(jīng)遞質內(nèi)分泌細胞效應器細胞受體神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡信號傳遞蛋白質點：某相關蛋白縱向：信號傳遞到靶蛋白橫向：基因群的表達調(diào)控、基因表達譜\蛋白質組代謝生理功能基因表達調(diào)控的調(diào)節(jié)物正常生理性代謝調(diào)節(jié)物——生化分子生物學致病因素——分子病理、證的實質藥物因素：化學藥、生物藥、中藥及復方——分子藥理2、生物藥物種鑒定、分類、育種DNA多態(tài)性分析，rRNA間隔區(qū)長度分析，DNA測序3、制備昂貴的中藥成分或去除有害成分如馬兜鈴酸麝香多肽、秋水仙酰胺、青蒿酸達爾文終結者基因植入微生物的方式理論上可以生產(chǎn)任何種類的化合物。常用分子生物學技術一、PCR技術——DNA片段擴增技術

1.基因診斷、分子病理（醫(yī)）臨床用于檢測傳染病的病染體、遺傳病的變異基因、腫瘤的癌基因與抗癌基因、測定某疾病相關基因表達水平等2.物種鑒定、分子藥理（藥）中藥學上應用隨機引物PCR（DNA指紋法、DNA多態(tài)性分析）rRNA間隔區(qū)長度法分析進行昂貴地道藥材的鑒定研究藥物對疾病相關基因表達的影響（RT-PCR)PCR擴增原理——試管中的半保留復制5’5’3’3’變性、退火、延伸變性、退火、延伸變性、退火、延伸RT-PCRmRNA逆轉錄為cDNA以cDNA為模板進行目標片段的擴增第一步，獲得模板——待檢測對象的細胞內(nèi)核酸（DNA、RNA）二、基因克隆技術（重組DNA技術）

醫(yī)藥領域的應用：1、基因工程制藥和疫苗（干擾素、胰島素、免疫因子、生長因子抗菌肽、凝血因子、秋水仙酰胺、蛇毒、青蒿酸等，乙肝疫苗、甲流疫苗等）2、基因治療腫瘤：抗癌基因、自殺基因、免疫因子、血管生長抑制因子等

逆轉錄酶切酶切加接頭酶切酶切切連接接轉化、轉導或轉染轉篩選選（1）基因組DNA/RNA（2）載體DNA（3）合成或PCR擴增載體DNA提第一步，分離提純帶有目的基因的基因組DNA、RNA或重組載體，以及提純表達目的基因所需要的載體克隆的載體一）質粒/粘粒（COS）質粒——染色體外共價閉環(huán)雙鏈小分子DNA特點：1.自我復制能力

2.松弛型——高拷貝嚴謹型——低拷貝

3、抗性標記

4、插入失活二）噬菌體、三）病毒三、分子雜交與印跡技術

（一）分子雜交DNA或RNA的單鏈分子之間如果存在一定程度的堿基互補配對關系，一定條件下就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈變性退火雜化雙鏈雜化雙鏈變性退火（二）雜交印漬技術Dot/slotblottingSouthernblottingNorthernblottingWesternblotting電泳分離+特異分子顯示（探針雜交、Ag-Ab反應）可用于特異DNA、RNA、蛋白質的定性定量檢測凝膠電泳使核酸單鏈轉移到硝酸纖維素膜（NC）毛細管作用電轉移真空吸引與標記探針進行雜交或抗原抗體反應顯色或暴光目標顯出區(qū)帶，定量提純1.Dot/slotblot

特異DNA、RNA、Pr分子通過與標記探針雜交或標記抗體結合而顯示出來，再定量省略了電泳、印跡轉膜非特異的結合對結果影響大，定量不夠精確2.Southernblot1.基因組DNA的結構分析;2.特異基因的突變分析應用：探針標記技術用同位素、生物素、地高辛或熒光染料標記末端或全鏈。3.RNA印漬技術

（Northernblot)

原理同Southernblot，但不需要酶切可直接進行變性電泳、印跡轉移。

可用RT-Southernblot取代應用：檢測特異基因表達水平。NorthernblotRNA變性凝膠電泳使RNA轉移到硝酸纖維素膜（NC）毛細管作用電轉移真空吸引與標記探針進行雜交放射自顯影顯出雜交區(qū)帶RNA提純RT-Southernblot

可取代Northernblot（4）蛋白質的印漬分析

蛋白質變性電泳轉移到NC膜上加入抗體加入標記的二抗顯示區(qū)帶檢測分析免疫印跡（Westernblot)提取總蛋白質DOT/SLOTBLOT直接點膜雜交與印跡結合SOUTHERNBLOTDNA電泳與印跡雜交結合

NORTHERNBLOT

RNA電泳與印跡雜交結合WESTERNBLOT蛋白質電泳與印跡免疫化學結合

特異大分子的定量、鑒別方法反向dotblotting——芯片技術全數(shù)或系列探針（基因芯片）/抗體（蛋白芯片）點陣同一標記樣品與之雜交/抗原-抗體反應優(yōu)點：1.可同時檢測很多種大分子的變化2.檢測基因表達的時空特異性3.目標分子不多、明確時用反向dotblotting比芯片便宜。特異mRNA、蛋白質定量方法的選擇研究信號傳遞、基因表達調(diào)控、基因表達譜需要對重要的功能蛋白或受體及其mRNA進行分離、純化、定量

對特異mRNA進行定量方法1mRNA原位雜交2RT-PCR3northernblot、dot/slotblot、RT-southernblot

對特異蛋白或受體進行定量方法：1)免疫組化2)生物活性檢測3）westernblot

生物大分子分離純化鑒定定量技術路線的選擇高質量的原則經(jīng)濟的原則應用舉例：1、PCR檢測PCR定性：純度要求低，允許部分降解

PCR指數(shù)放大極靈敏，要嚴防樣品交叉污染，裂解、離心，簡單的純化（胍酚或酚氯仿一步法）PCR定量：靈敏度高嚴防污染、降解、嚴防試管效應模板要求較純，較完整需提取純化：

SOUTHERNBLOT

NORTHERNBLOT（DOTBLOT）

WESTERNBLOT要防降解，純度、完整性要求低于RT-PCR，過程長、靈敏度低，可靠性高，結果較客觀RT-PCR定量特定mRNA：靈敏度高，可靠性低嚴防污染、降解、試管效應

RNA要求較純，較完整不需純化：

DNA原位雜交

RNA原位雜交

免疫組化、

防降解易，不能定量（除活性測定）技術可靠性高結果主觀性強可空間定位2、特定分子的定量四、基因表達的干預1.反義核酸技術用反義DNA、反義脫氧寡核苷酸、反