固定化酶在醫(yī)療應用共17張課件-2

固定化酶在醫(yī)療應用56、極端的法規(guī)，就是極端的不公?！魅_57、法律一旦成為人們的需要，人們就不再配享受自由了。——畢達哥拉斯58、法律規(guī)定的懲罰不是為了私人的利益，而是為了公共的利益；一部分靠有害的強制，一部分靠榜樣的效力?！窭闲闼?9、假如沒有法律他們會更快樂的話，那么法律作為一件無用之物自己就會消滅?！蹇?0、人民的幸福是至高無個的法?！魅_固定化酶在醫(yī)療應用固定化酶在醫(yī)療應用56、極端的法規(guī)，就是極端的不公?！魅_57、法律一旦成為人們的需要，人們就不再配享受自由了。——畢達哥拉斯58、法律規(guī)定的懲罰不是為了私人的利益，而是為了公共的利益；一部分靠有害的強制，一部分靠榜樣的效力。——格老秀斯59、假如沒有法律他們會更快樂的話，那么法律作為一件無用之物自己就會消滅?！蹇?0、人民的幸福是至高無個的法?！魅_固定化酶在醫(yī)療中的應用應化0701李洋酶是一類具有催化功能的蛋白質(zhì),和化學催化劑相比具有反應速度快,化學、立體和分子部位選擇性好,反應條件溫和,底物專一性強,可在水溶液和中性pH下操作等優(yōu)點,同時酶本身可以被微生物降解,符合綠色化學的要求.已在食品、醫(yī)藥、輕工和農(nóng)業(yè)等許多領(lǐng)域得到廣泛的應用,但和多相催化過程相比,酶在能源和化工中的應用還存在如下問題.(1)酶一旦從細胞中分離出來,其活性迅速下降,并且在實際應用中對外界因素非常敏感,容易因反應條件的變化和雜質(zhì)的毒化作用而失活.(2)酶的分離和純化手續(xù)繁雜,大規(guī)模制備和應用成本較高.(3)酶是溶于水的,在水溶液中進行反應,會導致酶和底物、產(chǎn)物從水中分離的困難,不利于循環(huán)使用.(4)由于反應產(chǎn)物是酶的排泄物,對酶催化反應有抑制作用,限制了產(chǎn)物濃度的提高,因此生產(chǎn)強度低.酶的固定化技術(shù)就是為了克服上述缺點,使酶催化反應能像化學催化劑一樣在多相反應過程中穩(wěn)定操作,并易于回收和反復使用而發(fā)展起來的一項酶化學與酶工程技術(shù).固定化酶在醫(yī)療應用56、極端的法規(guī)，就是極端的不公?！魅潭ɑ冈卺t(yī)療應用共17張課件_2固定化酶在醫(yī)療應用共17張課件_2固定化酶在醫(yī)療應用共17張課件_2固定化酶在醫(yī)療應用共17張課件_2藥用酶的固定化提高了其穩(wěn)定性及緩釋性、并可除去免疫原性.前列腺素衍生物是藥物在20世紀的重要發(fā)現(xiàn)之一,用大孔徑N2聚氨乙基丙烯酰胺為載體,使前列腺素合成酶固定化,合成前列腺素衍生物E1,顯示出良好的活性及貯存穩(wěn)定性.微囊固定化過氧化氫酶具有良好的酶活性及穩(wěn)定性,在臨床檢測及衛(wèi)生防疫方面具有廣泛用途.葡聚糖磁性納米微粒固定化L-天冬酰胺酶,具有通過血液注射治療急性淋巴白血病的醫(yī)用前景.超氧化物歧化酶SOD在清除機體代謝過程中產(chǎn)生的過量超氧陰離子方面也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用.下面就L-天冬酰胺酶和SOD的固定化進行拓展。藥用酶的固定化提高了其穩(wěn)定性及緩釋性、并可L-天冬酰胺酶L-天冬酰胺酶(E.C.3.5.1.1，L-asparaginase)能將腫瘤細胞生長所需的L-天冬酰胺水解為天冬氨酸和氨，影響腫瘤細胞的蛋白質(zhì)的合成，從而抑制腫瘤的生長，臨床上主要用于治療急性淋巴性白血病，其有效率為6O%左右。但直接使用游離的L-天門冬酰胺酶存在著一些缺點：存在較多的副作用，可引起急性胰腺炎、胃腸道反應、肝功能和其它代謝異常及過敏反應；游離酶穩(wěn)定性較差，易被蛋白酶水解。這些缺點限制了游離L-天冬酰胺酶的應用，固定化L-天冬酰胺酶的研究受到了較多的關(guān)注。L-天冬酰胺酶L-天冬酰胺酶(E.C.3.5.1在37℃水浴中使海藻酸鈉在蒸餾水中融化，加入一定體積的酶溶液，吸入注射器內(nèi)，逐滴滴入磁力攪拌下的2%氯化鈣溶液中，即可形成光滑的微球體。4℃下硬化2h，用去離子水洗滌。再用一定濃度的戊二醛交聯(lián)2h，然后用大量的去離子水洗滌直到無戊二醛為止(加入奈氏試劑檢測)．即得固定化酶。取0.2mI游離酶或1.5g固定化酶，加入0.8mI不同pH值(6.0～9.0)的緩沖液，再加入2.0mI的L一天冬酰胺溶液(0.04mol/mI)，測定酶活力，結(jié)果如圖1所示。在37℃水浴中使海藻酸鈉在蒸餾水中融化，加入一定從圖1中可以看出，固定化酶的最適pH值為8．5，與游離酶的最適pH值相比沒有發(fā)生偏移。影響固定化酶最適pH值的因素主要有兩個，一是擴散效應，另一個是載體帶電性質(zhì)。可能是由于采用了帶負電荷的載體，載體帶電性質(zhì)產(chǎn)生的影響和擴散效應產(chǎn)生的影響相互抵消，使得固定化酶的最適pH與游離酶相比沒有大的改變。從圖1中可以看出，固定化酶的最適pH值為8．5，與游離酶的

同理對固定化酶和游離酶的米氏常數(shù)，最適反應溫度以及半衰期進行測量比較，發(fā)現(xiàn)2者基本一致，說明酶的固定化對其活性未產(chǎn)生較大影響.同理對固定化酶和游離酶的米氏常數(shù)，最適反應溫度以及超氧化物歧化酶SOD

SOD即超氧化物歧化酶,是人體細胞代謝不可缺少的活性蛋白酶。超氧化物歧化酶是一種金屬酶。人們在研究中發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶是機體代謝所產(chǎn)生的有害物質(zhì)超氧陰離子自由基的天然清除劑。機體在代謝中產(chǎn)生的自由基以氧自由基對機體的危害最大。氧自由基包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫及單線態(tài)氧等,這些自由基是機體正常代謝產(chǎn)物,盡管它們在代謝中連續(xù)不斷的產(chǎn)生,但由于機體中存在防御系統(tǒng),所以正常情況下危害不大,其中的超氧陰離子自由基就可以被SOD清除。研究表明,SOD對人體血栓癥、動脈硬化癥、糖尿病等疾病有一定的預防和輔助治療作用,并且在抗腫瘤發(fā)生、消炎和抗衰老等領(lǐng)域也具有廣泛的應用前景。超氧化物歧化酶SODSOD即超氧化物歧化酶,SOD是一種含金屬的酶,按金屬輔基的不同可分成三種。最常見的一種含有銅鋅金屬輔基(Cu、Zn-SOD),主要存在于真核細胞的細胞質(zhì)中,也存在于高等植物的葉綠體基質(zhì)、類囊體內(nèi)以及線粒體膜間隙中。該酶純品呈藍綠色,由2條肽鏈組成,每條肽鏈含有銅、鋅原子各一個,活性中心的核心是銅;第二種含有錳原子(Mn-SOD),主要存在真核細胞的線粒體及原核細胞中,也存在于植物的葉綠體基質(zhì)和類囊體膜上(純品呈粉紅色,由4條或2條肽鏈組成);第三種是Fe-SOD,主要存在于原核細胞中,Fe-SOD在高等植物中一般僅存在綠體中(純品呈黃色或黃褐色,由2條肽鏈組成),多數(shù)情況下一個二聚體中含有一個Fe原子。

SOD是一種含金屬的酶,按金屬輔基的以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，采用固定化的方法對超氧化物歧化酶進行優(yōu)化。并采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD的活性。鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化反應，在自氧化過程中，超氧陰離子（O2-）不斷消失又不斷生成，當達到穩(wěn)態(tài)時，其濃度保持恒定，鄰苯三酚的自氧化率呈O2-濃度相性。SOD能催化O2-發(fā)生歧化反應，生成H2O2和O2，從而抑制鄰苯三酚的自氧化。樣品對鄰苯三酚的抑制程度，可反映樣品中SOD的含量。實驗測定在325nm處有色醌類的吸光度變化，反映出鄰苯三酚自氧化反應的抑制程度。O2-在水溶液中是中等強度的還原劑和弱氧化劑，它能迅速參與單電子還原反應，但也能被強氧化劑還原。當強還原劑維生素C作為終止劑加到反應體系時，便迅速與O2-反應，阻止自氧化反應的繼續(xù)進行，為同時測定多樣品爭取了時間］。經(jīng)檢測，固定化超氧化物歧化酶活力可達333U/g，酶活回收率為86.32%，均明顯高于其他同類實驗（192U/g，34%；123U/g，41%）。以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，采用固定化固定化酶在85℃高溫條件下，活力并沒有明顯下降，反而有微小上升，可能是由于高溫使固定化酶的載體更為活躍，空間位阻變小，更有利于酶與底物的結(jié)合。固定化酶在強酸、強堿條件下活性維持得更久，但在2h后也會降低至50%以下。在較強的酸堿環(huán)境下固定化酶比溶液酶穩(wěn)定，這是由于溶液酶在強酸、強堿中，酶與底物的結(jié)合位點構(gòu)象被破壞，不能有效地結(jié)合底物，表現(xiàn)為活力大幅度下降；而固定化酶由于載體的保護作用，其結(jié)合位點構(gòu)象較穩(wěn)定，受酸堿的破壞程度降低，表現(xiàn)為耐酸堿能力增強。固定化酶的Km比溶液酶稍大，顯示固定化酶與底物的親和能力稍有下降。有文獻表明，Km值的下降主要由以下因素引起：①酶分子構(gòu)象的改變；②微環(huán)境的影響；③底物在載體和溶液間存在分配效應；④擴散效應的影響。固定化酶在85℃高溫條件下，活力并沒有明顯

此外固定化酶在臨床分析中也已得到應用,如,SBA一4JD型尿素氮葡萄糖分析儀的關(guān)鍵部件,是由三種酶復合而成的固定化酶膜圈,將它裝配在過氧化氫電極上,可以通過血液或尿液中尿素的變化,檢測運動后的疲勞程度.螢火蟲熒光素酶(fire2flyluciferase)可以用來檢測三磷酸腺苷(ATP)的含量.三磷酸腺苷是所有生物能量的貯備形式,也是細胞代謝活動的能量來源,又是螢火蟲熒光素酶催化的發(fā)光反應中不可替代的專一性底物.如果保持螢火蟲熒光素中氧和酶的數(shù)量恒定,則熒光強度與ATP濃度呈正相關(guān).換言之,借助熒光素發(fā)光反應中ATP和熒光強度之間精確的數(shù)量關(guān)系,就能快速而準確地監(jiān)測生物體因生理狀態(tài)、疾病、細胞數(shù)量變動等原因?qū)е碌腁TP含量變化.因此,發(fā)展基于螢火蟲熒光素酶的生物傳感器在醫(yī)學等諸多領(lǐng)域有著現(xiàn)實的和潛在的應用前景.此外固定化酶在臨床分析中也已得到應用,如,謝謝觀看